- 本期文章
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2024,51(12):4821-4826, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.241001
Abstract:
本文简要回顾了微生物学在基础研究与应用技术领域的辉煌成就，总结了创刊50周年纪念专刊收录32篇文章的研究领域和范围，展示了其在环境、工业、医学、农业等领域的广泛应用及未来发展前景。
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2024,51(12):4827-4833, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240549
Abstract:
厌氧微生物，尤其是产甲烷古菌，广泛分布于各种缺氧环境中，它们具有丰富多样的代谢途径，在地球碳氮等重要物质循环及维持环境健康中发挥着不可或缺的作用。厌氧菌不仅是人肠道微生物组的主要成分，而且是将废物降解转化为生物能源——甲烷的驱动者。我从认识厌氧微生物，尤其是产甲烷古菌，到毕生对它们的研究，既有心得又有经验教训，愿在《微生物学通报》建刊50周年之际，分享给致力于微生物研究的青年才俊们，希望对你们有所借鉴。
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2024,51(12):4834-4841, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240518
Abstract:
改革开放政策给广大科研人员学习借鉴世界先进理论和科技创造了机会。作者和科研团队科研人员系该政策受益者和见证者。作者首先介绍了早期赴荷兰乌特勒支大学学习病毒学的先进理论和技术的经历和体会；随之又介绍了如何带领团队与荷兰科学家进一步交流合作，搭建高水平科学研究平台的历程和收获。作者和科研团队通过与荷兰科学家合作，建立了国际上首个猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)反向遗传操作平台，利用该平台进行了广泛深入的科学研究并取得丰硕成果。文章最后对PEDV研究进行了简要凝练和展望。
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2024,51(12):4842-4853, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240527
Abstract:
在人体内共生的复杂微生物群体具有重要的生理作用，与人体健康的维护和疾病的产生密切相关。近年来，包括女性上生殖道在内的既往被认为无菌的部位，也检测到了微生物的存在。这些菌群是否参与正常的人体生理过程尚不十分明确，但是特定的上生殖道菌群与众多妇产科疾病的发生发展有密不可分的关系。本文将综述女性上生殖道菌群的研究进展，及其与正常生理和女性生殖道疾病的关联。
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2024,51(12):4854-4868, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240587
Abstract:
反转录子(retron)主要是由非编码RNA和逆转录酶所组成的参与抗噬菌体防御系统的细菌遗传元件。基于retron能产生多拷贝单链DNA的特性，将其与同源重组蛋白或CRISPR/Cas蛋白相结合已经在细菌和酵母中实现高效精准的基因编辑，而不依赖于外源DNA的直接引入。Retron系统经过不同优化，可应用于突变子文库构建、分子记录仪、蛋白连续进化等多个方向。本文首先介绍了retron的结构与分子机制，重点总结了基于retron的基因编辑技术在细菌和真菌中的应用，并对其优势和限制因素进行分析。最后对基于retron的基因编辑技术的未来发展进行了展望。
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2024,51(12):4869-4883, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240544
Abstract:
酸性矿山废水中存在的微生物具有独特的特性，这些特性使其能够在极端酸性的环境中生存。本文回顾了酸性矿山废水中主要的微生物类群及其在生物冶金中的应用，概述了生物冶金的原理及国内外研究现状，并分析了生物冶金技术的未来发展前景。目前生物冶金技术已经在工业应用中有广泛的实例，但如何培育出效率更高、适应性更强的冶金微生物类群，依然是当前相关领域工作的重点和难点。
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2024,51(12):4884-4898, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240519
Abstract:
木质纤维素是可再生生物质资源的重要组成部分，其高效生物降解可以为绿色生物制造提供重要的原料保障。里氏木霉(Trichoderma reesei)是主要的纤维素酶工业生产菌株，其强大的纤维素酶生产能力对木质纤维素的水解糖化过程至关重要。在过去几十年中，研究人员对里氏木霉纤维素酶的表达与调控机制有了比较深入的了解，揭示了其酶系复杂的转录调控网络机制。本文系统综述了里氏木霉纤维素酶基因表达调控的关键环节，包括信号传导、转录调控及染色质重塑等方面的相关研究进展，并对如何通过遗传学改造提升里氏木霉纤维素酶的表达合成进行了总结和讨论。
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2024,51(12):4899-4908, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240484
Abstract:
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是一株具有50多年研究史的自主知识产权菌株，本课题组利用该菌建立了全球最高产量的甘油好氧发酵工业化技术。随着近年来对该菌研究的不断深入，发现其具有很强的抗逆性和高效的糖代谢能力，是非常有潜力的合成生物学工业底盘细胞。本文通过对C.glycerinogenes的发现过程、特点、国内外发酵甘油技术工业化，以及其在分子操作系统、信号应答和代谢工程等方面的研究进展进行论述和回顾，并对未来的发展方向进行展望，为建立起自主产权和创新的合成生物学体系提供借鉴和参考。
