摘要:

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摘要:近年来突发疫情的广泛流行给人类生活、社会稳定和经济发展带来了前所未有的挑战，人兽共患病的防控不约而同成为世界性焦点。兽医微生物学对公共卫生和人类健康的重要作用受到高度重视，为集中展现人兽共患病原细菌(病)领域的最新研究和应用成果，《微生物学通报》组织出版了“人兽共患病原菌主题刊”，栏目包括综述和研究报告。综述汇集了主要人兽共患病原菌流行现状、效应分子调控、诊断标识发掘及新型疫苗抗原研究的前沿进展和新成果；研究报告涵盖了病原诊断技术研发、细胞培养与鉴定、益生菌分离与鉴定、噬菌体分离与鉴定、分子功能探究、 感染与免疫等。希望本期主题刊为我国兽医微生物学科发展与进步提供交流平台，更好地推动人兽共患病防控新技术、 新理论的探索。

摘要:空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是最常见的食源性病原细菌之一，在世界范围内广泛流行，感染人和动物表现不同的临床症状和病理变化，特别是家禽感染后不表现任何临床症状，成为人感染的主要来源，解析该菌在宿主体内的感染和定殖机制对其防控具有关键作用。空肠弯曲菌通过鞭毛III型分泌系统分泌效应蛋白，注入宿主细胞内，与细胞内蛋白结合，调控宿主细胞信号通路，改变宿主细胞防御机制，在空肠弯曲菌感染和定殖宿主过程中发挥重要作用。本文就空肠弯曲菌鞭毛III型分泌系统分泌效应蛋白的种类及作用机制，以及在解析该菌致病和定殖方面的作用进行综述，对深入理解空肠弯曲菌的致病机制具有重要意义。

摘要:非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染而引起的一种急性传染病。目前，国内外尚未生产出有效的商业化疫苗，致使ASF的防控难度一直较大，定期的流行病学监测和高效的早期诊断技术对ASF防控和净化非常重要。针对ASFV检测靶标的挖掘和研究，可以有效地为ASF诊断技术研发提供参考，为疾病防控贡献力量。本文对当前ASF所使用的诊断靶标进行了综述，以期为ASF的防控工作以及研发高效可行的诊断技术提供参考。

摘要:训练免疫属于先天免疫反应，其特征是先天免疫细胞表观遗传重编程、代谢重编程。通过某些刺激(如疫苗、微生物或其产物)可激发先天免疫细胞，如单核细胞、中性粒细胞和骨髓干细胞的训练免疫，若重新刺激，可增强先天免疫细胞对微生物病原体的免疫反应。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)、β-葡聚糖[白色念珠菌(Candida albicans)主要细胞壁成分]等通过激活先天免疫细胞核转录因子-κB (nucleus factor -κB, NF-κB)通路或者树突状细胞相关C型凝集素-1/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/低氧诱导因子-1α (dendritic cell-associated C-type lectin 1/protein kinase B/mammalian target of rapamycin/hypoxia-inducible factor 1-alpha, Dectin-1/Akt/mTOR/HIF-1α)信号通路调控细胞代谢重编程和表观遗传重编程，从而诱导训练免疫。先天免疫细胞中训练免疫的发现为新疫苗的研发、免疫缺陷状态的治疗策略及调节自身炎症性疾病提供新的方向。因此，了解BCG诱导训练免疫的细胞学机制，可对未知疾病的预防有重大意义。

摘要:布鲁氏菌(Brucella)是一种全球广泛传播的人畜共患病原体，能够感染野生动物、家养动物及人类。为了在宿主体内建立并维持慢性感染，布鲁氏菌进化出了多种策略逃逸宿主的免疫应答机制，并且在细胞内大量繁殖。其核心机制主要依赖于Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system, T4SS)及其分泌的效应因子。T4SS通过将效应因子直接注入宿主细胞内，调控宿主细胞的多种功能，从而帮助病原体逃避免疫监控、操纵宿主细胞内环境，并促进布鲁氏菌的生存与复制。本文综述了布鲁氏菌T4SS的结构与功能，以及T4SS效应因子在调控宿主细胞功能方面的最新研究进展，探讨了布鲁氏菌如何通过调节宿主细胞信号传导途径，实现对细胞内液泡的控制，并形成有利于细菌存活的复制生态位。这些研究进展为我们更好地理解布鲁氏菌感染的致病机制提供了新见解，并有助于开发更有效的预防和治疗策略来应对布鲁氏菌感染。

摘要:人兽共患病对人类健康构成严重威胁，并对畜牧业和公共卫生安全造成重大影响。接种疫苗是预防这些疾病传播的重要手段。作为一种新型候选疫苗，菌影疫苗因其能诱导更强的体液、细胞及黏膜免疫反应，并且具有发酵生产、纯化工艺简单、安全性高等优点，展现出广阔的应用前景。本文简要介绍细菌菌影的制备工艺、免疫机制，重点阐述菌影技术在以布鲁氏菌病为主的重要动物细菌性人兽共患病中的研究进展，以期为新型疫苗的开发提供有价值的参考。

摘要:外泌体(exosomes)为细胞间通讯的媒介，在布鲁氏菌(Brucella)的传播和免疫调节中发挥重要作用。本文重点阐明了外泌体在布鲁氏菌感染中的调控作用，探讨了外泌体在诊断、疫苗及药物中的应用价值，以期为利用外泌体防控布鲁氏菌等胞内菌提供参考。