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2024,51(12):4909-4921, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240514
Abstract:
微生物组在工业、农业、环境、健康等多个领域有巨大的应用潜力，如何构建高效稳定的微生物组，并通过工程化将其应用至各个领域是当前研究的重点和难点。总结分析微生物组的构建策略，以促进微生物组在不同场景下的工程化应用。首先根据应用需求将微生物组的应用场景分为封闭系统、半封闭系统和开放系统，然后回顾了在3种系统中已有的微生物组构建策略，特别分析了其特点和局限，最后根据不同系统的特点，结合实际应用的经验反馈，针对性地提出了微生物组的构建策略。在封闭系统中，主要利用“自下而上”的方法合成微生物组，对微生物个体信息要求较高，对微生物组的效率要求较高；在半封闭和开放系统中，同时利用“自上而下”和“自下而上”的方法构建微生物组，对微生物组的稳定性和安全性要求较高。在不同应用场景中，构建微生物组的策略和侧重点不同，应根据实际情况选择合适的策略构建高效的微生物组。
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2024,51(12):4922-4929, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240515
Abstract:
角鲨烯藿烷环化酶(squalene-hopene cyclase, SHC)是三萜环化酶家族的重要成员之一，主要催化细胞内重要线性前体分子角鲨烯(squalene)环化生成以藿烯(hopene)为主的一系列五环三萜类化合物——藿烷类化合物(hopanoids)。该类化合物主要在原核生物中存在，在细菌中较为保守，其结构与真核细胞细胞膜的甾醇类似，是细菌细胞膜的重要组成成分，参与调控膜流动性和渗透性、胁迫应激响应和耐药性等生理过程。本文从角鲨烯藿烷环化酶及催化产物藿烷类化合物的功能、结构等方面对其最新研究进展进行了综述。
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2024,51(12):4930-4948, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240637
Abstract:
禾本科植物在自然界分布广泛，因经济价值巨大而备受关注。Epichloë属内生真菌与冷季型禾本科植物互利共生，具有严格的宿主特异性。为促进关于Epichloë属内生真菌的基础研究，本文围绕Epichloë属内生真菌严格的宿主特异性进行了总结和展望。首先，本文阐述了禾本科植物内生真菌的基本特点，通过其种传特性和遗传进化特征，引出了Epichloë属内生真菌的宿主特异性及其重要性。然后，就植物内生真菌、植物菌根真菌及植物病原真菌分别进行了介绍和比较，并介绍了宿主植物的noxA基因在共生/加害的选择中的重要性，引出了宿主特异性在这三类植物相关真菌之间可能的关联，提出了研究Epichloë属内生真菌的宿主特异性，与理解植物病原真菌和植物菌根菌的宿主特异性之间可能存在一定的共通/类似机理的观点。最后，总结了近年来组学研究的相关进展，期待这些新技术新手段在真菌宿主特异性研究、相关新基因探索方面发挥推动作用。同时也指出Epichloë属内生真菌的高效人工接种技术的开发对于宿主特异性研究的重要性，期待这些研究为今后的“内生真菌-宿主新组合”的创制发挥重要作用。
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王旭昊，廖恒毅，侯贺磊，张曼曼，杨淑晶，张艺籍，王晶晶，李秀颖，金慧娟，杨毅
2024,51(12):4949-4966, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240534
Abstract:
烯烃是一类含有碳-碳双键的不饱和烃类物质，广泛存在于自然过程和人为活动中。结构的差异导致不同烯烃具有不同的功能和特点。例如，乙烯是植物生长发育的基本调节物质；丙烯是工业制造聚丙烯和丙烯腈的关键原料；1,3-丁二烯主要用于合成橡胶和塑料，是一级致癌物；而异戊二烯是排放产量最大的非甲烷生物源挥发性有机物，对全球气候变化具有重要影响。微生物在烯烃的降解与转化中起着关键作用，研究这些微生物的作用有助于更好地理解烯烃在环境中的寿命、归趋及影响，这对于地球化学循环的研究及污染场地的修复具有重要意义。本文首先总结了5种典型短链烯烃(乙烯、丙烯、丁烯、1,3-丁二烯、异戊二烯)的微生物好氧与厌氧的降解和转化的机制，发现烯烃降解菌株的分布十分广泛，涵盖多个微生物分类，但微生物对不同烯烃的降解具有一定的共性。例如，在有氧条件下，短链烯烃通常首先被烯烃单加氧酶氧化，生成的产物随后与辅酶M或谷胱甘肽结合后，经过一系列酶促转化后最终进入微生物的中心代谢途径。而在无氧条件下，短链烯烃则可被产乙酸菌、产甲烷菌等微生物通过加氢反应进行转化。通过总结微生物对常见短链烯烃的降解和转化机制，旨在强调微生物在烯烃污染场地生物修复中的重要作用，并加深对微生物在地球化学循环和全球气候变化中贡献的理解，以此推动可持续发展和资源的有效利用。
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2024,51(12):4967-4983, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240532
Abstract:
蓝藻是地球上最古老的生物之一，存在于从湖泊到沙漠几乎所有的生境中。作为太阳光谱中的重要组成部分，紫外光通过辐射作用对蓝藻的生长及进化产生重要而深远的影响。本文综述了紫外辐射对蓝藻生长的影响及其机制、对蓝藻生长的调控及蓝藻对紫外辐射的适应性策略。此外，本文探讨了紫外辐射与蓝藻进化之间的关系，阐述了蓝藻与紫外辐射交互作用在生物进化研究中的科学价值，分析了影响蓝藻抗紫外辐射的环境因素，并展望了紫外辐射下蓝藻适应与进化的未来研究方向。
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2024,51(12):4984-5005, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240589