摘要:布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的一种重要人兽共患细菌病，目前呈全球流行态势。布病对人兽健康造成严重威胁，并给局部地区带来巨大的社会经济负担。布鲁氏菌侵入宿主体内并建立长期甚至终身感染，离不开其精巧的免疫逃逸机制和复杂的胞内复制机制。调控宿主细胞死亡，如细胞凋亡、焦亡和自噬等，是布鲁氏菌免疫逃逸机制的重要环节。因此，深入研究布鲁氏菌调控宿主细胞程序性死亡的方式及其作用，能够为深入解析布鲁氏菌致病机制、挖掘药物靶标提供有益的参考价值。基于此，本文总结了近些年关于布鲁氏菌感染与宿主细胞多种程序性死亡之间的精密调控及其之间的“对弈”进展。

摘要:人兽共患病是由同一病原引起、在人和脊椎动物之间自然传播的疾病，已成为全球共同面临并亟待解决的重大问题。当前人兽共患传染病在人类新发和现有传染病中占比达60%，其中布鲁氏菌(Brucella)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)、沙门氏菌(Salmonella)及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae, KP)等引起的人兽共患细菌病严重威胁畜牧业健康发展、公共卫生安全和国家生物安全，其防控形势日益严峻。本文就上述6种重要人兽共患细菌病的流行现状及其相关耐药机制和抗菌新策略进行综述，为科学防控人兽共患细菌病提供参考。

摘要:人兽共患病(zoonoses)是指在人与脊椎动物之间自然传播的疫病。在人类已知的传染病中，60%是动物源性的。这些疫病对世界公共卫生安全、粮食安全及生物多样性等构成威胁。亟须开发快捷、灵敏的检测方法，在疫病发展初期进行快速诊断，对控制传染源、预防人兽共患病传播有重要意义。电化学生物传感器是集电化学与生物技术于一体的新型分析方法，能够快速实现对目标物质的定性、定量分析。具有操作简单、成本低廉、特异性强、检测范围广等优点。电化学免疫传感器作为电化学生物传感器的重要分支，已经广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。本文介绍了电化学免疫传感器的原理与分类，结合其在检测人兽共患细菌、病毒和寄生虫方面的研究进展，总结了电化学免疫传感器在我国畜间人兽共患病原体检测中的应用优势及存在的问题。

摘要:【背景】犬种布鲁氏菌(Brucella canis)是布鲁氏菌6个经典种之一，是严重危害犬只健康的人畜共患病原。【目的】制备犬种布鲁氏菌阳性血清，为犬布病诊断试剂的开发与应用提供标准物质。【方法】用犬种布鲁氏菌灭活菌液(约1.5×10¹⁰ CFU/mL)多次免疫实验用比格犬，制备获得犬种布鲁氏菌病阳性血清，采用试管凝集试验方法，以欧盟犬种布鲁氏菌标准阳性血清溯源并标定血清效价。再以本研究制备的标准阳性血清为标准物质，质控本实验室研制的犬种布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原和犬种布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒的检测灵敏度，并用上述2种方法同时检测北京地区宠物犬血清中犬种布鲁氏菌抗体，比较各方法与补体结合试验结果的符合率。【结果】经试管凝集试验测定，制备获得的犬种布鲁氏菌阳性血清效价为2 400 IU/mL，采用犬阴性血清将阳性血清效价稀释至1 000 IU/mL，分装冻干，即为本研究制备的犬种布鲁氏菌标准阳性血清。将该标准阳性血清作为质控品，检测本实验室研制的犬种布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原和犬种布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒的检测灵敏度均为20 IU/mL。用犬种布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原与犬种布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒对北京地区宠物犬血清临床样品进行检测，与金标准的补体结合试验进行符合率比对，虎红平板凝集试验和补体结合试验的阳性率均为6.25%，间接ELISA抗体检测试剂盒阳性率为5.97%，虎红平板凝集试验、间接ELISA抗体检测试剂盒与补体结合试验的符合率分别为94.31%和94.60%。【结论】本研究制备的犬种布鲁氏菌标准阳性血清为犬种布鲁氏菌诊断试剂的研发提供了必要的质控样品。

摘要:【背景】布鲁氏菌(Brucella)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)和犬新孢子虫(Neospora caninum)是引起奶牛流产的重要病原，目前针对上述病原的血清学检测方法，存在特异性低或操作复杂等问题，PCR或RT-PCR方法仅能对单一病原进行检测；多重PCR可同时对多种病原进行检测，可极大地提高病原的检测效率。【目的】建立布鲁氏菌、牛传染性鼻气管炎病毒和犬新孢子虫的多重PCR检测方法，对临床样品进行快速检测。【方法】针对布鲁氏菌omp25基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因和犬新孢子虫SRS2基因设计特异性引物，优化多重PCR的退火温度、引物浓度、延伸时间和循环次数；以沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、弓形虫(Toxoplasma gondii)和圆环病毒标准核酸验证多重PCR反应的特异性，以含靶基因的重组质粒验证多重PCR的敏感性；对55份流产奶牛阴道拭子进行检测。【结果】多重PCR的退火温度为59 ℃，延伸时间为40 s，循环次数为30，各引物浓度为1 μmol/L；对omp25基因和SRS2基因的检测下限为4×10¹ copies，对gB基因的检测下限为4×10² copies；与其他病原无交叉反应；55份样品中检出布鲁氏菌阳性9份，牛传染性鼻气管炎病毒阳性3份，犬新孢子虫阳性7份，其中布鲁氏菌和犬新孢子虫混合感染1份。【结论】成功构建了3种病原的多重PCR检测方法，能够对临床样品进行快速、准确的检测。