Abstract:
环境中抗生素耐药性(antimicrobial resistance, AMR)的产生和传播对人类健康构成了严重威胁，最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)是评价环境中抗生素耐药性风险的关键指标。本研究基于文献梳理，发现常用的MIC测试方法中大部分采用肉汤微稀释法，其次是琼脂稀释法和E-test法，测试方法的不同对MIC值的影响不明显。基于EUCAST数据库，梳理了目前针对不同菌种和抗生素的MIC测试数据，发现革兰氏阴性菌(G−)的AMR问题得到了更多关注，其MIC数据量远大于革兰氏阳性菌(G+)，然而，G+对抗生素的耐药性比G−更强。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)分别是G−和G+中耐药性最强的细菌。有关AMR的研究主要集中于β-内酰胺类抗生素，而磺胺类和多肽类研究相对较少。在所研究的抗生素中，细菌对氨苄西林钠、链霉素和夫西地酸的耐药性最强。本研究梳理和总结了MIC测试方法与数据研究现状，指出目前数据远远不足，建议持续扩大MIC研究的覆盖面，并促进耐药信息共享。
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2024,51(12):5006-5025, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240516
Abstract:
【背景】生物浸矿效果与浸矿过程中微生物群落的结构变化密切相关，解析浸矿过程中的微生物群落结构和功能对于进一步认识微生物在浸矿过程中的作用、构建高效菌群具有重要意义。【目的】通过驯化获得稳定高效浸出黄铁矿的微生物菌群，并解析其菌群结构和功能。【方法】以黄铁矿为能源来源将微生物菌群在9K培养基中长期传代转接，对比驯化前后菌群的铁硫氧化能力，利用宏基因组测序结合16S rRNA基因克隆文库对驯化后的菌群进行群落结构解析，通过分化培养实验，探究驯化后菌群中优势微生物在浸出黄铁矿过程中的功能，结合宏基因组功能注释结果分析驯化前后菌群功能基因的变化。【结果】通过为期10代的转接驯化，获得了组成稳定、浸矿功能提升，更加适应黄铁矿浸出环境的微生物菌群。基于宏基因组的结果，驯化后的菌群相对于驯化前，嗜酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)和硫化杆菌属(Sulfobacillus)的比例均上升；16S rRNA基因克隆文库的检测结果显示，驯化后菌群主要由氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)和耐热硫化芽胞杆菌(Sulfobacillus thermotolerans)这2种微生物组成。驯化后菌群的铁氧化能力提升15.15%，硫氧化能力提升70.86%。对菌群的浸矿效果和组成它的优势种属单独的浸矿效果进行比较，以浸出黄铁矿中总铁的含量计算，驯化后5Biol菌群16 d的浸出率可达81.18%，氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)和耐热硫化芽胞杆菌(S.thermotolerans)单独的浸出率分别为51.86%和37.65%，5Bio菌群的浸矿能力优于组成它的优势种属的单独浸矿能力，说明菌群内优势种属之间可能存在协同作用，使得其浸矿效果达到了单物种不能达到的效果。通过分化培养后菌群组成的变化，判断氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)的主要作用是硫的氧化，而耐热硫化芽胞杆菌(S.thermotolerans)的主要作用是铁的氧化，耐热硫化芽胞杆菌(S.thermotolerans)需要依赖氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)的存在才能发挥铁氧化能力，说明菌群中不同物种可能通过协同合作共同提高了浸出黄铁矿的能力，这与5Biol菌群驯化后嗜酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)和硫化杆菌属(Sulfobacillus)的比例提高、浸矿能力得到增强是一致的。对驯化前后与铁硫代谢相关的功能基因进行分析，发现驯化后菌群铁的氧化主要通过sulfocyanin-like蛋白实现，硫的氧化主要通过sox系统、sor系统和非sox子系统实现。【结论】通过长期驯化传代的方法，可以获得组成稳定、功能强化的高效浸矿菌群。由于长期驯化菌群更加稳定，更容易解析其中不同菌种在执行浸矿功能中的作用。这对高效浸矿菌群的构建具有重要的指导意义。
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2024,51(12):5026-5036, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240333
Abstract:
【背景】恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) F1营养需求简单、生长迅速以及多样的代谢途径，被认为是合成生物学领域中最有潜力的底盘细胞之一。然而，将P.putidaF1的基因组进行精简构建生物降解的底盘细胞的研究鲜有报道。【目的】构建生物安全性较高的底盘细胞。【方法】利用基于同源重组原理的无痕基因编辑技术对P.putida F1基因组进行精简，并将条件性自杀系统整合到基因组中。【结果】成功敲除了占基因组大小1.83%的2个溶源噬菌体基因组岛PP1 (50.7 kb)和PP2 (58.4 kb)，构建了敲除菌株P.putida F1ΔPP12，进一步将由阿拉伯糖启动子控制的条件性自杀系统整合到P. putida F1ΔPP12基因组中的upp基因位点，构建了生物安全性更高的底盘细胞P.putida F1ΔPP12-Para-nuc。【结论】提高了P.putida F1的现实应用价值，并为使用其或以其为底盘细胞进一步改造的基因工程菌进行环境原位修复的可能性提供了理论依据。
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2024,51(12):5037-5050, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240535