摘要:【背景】牛结核病(bovine tuberculosis, BTB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合体中的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的慢性传染性疾病，对牛群健康、畜牧业经济和公共卫生构成了重大威胁。【目的】筛选牛分枝杆菌新型诊断分子标识物，以期建立牛结核病新型诊断方法。【方法】利用同位素标记的相对与绝对定量技术并结合文献报道筛选出Mpb70、GroEL2、HspX、DnaK、Mpb83、EsxW、BfrB、Hrp1、EsxL、AtpD和EsxN这11种蛋白质进行制备，并通过豚鼠模型评价其致敏效果。【结果】当重组蛋白量为100 μg时，Mpb70、HspX、Mpb83和EsxN可引起明显的迟发型过敏反应，并且出现破溃。当使用量为50 μg时，Mpb70、HspX、Mpb83、EsxW、EsxL和EsxN可引起明显的迟发型过敏反应。当使用量低至12.5 μg时，则无法引起豚鼠的迟发型过敏反应。对不同蛋白进行组合使用，EsxW/EsxL/EsxN组合的活性最好，可刺激豚鼠产生明显的迟发型过敏反应；EsxW/EsxL、EsxW/EsxN、EsxL/EsxN组合也可引起迟发型过敏反应，但其反应程度不如EsxW/EsxL/EsxN组合。【结论】重组蛋白Mpb70、HspX、Mpb83、EsxW、EsxL和EsxN可引起较好的迟发型过敏反应，具有可替代结核菌素的应用前景。

摘要:【背景】猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)是引起全球经济和公共卫生问题的重要人兽共患病病原菌，引发脑膜炎、关节炎和败血症等临床症状。磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(phosphopantothenoylcyteine decarboxylase, PPCDC)在前期构建的猪体外血脑屏障模型与猪链球菌全基因组噬菌体随机展示文库的相互作用中被筛选出来，但其影响血脑屏障的机制尚不清楚。【目的】探究PPCDC在SS2诱导脑膜炎过程中发挥的作用。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统诱导表达重组蛋白rPPCDC，通过体外构建人脑微血管内皮细胞单层屏障模型和体内小鼠感染模型探究其对血脑屏障通透性的影响，制备rPPCDC疫苗进行小鼠免疫保护试验。【结果】成功纯化出可溶性重组蛋白rPPCDC，发现其在体外可以降低单层屏障模型的细胞跨膜电阻值，增加突破单层屏障的SS2数量。体内可促进SS2对小鼠的致病性。进一步研究发现，接种rPPCDC疫苗的小鼠血清中有更高的rPPCDC抗体水平，存活率升高。【结论】PPCDC能够增强血脑屏障通透性，促进SS2对小鼠血脑屏障的破坏和脑部感染，并具有免疫保护效力，为后续SS2致病机制研究和疫苗研发提供新思路。

摘要:【背景】猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)是一种重要的人畜共患病原菌，可引起猪和人的严重感染，导致肺炎和感染性休克，甚至死亡。【目的】尽管多数毒力因子被相继发现，但其致病机制仍不清晰，寻找新的毒力因子或毒力相关基因进一步解析其致病机理依旧迫在眉睫。【方法】基于前期SS2的Tn917转座子插入突变体库的大蜡螟幼虫筛选结果，选取了一株致病性显著下降的插入突变体，其突变基因鉴定为B9H01_RS10315，编码糖基水解酶(glycosyl hydrolase, ghA)。通过构建ghA基因的缺失株(∆ghA)及回补株(C∆ghA)，进行生长观察和体内体外致病力试验，探究ghA参与的致病作用。【结果】相较于野生株，缺失株∆ghA表现出一定的生长缺陷，大蜡螟幼虫24 h致死率下降25%，对上皮细胞的黏附能力下降约50%，在全血中存活能力下降约35%，以及在细菌对细胞10倍和50倍的感染比下被吞噬细胞的吞噬增加约100%和200%。【结论】猪链球菌2型糖基水解酶GhA有助于细菌的生长，并通过促进细菌黏附、血液存活、抗吞噬能力等参与其致病过程。

摘要:【背景】弯曲菌(Campylobacter)是一种重要的食源性病原细菌，在鸡肠道内高水平定殖，鸡天然免疫在该菌定殖中的作用机制尚未解析。【目的】探究鸡天然免疫相关的细胞外脂肪酸结合蛋白(extracellular fatty acid-binding protein, Ex-FABP)通过特异性结合肠杆菌素抑制弯曲菌生长的活性，为宿主发挥天然免疫功能提供理论基础。【方法】通过敲除大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)的entB基因构建不分泌肠杆菌素的表达宿主菌，原核表达纯化鸡Ex-FABP蛋白和人源脂钙蛋白2 (lipocalin-2, Lcn2)，Western blotting鉴定表达蛋白与肠杆菌素特异性结合，分别在富铁和限铁培养条件下，验证Ex-FABP和Lcn2对大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella)及entB基因突变株的抑菌活性，继而通过外源添加肠杆菌素鉴定Ex-FABP和Lcn2对不同宿主源弯曲菌的抑菌活性。【结果】利用构建的宿主菌BL21(DE3)的entB基因突变株，成功表达和纯化Ex-FABP和Lcn2蛋白，体外结合试验证实表达蛋白可与肠杆菌素特异性结合。在限铁培养条件下，Ex-FABP和Lcn2对仅分泌肠杆菌素的大肠杆菌AN102具有显著抑制生长的作用，而对大肠杆菌ATCC 25922、沙门氏菌CVCC 1806、CVCC 1800及对应的entB缺失株均无抑制作用。最后证实Ex-FABP和Lcn2通过特异性结合肠杆菌素对5株不同宿主来源的弯曲菌均有显著抑制生长的作用。【结论】鸡Ex-FABP蛋白具有与Lcn2类似的功能，即在限铁环境下可特异性结合肠杆菌素，通过阻断细菌利用肠杆菌素摄取铁的途径来抑制其生长，发挥宿主天然免疫功能，为开发新型弯曲菌防控策略提供了理论依据。

摘要:【背景】酪蛋白水解蛋白酶L (caseinolytic protease L, ClpL)是热休克蛋白100 (heat shock protein 100, HSP100)家族成员，参与多种细胞内生物学过程包括应激耐受反应、长期存活、毒力和抗生素抗性等，在病原菌的致病过程中发挥重要作用。【目的】阐明HSP100/ClpL对猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株的应激耐受和毒力的影响。【方法】利用温敏自杀质粒pSET4s构建了SsClpL基因缺失株ΔclpL；利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒pSET2构建了互补株CΔclpL；比较亲本株SS2-1、ΔclpL和CΔclpL在各种应激环境(高温、氧化性应激和酸应激)和血液中的生存能力；利用小鼠感染模型和体内竞争试验评价clpL缺失前后细菌的毒力变化。【结果】clpL缺失后，SS2在各种应激环境中的生存能力明显减弱；同时在猪全血中的存活能力也显著降低；对BALB/c小鼠的致病力有所降低，在体内的定殖能力明显降低。【结论】SsClpL与猪链球菌的应激耐受和致病性密切相关。

摘要:【背景】空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是世界范围内最重要的食源性病原菌之一，在家禽盲肠内通常共生定殖，成为感染人的主要来源，目前该菌在家禽肠道内的定殖机制尚未阐明。【目的】探究空肠弯曲菌不同效应蛋白在参与黏附侵袭肠上皮细胞、免疫细胞及激活炎性细胞因子中的作用，解析该菌在鸡肠道内定殖的机制，为其防控提供潜在的作用靶标。【方法】首先利用同源重组技术构建空肠弯曲菌NCTC 11168菌株不同效应蛋白CiaB、CiaC、CiaD和CiaI的基因缺失突变株，测定突变株对细菌生物膜形成和自身凝集能力的影响，进而测定突变株对肠上皮细胞Caco-2的黏附和侵袭能力，以及对鸡巨噬细胞系HD11的侵袭能力，最后利用RT-qPCR鉴定突变株感染HD11细胞对炎性细胞因子表达的影响。【结果】构建空肠弯曲菌不同效应蛋白CiaB、CiaC、CiaD和CiaI的基因缺失突变株；∆ciaD突变株生物膜形成能力降低，∆ciaC、∆ciaD和∆ciaI突变株自身凝集能力增强；∆ciaB突变株黏附侵袭Caco-2细胞能力增强，而∆ciaC、∆ciaD和∆ciaI突变株黏附侵袭Caco-2以及侵袭HD11细胞能力均显著降低；空肠弯曲菌感染HD11显著提高不同炎性细胞因子表达水平，∆ciaB、∆ciaC和∆ciaD突变株显著降低不同炎性因子表达水平，而∆ciaI突变株显著增强不同炎性因子表达水平。【结论】空肠弯曲菌不同Cia效应蛋白在黏附侵袭肠上皮细胞、免疫细胞及激活炎性细胞因子表达中发挥不同的作用，本研究为解析空肠弯曲菌与宿主肠道上皮相互作用机制提供了理论依据，并为该菌的防控提供了潜在靶标。

摘要:【背景】布鲁氏菌(Brucella spp.)是一种兼性胞内寄生菌，能够引起世界范围内的人兽共患流行病——布鲁氏菌病(以下简称布病)。链霉素是治疗布病的推荐药物，但我国已有链霉素耐受分离株(根据CLSI推荐的耐药折点)。【目的】筛选并鉴定羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)链霉素耐受的新基因。【方法】利用转录组筛选羊种布鲁氏菌链霉素耐受新基因，并利用同源重组、分子对接等技术预测并鉴定相关基因的功能。【结果】羊种布鲁氏菌(M5疫苗株)在含2×MIC浓度链霉素培养基上，12 h后通过耐受恢复增殖能力。转录组分析表明，细胞膜组成成分在低浓度链霉素耐受中发挥重要作用，核糖体通路相关基因表达量显著性增加[|log₂FC|≥2.0, P<0.05]，群体感应通路、Ⅳ型分泌系统相关基因表达量显著性降低(|log₂FC|≥2.0, P<0.05)。利用同源重组技术缺失组成Ⅳ型分泌系统的元件，发现缺失virB3和virB5基因后，M5疫苗株链霉素MIC值增高，回补后与亲本株差异不显著。分子对接预测发现，VirB3和VirB5能够通过氢键与链霉素结合。【结论】链霉素主要影响羊种布鲁氏菌细胞膜组分涉及的相关通路。羊种布鲁氏菌通过降低Ⅳ型分泌系统组成元件virB3和virB5基因的表达耐受链霉素。本研究为布鲁氏菌耐药株研究提供了新思路，为布鲁氏菌新药研发提供了候选靶点。

摘要:【背景】结核分枝杆菌牛变种(Mycobacterium tuberculosis variant bovis)可以感染人和多种动物，是重要的人兽共患病原菌。【目的】以结核分枝杆菌牛变种C68001为母本菌株，利用MycoMar T7转座子系统，构建结核分枝杆菌牛变种突变体库，为深入探究结核分枝杆菌牛变种基因功能和致病机制提供技术平台。【方法】以C68001为母本菌株，对其全基因序列进行分析预测；筛选温敏型噬菌体，优化噬菌体扩增条件和侵染条件；获得高库容的结核分枝杆菌牛变种C68001突变体库。【结果】基于Nanopore三代和二代测序技术绘制细菌基因组完成图，C68001的完整基因组大小为4.342 Mb，含有4 093个基因。成功筛选到温敏型噬菌体，并且滴度高于1×10¹¹ PFU/mL，以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10侵染菌株C68001 3 h后获得9 216个单克隆的转座子突变体，随机挑选7个克隆进行PCR鉴定，证实转座子成功插入母本菌株。【结论】成功构建了结核分枝杆菌牛变种C68001的突变体库。