Abstract:
【背景】东北黑土区是我国重要的粮食生产基地，然而由于化肥的过量使用，已造成土壤氮素的大量损失和环境污染问题。硝化作用是土壤氮循环的核心环节，主要由微生物驱动。【目的】利用硝化抑制剂3,4-二甲基吡唑磷酸盐(3,4-dimethylpyrazole phosphate, DMPP)和乙炔区分低氮和高氮黑土壤氨氧化细菌、氨氧化古菌和完全氨氧化菌对土壤硝化作用的相对贡献。【方法】基于黑土长期定位实验研究平台，以不施加氮肥(低氮土壤)和施加氮肥(高氮土壤)的黑土为研究对象，采用微宇宙培养实验和定量PCR技术，分析抑制剂添加对土壤有效态氮、氨氧化微生物丰度的影响及两者的关系。【结果】低氮黑土氨氧化微生物主要由氨氧化古菌和完全氨氧化细菌Clade B占主导，而高氮黑土主要由氨氧化细菌和完全氨氧化细菌Clade A占主导。硝化抑制剂DMPP和乙炔均显著抑制土壤氨的氧化，且在高氮土壤中更为明显，乙炔的抑制效果大于DMPP。另外，添加乙炔显著降低了低氮土壤氨氧化古菌、氨氧化细菌和完全氨氧化菌Clade B的丰度；而在高氮土壤中，硝化抑制剂DMPP则对土壤氨氧化细菌和完全氨氧化菌Clade A有显著抑制作用。相关分析表明，低氮土壤中氨氧化细菌和古菌amoA基因丰度与土壤NO3−-N含量显著正相关和NH4+-N含量显著负相关，而高氮土壤中，土壤氨氧化微生物amoA基因丰度与土壤NH4+-N和NO3−-N含量相关性均不显著。【结论】氮的长期输入显著改变了黑土氨氧化微生物对环境变化的响应。
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2024,51(12):5051-5062, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240526
Abstract:
【背景】T7噬菌体来源的T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase, T7 RNAP)因其特异性高和高效启动转录的特点，在生物学研究中得到广泛应用。目前已有多株稳定表达T7 RNAP的细胞系被构建用于进行RNA病毒的反向遗传学研究。草鱼是中国淡水养殖产量最高的鱼类，但其易受草鱼呼肠孤病毒(一种双链RNA病毒)的侵害。该病毒的反向遗传操作系统尚未建立，影响了对其的深入研究。稳定表达T7 RNAP的草鱼细胞系将有助于建立草鱼呼肠孤病毒的反向遗传操作系统。【目的】使用Tol2转座子系统构建稳定表达T7 RNAP的草鱼鳍条(grass carp fin, GCF)和草鱼性腺(grass carp ovary, GCO)细胞系，并鉴定其活性，以期为创建草鱼呼肠孤病毒的反向遗传操作系统提供细胞工具。【方法】利用PCR从大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)基因组中扩增出T7 RNAP基因，通过同源重组的方法使其插入Tol2转座子载体。同时也构建T7 RNAP的N端或C端连接核定位信号(nuclear localization signal, NLS)的重组Tol2转座质粒。将含有上述基因的重组转座质粒与表达Tol2酶的辅助质粒分别共转染2种草鱼细胞，使用潮霉素B进行筛选。对所筛选出的细胞进行蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)检测。进一步使用由T7启动子驱动的EGFP报告质粒进行功能验证，并比较添加NLS对T7 RNAP表达和功能的影响。【结果】构建了携带T7 RNAP基因的3种Tol2转座重组质粒，转染2种细胞筛选后获得了相应的6株细胞系。WB结果显示筛选后的细胞中均有明显的T7 RNAP表达条带，表明T7 RNAP在细胞中成功表达。使用由T7启动子驱动的EGFP质粒对细胞进行转染，观察到EGFP在转染细胞中高效表达，实验结果表明这6株细胞中的T7 RNAP均有转录活性。另外，携带NLS序列的T7 RNAP在GCO细胞中显示出更高的表达及转录活性，尤其是在T7 RNAP C端添加NLS时效果最佳。但在GCF细胞中未观察到明显差异。【结论】通过使用Tol2转座子系统构建了稳定表达T7 RNAP的GCF和GCO细胞系，能驱动T7启动子控制的外源基因的高效转录和表达。NLS可以通过促进T7 RNAP向细胞核的转运来提高其在核内的积累和转录效率，但其效果可能因细胞的类型不同而有所区别。添加NLS可进一步增强其表达和转录活性。这些结果为T7 RNAP在草鱼呼肠孤病毒研究中的应用提供了基础。
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2024,51(12):5063-5077, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240513
Abstract:
【背景】外周捕光色素蛋白复合体(peripheral light-harvesting complex, LH2)在光合作用中执行光能捕获和传递功能，对于不产氧光合细菌(anoxygenic phototrophic bacteria, APB)的光合生长至关重要。在APB中，LH2的αβ亚基通常是由多拷贝pucBA基因编码，尤其是红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)菌株，可高达5−7拷贝。由于不同pucBA基因合成的异质性LH2彼此之间难以分离纯化，极大限制了LH2结构与功能的深入研究。【目的】构建以沼泽红假单胞菌为宿主菌的重组LH2表达体系，利用该重组表达体系在体内和体外评价LH2的光能传递活性。【方法】以5对pucBA基因全部缺失的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris) CGA009 (ΔpucBA)为宿主菌，采用基因重组方法，以pucBAd和mrfp(红色荧光蛋白基因)基因共表达产物为检测指标，对表达载体进行遗传改造和启动子筛选；采用光谱法测定重组菌的生物量和基因表达产物光谱特征，以及纯化LH2的光谱特征、光合色素分析和能量传递活性。【结果】T7启动子(PT7)和T7 RNA聚合酶基因联合使用，可使pucBAd和mrfp在ΔpucBA宿主菌中共表达。