摘要:【背景】猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)感染引起的一种呼吸道疾病，该病死亡率可达80%–100%。干扰素刺激基因15 (interferon-stimulated genes 15, ISG15)蛋白可抑制病毒的复制，但其在APP方面的研究尚不清楚。【目的】构建猪源ISG15原核表达载体，纯化ISG15蛋白并研究其对APP感染的影响。【方法】构建pET-28a-ISG15原核表达载体，纯化获得ISG15蛋白。采用流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测ISG15蛋白处理后肺泡巨噬细胞死亡情况和炎症因子表达水平。建立APP感染小鼠模型，鼻内给药ISG15后，检测小鼠体重、临床症状及存活情况，分析ISG15对APP致病性的影响。【结果】获得了ISG15蛋白。相较于单独攻菌组，ISG15添加组的肺泡巨噬细胞死亡率、炎症因子IL-6和IFN-γ表达水平均显著升高(P<0.05)。在小鼠试验中，相较于单独攻菌组，中剂量和高剂量ISG15组小鼠的临床症状及死亡率显著上升，肺组织IL-6、IFN-γ和IL-1β表达水平显著增加。【结论】ISG15通过促进肺泡巨噬细胞死亡和炎症因子的释放加剧APP的感染，为APP防治技术的研发提供了理论基础。

摘要:【背景】不动杆菌属(Acinetobacter)细菌是医院感染常见的条件致病菌，其耐药菌株的出现对公众的健康构成了严重的威胁。【目的】了解上海市宠物医院环境中不动杆菌属的流行现状及耐药性。【方法】从上海市5个区的5家宠物医院采集环境样品，经细菌分离、纯化后利用细菌鉴定质谱仪鉴定分离株种属，并通过微量肉汤稀释法检测不动杆菌属分离株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，并对其中1株耐碳青霉烯类分离菌进行基因组测序及遗传特征分析。【结果】730份环境样品共分离获得124株革兰氏阴性菌，经鉴定14株属于不动杆菌属，其中9株为鲁氏不动杆菌(A. lwoffii)。14株不动杆菌均对米诺环素敏感，但其中2株皮特不动杆菌(A. pittii)和2株鲁氏不动杆菌为碳青霉烯类多重耐药不动杆菌，5株鲁氏不动杆菌对复方新诺明耐药，1株约氏不动杆菌(A. johnsonii)对环丙沙星耐药。基因组测序结果表明，碳青霉烯类多重耐药皮特不动杆菌携带NDM-1、OXA-500和OXA-727等相关耐药基因，多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)结果表明分离株为ST1037型，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析该菌株与来源于浙江省的临床尿液分离株A. pittii AP43的进化距离最近。【结论】上海市5家宠物医院环境中的不动杆菌分离株耐药率较低(<40%)，存在多重耐药现象(5株不动杆菌分别耐≥3种药物)且皮特不动杆菌携带多种耐药基因。

摘要:【背景】腹泻是导致新生犊牛死亡的主要原因之一，而大肠杆菌(Escherichia coli)作为机会性致病菌是新生犊牛肠道感染的主要病原。尽管常用抗生素对其进行治疗，但大肠杆菌的多血清型及多种抗生素耐药性的增加给治疗带来了极大的困难。【目的】探究吉林省地区牛场犊牛腹泻中大肠杆菌感染的临床症状、毒力基因、血清型、耐药性及系统进化群等流行特征。【方法】采用PCR、药敏试验等方法对大肠杆菌的血清型、毒力因子和耐药性、系统发育进行检测。【结果】从150份病料中分离出92株大肠杆菌，检出率为61.3%；肠道内致病性大肠杆菌主要毒力基因为K88 (10%)、K99 (48%)、F17 (85%)、F41 (20%)、fimH (20%)、csgA (87%)、eaeA (4.5%)、bfpA (5%)、hlyA (4.5%)、hlyE (61.8%)、stx1 (22%)、stx2 (34%)、fyuA (3%)、Sta (15%)、STb (92%)，未检出F6和F18。O血清检测中，86% (79/92)的毒株确定了O抗原血清型，其中O101 (32%)为优势血清型；其次为O103 (15%)。分离菌株多数具有多重耐药性，对氨苄西林、四环素、庆大霉素和链霉素耐药率分别为52.7%、53.3%、40.7%和50%。菌株携带β-内酰胺类ampC (45.21%)、bla_CTX (42.47%)、bla_TEM (56.85%)，四环素类tetA (55.48%)，氨基糖苷类addA (55.48%)、aph(3')-Ia (43.15%)和aphA3 (30.22%)基因。菌株中36株为A1群(24%)，27株为B1群(18%)，6株为B2群(4%)，20株为D群(13.3%)。【结论】吉林省牛场犊牛腹泻大肠杆菌感染率较为严重，多属于A1和B1群，O101为优势血清型，分离株携带多种毒力基因和耐药基因，多重耐药严重。应加强犊牛饲养管理及疫苗免疫，减少抗生素使用。

摘要:【背景】我们前期将新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)强毒株NP03在番鸭胚成纤维细胞(muscovy duck embryo fibroblast, MDEF)上进行传代，选育出NDRV弱毒株S，将强弱毒株p18蛋白进行比对发现弱毒p18蛋白C端缺失35个氨基酸。【目的】制备p18蛋白的多克隆抗体并鉴定NDRV强弱毒株p18蛋白的差异。【方法】采用RT-PCR方法扩增NDRV强弱毒株p18基因编码序列，克隆至原核表达载体pET-28a中诱导表达，用镍柱纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE和Western Blot对纯化蛋白进行鉴定。进一步用纯化的蛋白免疫小鼠制备p18蛋白多克隆抗体，通过间接ELISA、Western Blot和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对制备的多克隆抗体进行检测鉴定NDRV强弱毒株。【结果】对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果表明，分别获得了NDRV强弱毒株p18重组蛋白。对多克隆抗体进行间接ELISA检测，效价达1:51 200。Western Blot鉴定显示，制备的p18蛋白多克隆抗体能特异性检测NDRV强、弱毒株感染细胞后表达的p18蛋白，结果表明，强、弱毒株p18蛋白的分子量有明显差异，分别约为18 kDa和14 kDa。IFA结果表明，制备的p18蛋白多克隆抗体可以特异性识别NDRV强、弱毒复制时表达的p18蛋白。【结论】本研究制备的p18蛋白多克隆抗体可用于NDRV强弱毒株p18蛋白检测，并发现NDRV强、弱毒株p18蛋白存在明显差异，为深入研究NDRV p18蛋白生物学功能及致病机理奠定了基础。

摘要:【背景】近些年来，由于对野生动物保护和生态环境的改善，野猪的数量呈现逐年增长的趋势，甚至在部分地区早已溢出保护的数量，对农业生产造成了一定的影响。野猪抗病性和环境适应性强、肠道微生物较为丰富，具有改良家猪品质的潜在价值，但是国内对野猪肠道菌群的研究与开发均鲜有报道。【目的】探究野猪肠道菌群多样性，同时依据野猪杂食性和抗病性强的特点从野猪肠道中分离益生性能良好的菌株。【方法】分别采集了野猪、外三元杂交猪和新美系商品猪粪便样品各5份，通过菌群多样性分析对比野猪与商品猪肠道菌群组成的差异。从野猪肠道内容物分离筛选具有纤维素酶活力的芽孢杆菌并检验其耐酸、产酶等益生性能。【结果】野猪和外三元猪的肠道菌群α多样性均高于新美系，总体上野猪肠道菌群丰富度最高；在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)在野猪肠道中丰度最高，拟杆菌门(Bacteroidota)和梭杆菌门(Fusobacteriota)分别在外三元猪和新美系猪肠道中丰度最高。在属水平上，野猪肠道中丰度普遍较高的有unclassified_f__Lachnospiraceae、UCG-005、Prevotellaceae_NK3B31_group和瘤胃球菌属(Ruminococcus)等。β聚类分析结果显示3组样品中野猪的肠道样品间菌群的相似性最低，从野猪肠道分离得的多株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)展现出良好的纤维素酶和淀粉酶活力，具有一定的耐酸能力。【结论】野猪的肠道菌群丰富度高于商品猪，野猪肠道中分得的多株贝莱斯芽孢杆菌具有开发为益生菌制剂的潜力。

摘要:【背景】乳酸菌(lactic acid bacteria)作为益生菌可用作动物微生态制剂，家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目的模式昆虫，其肠道内的乳酸菌还有待研究。【目的】从家蚕肠道菌中筛选出性能良好的乳酸菌作为微生态制剂潜力菌株。【方法】通过形态学特征和生化试验筛选出家蚕肠道分离菌中的乳酸菌，结合16S rRNA基因序列分析鉴定到种；通过溶血试验评估其安全性；通过生长曲线及产酸曲线测定其生长特征和产酸情况；通过温度及pH敏感性试验测定其抗逆性；通过测定自聚合能力、疏水能力、病原菌共凝聚能力评估其黏附性；通过药敏试验测定其耐药性，并检测其耐药基因。【结果】从家蚕肠道分离出的56个菌株中筛选出一株乳酸菌A2，经鉴定为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。该菌株不溶血，接种后3−9 h生长迅速且产酸最快；在80 ℃高温条件下仍能存活；pH<4.0时存活率显著下降，但当pH 10.0时存活率>78%，具有极强的耐碱性；黏附性较强，自聚合能力为18%，疏水能力为70%，与大肠杆菌(Escherichia coli)的共凝聚性为32%、与沙门氏菌(Salmonella)的共凝聚性为34%、与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的共凝聚性为40%，对氨苄西林、红霉素和万古霉素有耐药性，对庆大霉素中度敏感，对磺胺异恶唑、氯霉素、四环素和氧氟沙星敏感。此外，从该菌株中检测到4类抗生素的5个耐药基因，它们分别是：β-内酰胺类bla_SHV、bla_TEM、氯霉素类cat、氨基糖苷类aph(3')-IIa和四环素类tetE。【结论】该乳酸菌安全、耐高温、耐碱、黏附性较强，可作为后续开发微生物发酵饲料及家蚕微生态制剂的菌种，为肠道益生菌的开发利用提供科学依据和优质资源。

摘要:【背景】天然免疫应答作为机体的第一道免疫防御屏障，在动物抵抗病原微生物感染的初始阶段发挥着关键作用。从驯化免疫的角度，增强动物天然免疫，提高动物抗病能力是预防控制疾病的有效措施。【目的】从猪肠道菌群中筛选分离具有潜在驯化免疫作用的细菌，为挖掘新的免疫刺激物奠定基础。【方法】从健康猪粪便中分离纯化细菌，选择大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫驯化免疫模型用于筛选肠道共生菌，对有潜在驯化免疫功能的细菌进行16S rRNA基因序列鉴定和生长曲线的测定，并利用小鼠模型对细菌进行体内驯化效果评价。【结果】通过使用大蜡螟幼虫模型，我们筛选出了一株具有诱导驯化免疫能力的屎肠球菌(Enterococcus faecium) SC-2；通过小鼠模型进一步证实菌株SC-2预刺激可以提高小鼠外周血与肺脏中的中性粒细胞和巨噬细胞占比，显著降低猪链球菌(Streptococcus suis)感染后其主要脏器中的菌载量，显著提高小鼠存活率。【结论】屎肠球菌SC-2具有诱导驯化免疫的作用，该菌株的分离鉴定为免疫调控新成分的挖掘提供了基础。