用启动子PbadR、PpckA和Pars替换PT7，启动子活性从高到低依次为PpckA、Pars、PbadR和PT7，并与重组菌mrfp基因表达量、pucBAd表达产物(d-LH2)合成量和光合生长速率呈正相关关系，其中以PpckA启动子构建的重组LH2表达体系ΔpucBA(pucBAd)表达活性最高。在此基础上，以CGA009菌株的pucBAa基因(编码a-LH2)替换ΔpucBA(pucBAd)菌株的pucBAd基因，获得ΔpucBA(pucBAa)重组菌。相较于ΔpucBA(pucBAa)重组菌，低光时ΔpucBA(pucBAd)重组菌生长速率显著升高，高光时有升高趋势，但未呈显著差异。纯化的d-LH2和a-LH2分别呈现典型的B800-only和B800-850特征光谱，d-LH2产生~863 nm荧光的量子效率高于a-LH2，但采用经典法测定的类胡萝卜素(carotenoids, Car)到细菌叶绿素(bacteriochlorophylls, BChl)的光能传递效率却低于a-LH2，2种结果不一致的原因是“经典法”未考虑不同光谱类型LH2对~863 nm光子吸收的差异。【结论】构建沼泽红假单胞菌的重组LH2表达系统，从基因纯LH2水平和重组菌光合生长水平评价了多拷贝pucBA基因菌株中2种不同光谱类型的LH2能量传递活性，证明异常光谱LH2 (d-LH2)能量传递活性高于典型光谱LH2 (a-LH2)，本研究为多拷贝pucBA菌株光适应过程中LH2形成和组装的分子调控机制的全面理解奠定了基础。
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2024,51(12):5078-5089, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240505
Abstract:
【背景】组蛋白乙酰转移酶general control nonderepressible-5 (GCN5)作为一种重要的表观遗传修饰因子，参与调控真核生物的多种生命活动。目前，关于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)组蛋白乙酰转移酶GCN5的功能与机制研究尚未见报道。【目的】明确灰葡萄孢组蛋白乙酰转移酶GCN5的编码基因BcGCN5在病菌生长发育和致病过程中的功能，为进一步阐明组蛋白乙酰化修饰在病原菌生长发育及致病过程中的功能与调控机制奠定基础。【方法】利用基因敲除技术构建了灰葡萄孢BcGCN5基因的敲除突变体ΔBcGCN5；以野生型菌株B05.10为对照，对突变体ΔBcGCN5的表型和致病力进行分析。【结果】灰葡萄孢BcGCN5基因的敲除突变体ΔBcGCN5的生长速率明显减慢，菌核数量较少，分生孢子数量显著降低，对番茄果实和烟草叶片的致病力减弱，产酸能力降低。【结论】灰葡萄孢组蛋白乙酰转移酶BcGCN5正调控病菌的生长、发育和致病过程。
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2024,51(12):5090-5104, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240257
Abstract:
【背景】谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase, EC 2.3.2.13)简称TG酶，能够催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基基团与赖氨酸残基的ε-氨基基团之间交联，形成异性肽键，从而改变蛋白质的构象和功能。目前TG酶已经广泛应用到食品、生物医药、纺织、皮革加工等领域。【目的】从天然茂原链霉菌中挖掘性能优异的TG酶，并将其在工业底盘菌株中重组表达以提高产量。【方法】通过发酵测定了一株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis) CGMCC 4.266的TG酶生产能力。使用Capto S阳离子交换层析柱对该TG酶(TGe)进行纯化。通过测定TGe的最适pH和pH稳定性、最适温度和温度稳定性以及交联酪蛋白的能力来分析其酶学性质。将工业茂原链霉菌内源tg基因进行敲除构建Δtg，然后将tge基因在Δtg中重组表达。【结果】TGe最适pH值为5.0，在pH 4.0−10.0范围内保持较高的活性。最适反应温度为50 ℃，与商品化酶相当，在4−40 ℃范围内TGe稳定性较好，在40−65 ℃范围内TGe活性略优于商品化酶。酪蛋白交联实验表明，在50 ℃条件下，TGe交联能力明显优于商品化酶。tge在Δtg中重组表达，TGe产量显著提高可达6.3 U/mL，相较野生菌株提高162.5%，并且TGe催化活性不受影响。【结论】对天然茂原链霉菌中的TG酶进行挖掘表征，是获取性能更加优异TG酶的有效方式。异源TG酶在成熟工业菌株中成功表达为提高茂原链霉菌TG酶的产量提供了新策略。
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廖恒毅，王旭昊，崔逸儒，李晓翠，王红岩，侯贺磊，王晶晶，李秀颖，杨毅
2024,51(12):5105-5120, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240533
Abstract:
【背景】有机卤呼吸细菌介导的还原性脱卤过程对于卤素循环与有机卤污染场地的修复至关重要。还原性脱卤酶(reductive dehalogenases, RDases)作为有机卤呼吸的末端电子受体还原酶，在脱卤过程中起着关键作用。【目的】系统地了解还原性脱卤酶的序列与结构特征，为阐明还原性脱卤酶及有机卤呼吸细菌作用机制及生物学功能奠定基础。【方法】应用多种生物信息学分析工具对44个还原性脱卤酶蛋白的基本理化性质、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点、系统发育关系、多序列比对的同源性矩阵、保守基序、保守结构域、二级结构、三级结构及无序区域进行预测分析。【结果】不同还原性脱卤酶蛋白的理化性质存在差异，但呈现出一定的保守性。不同还原性脱卤酶蛋白的磷酸化位点、保守结构域分布、保守基序分布，以及二级结构的保守性较高。底物类别相似或相同的还原性脱卤酶在蛋白序列和三级结构上更为相似。大多数还原性脱卤酶蛋白的亲缘关系较近。还原性脱卤酶蛋白主要为分泌型蛋白、非膜定位蛋白和固有无序蛋白。【结论】不同还原性脱卤酶蛋白具有一定的保守性，因此能够发挥相似的生物学功能。研究结果对进一步研究还原性脱卤酶具有一定的参考价值，尤其是为基于还原性脱卤酶的有机卤呼吸细菌应用于实际场地修复提供科学依据与理论参考。