摘要:【背景】猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)可导致严重的肺脏炎性损伤。细胞氧化应激与肺脏炎性损伤密切相关，但是APP感染和细胞氧化应激之间的关系仍不清楚。【目的】明确APP感染和细胞氧化应激之间的关系并对其机制进行初步探索，从而为进一步阐明APP致病机理奠定基础。【方法】APP野生菌5b (5b WT)和Adh基因缺失菌(5bΔAdh)分别感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage, PAM)后，荧光显微镜观察细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，RT-qPCR和Western blotting检测氧化应激相关分子的表达变化，利用NLRP3炎性体抑制剂MCC950处理细胞，分别感染5b WT和5bΔAdh后，生化反应法检测细胞内乳酸和丙酮酸含量，流式细胞术检测细胞内ROS水平及线粒体膜电位变化情况；采用tandem mass tag (TMT)标记定量蛋白质组学测序分析细胞蛋白表达变化并检测线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)的释放情况。【结果】免疫荧光和流式细胞术检测结果均显示，5b WT组ROS水平明显高于5bΔAdh组，但经MCC950处理后可以逆转这一上升趋势；生化指标检测结果表明，相较于5bΔAdh组，5b WT组的丙酮酸和乳酸的含量下降更显著，而且经过MCC950抑制NLRP3活性后，细菌感染组的丙酮酸和乳酸的含量均有显著回升，与对照组无显著差异；5b WT和5bΔAdh感染后，猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage, PAM)中氧化应激关键转录因子核转录因子红系2相关因子2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)和GCLM均呈现出下降的趋势；Western blotting结果表明5b WT和5bΔAdh组烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (nicotinamide adenine dinucleotide oxidase 2, NOX2)含量增高，并且5b WT组含量升高更明显；蛋白质组学分析表明共有15个蛋白的表达出现显著变化，GO分析发现这些差异蛋白主要参与ATP代谢、嘌呤代谢、炎症等重要生物学过程，KEGG分析发现这些蛋白与炎症调节、能量转运和氧化磷酸化等相关的信号通路密切相关；重要的是5b WT和5bΔAdh感染PAM后，线粒体受损细胞比例分别为69.6%和58.5%，均高于对照组，mtDNA也大量释放到细胞质中。【结论】APP可以通过Adh引起PAM氧化应激，并且NLRP3炎性体活化参与细胞氧化应激的形成。

摘要:【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)能够引起禽类气囊炎、心包炎等症状，严重制约养禽业的健康发展。同时，APEC与人类肠道外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)具有相似的毒力因子，严重威胁公共卫生。APEC形成生物被膜可抵抗抗生素杀伤及逃避宿主免疫。因此，探究APEC生物被膜形成的关键基因和调控机制，对于防控APEC具有重要的理论和实践意义。【目的】探讨外膜蛋白CsgG在APEC生物被膜形成中的作用，揭示APEC生物被膜形成的分子机制，为禽大肠杆菌病的防治提供理论基础。【方法】利用Red同源重组技术构建的csgG基因缺失株ΔcsgG及其互补株CΔcsgG，分析了csgG对APEC生长、运动能力、膜通透性、胞外多糖(extracellular polysaccharides, EPS)产量及生物被膜形成能力的影响。【结果】csgG的缺失并不影响APEC的生长和细胞膜的通透性，但增强了APEC的运动性。csgG的缺失显著降低了APEC生物被膜形成能力，扫描电子显微镜观察发现缺失株生物被膜细菌组成由多层变为单层，细菌间黏附减少。激光扫描共聚焦显微镜观察发现csgG的缺失导致生物被膜结构松散，黏附的细菌数量减少，同时发现csgG缺失显著降低APEC的EPS产量。实时荧光定量PCR分析显示，csgG的缺失导致与生物被膜形成相关基因的转录水平显著降低。【结论】CsgG在APEC生物被膜形成过程中起着关键作用，严重影响生物被膜结构的完整性。

摘要:【背景】尽管已有多种人和鼠细胞系可以作为布鲁氏菌(Brucella)的体外侵染模型，但目前仍缺乏能够准确模拟其在体内感染过程的大动物体外细胞模型。【目的】获得具有单一克隆特性的、能稳定传代的山羊肺泡巨噬细胞系，优化布鲁氏菌体外侵染山羊细胞系模型。【方法】在无菌环境下用PBS灌洗山羊肺脏，分离得到原代山羊肺泡巨噬细胞；采用转染SV40大T抗原(SV40 large T antigen, SV40LT)、嘌呤霉素抗性筛选的方法建立了永生化山羊肺泡巨噬细胞系；使用细胞免疫荧光和流式细胞术检测单核巨噬细胞表面特征性标志物分化抗原簇14 (cluster of differentiation antigen 14, CD₁₄)，利用鸡红细胞吞噬实验检测其吞噬能力；随后将布鲁氏菌(Brucella) M5疫苗株侵染该细胞系，在不同时期统计胞内活菌数。【结果】成功分离并构建了山羊肺泡巨噬细胞系，并且具有典型的巨噬细胞形态学特征，呈现不规则形状，有伪足伸出，胞体较大，吞噬能力强；体外培养10 d，有95.40%原代细胞特异性表达CD₁₄，永生化后仍有92.4%的细胞特异性表达CD₁₄；相较于另外3种细胞，永生化后的肺泡巨噬细胞对布鲁氏菌敏感性与RAW264.7细胞近似，高于绵羊间质睾丸细胞(sheep testicular interstitial cell, STIC)。【结论】成功建立永生化山羊肺泡巨噬细胞系，该细胞系为研究布鲁氏菌的致病机制及免疫逃逸机制提供了体外试验对象。

摘要:【背景】分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲、可呈分枝状生长的杆菌，部分严重威胁人类和动物健康；噬菌体因其高效特异及易于制备的特性，成为抗生素替代疗法的研究热点。【目的】分离鉴定耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体并对其进行生物学特性分析，评价其在不同环境下的适应能力及体外抑菌能力。【方法】以耻垢分枝杆菌mc²155为宿主菌，从奶牛场污水、粪便、土壤、垫料中分离纯化烈性噬菌体，并对其进行生物学特性研究。【结果】分离纯化鉴定并获得4株耻垢分枝杆菌噬菌体，分别命名为MP2201、MP2202、MP2203、MP2204，其效价分别为1×10⁸、5×10⁸、3×10⁸、1×10⁸ PFU/mL；透射电子显微镜结果显示，4株噬菌体均属于长尾噬菌体；MP2204最佳感染复数为1，其余3种噬菌体最佳感染复数均为0.1；噬菌体MP2201暴发量最高，可达500 PFU/cell；4株噬菌体在40−60 ℃时均可稳定存活，当pH 3.0−11.0时，效价变化不显著；制备噬菌体鸡尾酒能够显著抑制宿主菌生长；噬菌体全基因组测序结果表明：MP2201、MP2202、MP2203和MP2204的基因组全长分别为69 720、68 282、47 622和70 950 bp，G+C含量分别为59.14%、66.58%、63.22%和59.02%，并且不含耐药基因。【结论】分离鉴定4株耻垢分枝杆菌噬菌体，为开发针对分枝杆菌感染的新型生物防治手段提供了生物材料和理论依据。

摘要:【背景】2015年以来，我国东部沿海地区陆续暴发樱桃谷鸭等商品肉鸭以短喙、舌外伸肿大、生长发育不良、腿骨易折等为主要临床症状的疾病，并逐步向内陆蔓延，研究发现引起该病的病原为新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus, NDPV)。【目的】开展流行病学调查，研究NDPV的遗传进化特征，为了解NDPV遗传演化规律，完善NDPV流行病学数据及致病机制的研究提供科学依据。【方法】取发病雏鸭的肝脏研磨、离心后取上清，使用SPF鸭胚成功分离病毒并测其含量，对分离的病毒进行PCR鉴定及外源病毒检测，扩增病毒全基因组并进行序列同源性分析，对VP1蛋白进行分子特征和遗传进化分析。【结果】从山东省某鸭场疑似短喙侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome, SBDS)的病料中分离到一株NDPV，命名为SDGT0628。该分离株在SPF鸭胚上培养可导致鸭胚出现特异性死亡，测得鸭胚半数致死量(DELD₅₀)为10^−4.5/0.2 mL。全基因组核苷酸序列和VP1蛋白氨基酸序列同源性分析结果发现：分离株SDGT0628与2023年分离株TX2302全基因组核苷酸序列相似性最高为99.8%，与SD0101和LYG23的核苷酸同源性次之，为99.7%，VP1蛋白氨基酸序列与2018年分离株SD0101相似性为99.9%；SDGT0628与鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)的同源性较番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus, MDPV)高。全基因组核苷酸序列系统发育树表明，SDGT0628与NDPV形成一个独立的小分支，证明GPV在不断地进化。与GPV VP1蛋白氨基酸序列比对结果发现，13株NDPV (含SDGT0628株)有Q89L、D142E、S450N这3个氨基酸位点的共同变异；分离株SDGT0628在497位氨基酸位点产生突变(W→R)，其他NDPV和GPV未产生此差异。本实验室新分离出5株NDPV，与SDGT0628株VP1氨基酸序列突变位点进行比较，5株NDPV均存在89、142、450位点突变。【结论】从山东省某鸭场中分离得到了一株NDPV，命名为SDGT0628株(GenBank登录号PQ316314)。VP1蛋白的氨基酸序列分析发现，NDPV存在3个氨基酸位点的突变，SDGT0628在497位氨基酸位点产生了新的突变。

摘要:【背景】实验动物中不断发现干扰科学研究的新病原体，库氏棒杆菌(Corynebacterium kutscheri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为影响实验动物健康的病原微生物，是国标中要求的必检微生物。本研究从吉林大学实验动物中心饲养的无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)级小鼠体内分离到1株疑似库氏棒杆菌和1株疑似铜绿假单胞菌。【目的】鉴定这些病原微生物的种类、生物学特性、系统发育关系及基因组特征，为该病原微生物标准物质的研制及检测评价技术体系的建立提供生物资源并奠定基础。【方法】采用革兰氏染色、药敏试验、生理生化等方法对病原生物学特征进行鉴定；结合PCR鉴定、系统发育分析、全基因组测序、生物信息学等技术明确该菌的遗传学特征。【结果】形态观察、16S rRNA基因序列、基因组分析及系统发育分析证实，该分离菌株分别被鉴定为库氏棒杆菌CCPM-B-B-019-2402-1和铜绿假单胞菌CCPM-B-B-013-2402-3；药敏试验表明，库氏棒杆菌CCPM-B-B-019-2402-1对苯唑西林、呋喃妥因和苄青霉素耐药，铜绿假单胞菌CCPM-B-B-013-2402-3对替卡西林/克拉维酸和替加环素耐药，对头孢他啶、环丙沙星、左氧氟沙星等9种抗生素敏感；全基因组测序结果表明，库氏棒杆菌CCPM-B-B-019-2402-1携带有fagA、fagB、fagC、fagD等重要毒力基因，铜绿假单胞菌CCPM-B-B-013-2402-3携带有plcB、tse6、tse5等毒力基因。【结论】对SPF级小鼠气管组织和盲肠内容中分离出的2株病原菌进行了鉴定，并对2株病原菌进行了基因组特征分析，该研究为实验动物病原细菌标准株的建立，以及实验动物病原标准物质的研制和实验动物的质量控制提供了重要资源和支撑。