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徐一鸣，王敬红，徐红敏，邓常宇，范寒雪，邹世杰，AmanKhan，李祥锴，赵洪颜，魏丹，王伟东
2024,51(12):5121-5140, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240445
Abstract:
【背景】东北地区每年都会产生大量的作物秸秆类农业废弃物，低温导致自然条件下秸秆降解缓慢。【目的】筛选耐低温高效降解木质素的细菌，探究其木质素降解相关途径。【方法】通过形态学及16S rRNA基因测序进行菌株鉴定，在低温条件下进行木质素降解条件优化，利用转录组学方法对菌株木质素降解特征进行分析。【结果】筛选了一株能在15 ℃条件下高效降解木质素的菌株芽孢八叠球菌(Sporosarcinasp.) N2，低温培养8 d木质素的降解率为20.8%，条件优化后提高至31.7%。通过转录组测序分析确定不同时期间的差异表达基因，发现与抗冻、木质素降解相关的功能基因在不同降解时期上下调变化明显，通过其基因表达推测了该菌株木质素降解途径为苯甲酸途径与原儿茶酸途径。【结论】本研究丰富了低温木质素降解微生物资源，为后续秸秆低温生物强化降解提供了数据支持。
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2024,51(12):5141-5158, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240426
Abstract:
【背景】桃树的根部内生细菌群落具有促进植物生长和抗逆性的潜力。研究这些微生物群落的组成和功能可以进一步挖掘内生菌在桃树根部生长发育中的作用，可为后续微生物资源开发和利用提供参考。【目的】分析不同品种桃树根部的内生细菌群落的组成、多样性和功能，为进一步研究桃树与内生菌之间共生关系奠定基础。【方法】采用16S rRNA基因扩增子测序技术，并运用多种生物信息学方法进行数据分析，对北京市平谷区国桃基地7个不同品种桃树根内生细菌进行群落组成、多样性分析、LEfSe分析和PICRUSt2功能预测。【结果】发现不同品种桃树的根部内生细菌群落在红毛桃、白毛桃和黄肉桃中的组成存在显著差异。主要优势菌门为放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，其中放线菌门在大部分样品中占优势地位。微生物群落多样性分析显示，品种间的Shannon、Simpson指数差异显著，表明不同桃品种根内生菌的多样性存在差异性，并较复杂。LEfSe分析识别了与特定品种相关的根内生菌标志物，例如双歧杆菌属(Bifidobacterium)在红毛桃和白毛桃中具有较高相对丰度。PICRUSt2功能预测表明，内生细菌生物学功能在不同红毛桃品种间差异较大，主要参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢，展示了内生菌群对宿主植物生理功能的潜在影响。【结论】本研究揭示了不同品种桃树根部内生细菌群落的组成、多样性和功能，拓宽了对桃树内生菌的认识，为后续桃树内生细菌资源的开发利用奠定了基础。
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2024,51(12):5159-5176, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240552
Abstract:
【背景】蜡伞属(Hygrophorus)隶属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)伞菌目(Agaricales)蜡伞科(Hygrophoraceae)，在世界分布广泛。【目的】对山西省的蜡伞属真菌物种进行资源调查，丰富该地区蜡伞属物种的多样性。【方法】采集标本并进行形态学观察及描述；提取DNA，测定内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)；基于最大似然法(maximum likelihood, ML)和贝叶斯法(bayesian inference, BI)构建分子系统发育树。【结果】结合形态学特征和分子系统发育学共鉴定出山西省蜡伞属真菌11种，包括已知种10个，新种1个。本文对新种拟褐顶蜡伞(Hygrophorus brunneodiscoides)的宏观、微观形态特征进行了详细的描述、绘图及拍照，并提供了这10个已知种的子实体图片和山西省蜡伞属物种检索表。【结论】本文描述了发现于中国的新种拟褐顶蜡伞(H. brunneodiscoides)，证实了山西存在该属物种11个，并根据野外观察对这11个物种的地理分布及其与宿主植物间的关系进行了简要讨论。
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叶庆磊，张颖，刘子豪，冯瑞珍，蔡佳怡，蔡佳，张菊梅，吴清平，陈谋通
2024,51(12):5177-5192, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240269
Abstract:
【背景】单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性致病菌，易感人群感染后致死率可达20%−30%。【目的】筛选高效拮抗单增李斯特菌的乳酸菌菌株，并探究其细菌素的理化特性及对单增李斯特菌的杀伤作用。【方法】采用牛津杯法筛选高效拮抗单增李斯特菌的产细菌素乳酸菌菌株；通过形态特征、16S rRNA基因序列分析及平均核苷酸一致性分析进行菌株分类学鉴定；并进一步分析其细菌素的理化特性；利用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜表征细菌素粗提物对单增李斯特菌的拮抗作用。【结果】筛选获得一株高效拮抗单增李斯特菌的菌株A9-1A，其抑菌圈大小为37.56 mm，仅对李斯特菌属(Listeria)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)具有拮抗作用，经形态特征、16S rRNA基因序列分析和平均核苷酸一致性分析鉴定为蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)；其产生的细菌素粗提物能够耐受强酸强碱(pH 2.0−11.0)、高温(37−121 ℃)环境，对淀粉酶和脂肪酶不敏感，但对蛋白酶敏感，最低抑菌浓度为16 μg/mL，激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜结果表明细菌素粗提物通过损伤细胞的细胞膜并形成孔洞，造成细胞内容物泄漏，从而杀死单增李斯特菌。【结论】分离筛选到一株高效拮抗单增李斯特菌的产细菌素蒙氏肠球菌A9-1A，其细菌素粗提物具有耐受强酸强碱和高温的特性，具有在食品生产过程中高效防控单增李斯特菌污染的潜在应用前景。
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2024,51(12):5193-5213, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240561
Abstract:
【背景】缺乏氮源常会影响果酒发酵性能，导致果酒整体感官品质不佳。然而，补充氮源是否影响百香果酒发酵与风味特性鲜有报道。【目的】通过添加磷酸氢二铵(dibasic ammonium phosphate, DAP)作为一种氮源补充方式，探究其对百香果酒的发酵性能和挥发性成分的影响，旨在为改善百香果酒品质提供理论依据和数据支持。【方法】采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)、气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、气相色谱-三重四极杆质谱(gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, GC-TQMS)和电子鼻(electronic nose, E-Nose)技术，测定了有机酸、氨基酸和挥发性化合物等指标，综合分析了添加DAP对百香果酒香气风味特征的影响。【结果】在发酵方面，与未添加DAP的对照组相比，添加400 mg/L DAP可以使百香果酒发酵时间缩短5 d，发酵终点时总糖含量(3.35±0.57) g/L，酒精含量(10.73±0.06)% vol。添加DAP的百香果酒中总酚[(68.62±2.81) mg/L]和总黄酮[(23.41±0.65) mg/L]的含量升高。在氨基酸含量和种类方面，添加DAP与未添加DAP的百香果酒中均检测到20种游离氨基酸，总氨基酸含量分别为(669.40±56.27) mg/L和(1 017.58±80.53) mg/L，两者存在明显差异；其中，添加DAP后，谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸等种类消耗量最多，对百香果酒乙醇发酵有重要贡献。在香气风味方面，百香果酒中共检测到59种挥发性化合物，与未添加DAP组相比，添加DAP的百香果酒多产生20种挥发性物质，其中19种挥发性化合物为主要呈香物质(odor activity value, OAV>1)，包括异戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯和反式-β-紫罗兰酮等；高级醇和乙酸随DAP的添加而减少，萜烯类、醛类和酮类的含量随DAP的添加而显著升高。【结论】添加DAP (400 mg/L)不仅改善了百香果酒的发酵性能，而且提高了它的风味组分的种类及含量，从而整体上提高了百香果酒的品质。
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2024,51(12):5214-5228, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240491
Abstract:
【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)在食品、医药领域具有重要的应用价值。海洋微生物来源的β-葡萄糖苷酶Bgl2A:V224D在大豆黄浆水精深加工中有较好的应用潜能，但其较低的稳定性和乙醇耐受性限制了其实际应用。【目的】提升Bgl2A:V224D的应用潜能，对其进行计算辅助的理性设计改造，提升其在应用环境中的稳定性和有机溶剂耐受性。【方法】综合采用3种计算方法设计构建Bgl2A:V224D突变体，利用序列共进化和保守性分析确定候选突变体，再通过湿法实验检测筛选目标突变体。获得稳定性提升的突变体后，通过组合突变进一步提升突变体的稳定性，并对突变体在大豆黄浆水精深加工中转化大豆异黄酮的应用潜能进行评估。【结果】获得多个稳定性提升且酶活维持或提升的单点突变体和组合突变体，其中S360K/E408Y稳定性最高，其在35 ℃、pH 6.5条件下的半衰期提升至出发酶的6.7倍左右。该突变体对乙醇的耐受性也比出发酶更高：前者在35 ℃、20%乙醇条件下孵育20 min，酶活剩余35%左右；而后者在相同条件下孵育10 min，酶活降至5%左右。将S360K/E408Y应用于水解大豆异黄酮制备苷元，其水解效率比出发酶Bgl2A:V224D显著增加，在相同条件下前者可水解的底物量是后者的2倍；用于大豆黄浆水精深加工，转化相同体积黄浆水中的大豆异黄酮，突变体S360K/E408Y所需酶量比出发酶减少1/3左右。【结论】利用提升稳定性的改造方法提升酶对有机溶剂的耐受性的策略适用于β-葡萄糖苷酶，通过这一策略可提升β-葡萄糖苷酶在多领域的应用潜力。
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王雅茜，胡云皓，王豪杰，岳怀宁，辛凌翔，潘瑶，刘燕，王震，陈创夫，朱良全
2024,51(12):5229-5239, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240357
Abstract:
【背景】牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起牛乳房炎、关节炎及呼吸道疾病等的重要病原体之一，严重危害养牛业的健康发展。【目的】建立一种便捷、快速、灵敏和特异的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术结合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)方法用于牛支原体的检测。【方法】对牛支原体P48特异性基因序列进行对比，选择保守性区域。运用Primer Explorer V5在线软件设计引物，并通过荧光染料法与以oppD/F、oppD、urvC为靶基因所设计的LAMP引物进行比较。对筛选出的最佳P48引物组的内引物(FIP/BIP)用生物素和6-羧基荧光素标记；利用单一控制变量法对反应温度、时间与引物浓度比进行优化；将LAMP检测方法与LFD相结合。最后评价该方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用效果。【结果】P48 LAMP引物组荧光信号更强，Ct值较小，扩增效率较高，优于已报道的LAMP引物组；当反应温度为60 ℃、引物(F3/B3:FIP/BIP)浓度比为1:4、反应时间为40 min时最佳；最低检测浓度为17.28 fg/µL，比行业标准PCR检测方法灵敏1 000倍；与多杀性巴氏杆菌、牛疱疹病毒等9种引起牛呼吸道疾病相关病原体均无交叉反应；批间与批内试验均一致；运用该方法对39份临床鼻拭子的检出率为28.21%，高于行业标准的PCR法(检出率23.07%)。【结论】成功建立一种敏感、特异以及便于基层使用的牛支原体LAMP-LFD检测方法，为防控牛支原体病提供了技术支持。
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2024,51(12):5240-5248, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240392
Abstract:
在教育数字化转型时代背景下，利用信息化工具与数字化资源进行混合式教学，对于提升教学质效意义重大。针对医学微生物学课程教学中存在的内容复杂、教学方法手段单一、学员参与度不够、教学效果不佳等问题，通过在导入-目标-前测-参与式教学-后测-总结(bridge-in, objective, pre-assessment, participatory learning, post-assessment, and summary, BOPPPS)教学模式下整合雨课堂的在线互动教学平台与微课的短视频教学资源，构建了一种新型线上线下混合式教学模式，在医学微生物学课程中进行了应用实践，并通过问卷调查、成绩对比等方法对教学效果进行评估。结果表明，基于雨课堂及微课的BOPPPS教学模式显著提升了学员的学习兴趣和课堂参与度，同时也提高了学生的成绩。本研究证明了该教学模式在提升教学质量和学生学习效果方面的有效性，为医学教育领域的教学改革提供了有益参考。
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2024,51(12):5249-5259, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240470
Abstract:
微生物学是农业高校生物科学、生物技术、生物工程及其他涉农专业的重要专业基础课，主要讲授微生物及其生命活动规律。华中农业大学微生物学教学团队依托农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，面向国家重大需求、聚焦农业微生物学前沿领域，以高水平科学研究为支撑，在微生物学创新人才培养方面一直进行着探索与实践。在讲授微生物学课程前、后或过程中，任课教师同时作为全国重点实验室固定研究人员，将实验室科研优势、学科优势转化为一流育人资源，将课程讲授与科研训练相结合，指导学生在国家级科研平台接受规范化、系统性、前沿性的科研训练。同时，依托一流学科底蕴，培养学生的交叉思维；借助国际科技合作，拓展学生的全球视野；通过产教研学引领，强化学生的实践能力；弘扬科研文化精神，促进学生的全面发展。多措并举，微生物学教学团队科研育人成效显著，为生物产业和乡村振兴输送了大批微生物学相关领域的创新人才。
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2024,51(12):5260-5269, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240409
Abstract:
康奈尔大学作为国际知名一流高校，其课程体系的形成经历了漫长且复杂的历史演变过程。生物学分支学科之一的微生物学，其课程设置贯通本、硕、博各个阶段。本科阶段的课程具有完整、自主、实践性强等特征，专业基础课程、专业核心课程和专业选修课程则进行分级教学，促进了从低阶到高阶、从基础到核心、从探索到创新进阶式人才培养模式的形成。教学管理严谨规范，形散而神聚，具有许多培养创新型人才的优势特点，可对我国高校基础学科拔尖创新人才培养和微生物学课程改革及教学实践提供借鉴和参考。
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2024,51(12):5270-5281, DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240886
Abstract:
三羧酸循环的反应过程复杂，中间产物多样、知识点密集，是生物化学课程教学中的重点和难点。在现有教学中，教师们通常按照三羧酸循环的反应步骤依次讲解(简称顺序法)，但其教与学的效果尚具有提升的空间。为了简化反应过程和产物术语的复杂度，使学生易于理解和掌握三羧酸循环的反应途径和作用机制，同时提升教学质量，本文提出了一种教学思路，即通过脱羧反应的线索来解析三羧酸循环(脱羧解析法)。首先，脱羧解析法展示了丙酮酸脱羧形成的乙酰辅酶A与草酰乙酸反应，形成的柠檬酸分子中的2-羧甲基在三羧酸循环的第一轮循环未参与脱羧。然后，采用R代表羧甲基对三羧酸循环进行分析发现，从乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合开始，三羧酸循环的部分中间产物化学式可以对应写成：柠檬酸(R-2-苹果酸)、顺乌头酸(R-延胡索酸)、异柠檬酸(R-3-苹果酸)、α-酮戊二酸(R-丙酮酸)、琥珀酰辅酶A (R-乙酰辅酶A)、琥珀酸(R-乙酸)。三羧酸循环的两次脱羧分别发生在异柠檬酸和α-酮戊二酸。为了检验“脱羧解析法”的教学效果，本文招募学生开展接受“脱羧解析法”教学前后学习效果的问卷调查，并对反馈结果进行统计分析显示，接受脱羧解析法教学后，绝大多数学生都感觉“三羧酸循环”的每一步反应变得容易理解和记忆了。“脱羧解析”教学法对学习效果的提升有助于启发学生的思考与分析，促进学生的学习能动性与创新精神，从而获得更好的学习效果。
