摘要:D-甘露醇广泛应用于食品、制药、化学品工业等领域。从野生型大肠杆菌出发，将来自假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291菌株的甘露醇脱氢酶与果糖转运蛋白编码基因整合到大肠杆菌ATCC 8739的染色体中，并失活其他的发酵途径 (丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、富马酸还原酶、乙醇脱氢酶、甲基乙二醛合成酶和丙酮酸氧化酶) ，构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株。使用无机盐培养基和葡萄糖果糖作为混合碳源，厌氧发酵6 d，D-甘露醇产量达1.2 mmol/L。基于细胞生长和D-甘露醇合成的偶联，进一步通过代谢进化技术提高细胞合成D-甘露醇的生产能力。经过80代的驯化，D-甘露醇产量提高了2.6倍，甘露醇脱氢酶的活性提高了2.8倍。构建获得的遗传稳定的工程菌能直接发酵糖生产D-甘露醇，不需添加抗生素、诱导剂和甲酸，在工业化生产时有一定优势。

摘要:D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶LpMDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖脱氢酶BaGDH,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中共表达,实现了基于双酶级联反应催化底物D-果糖合成D-甘露醇,D-甘露醇的初步摩尔转化率为59.7%。针对双酶级联催化反应中辅酶再生用酶与催化用酶表达量不协调的问题,通过增加Bagdh拷贝量来提高辅因子循环能力,获得了双酶催化速率平衡的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh。进一步对重组菌的全细胞转化条件进行优化,确定了最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值6.5,菌体量OD600=30,底物D-果糖100.0 g/L,辅底物葡萄糖与底物1︰1摩尔当量。于最优转化条件下5 L发酵罐转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9g/L,摩尔转化率为81.9%。本研究提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。

摘要:D-甘露糖具有多种功能活性，在食品、医药、农业等行业应用广泛。D-甘露醇氧化酶可以高效地将D-甘露醇转化为D-甘露糖，在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。从类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) HGF5中发掘出一个D-甘露醇氧化酶(PsOX)，与天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的D-甘露醇氧化酶(AldO)氨基酸序列相似性为50.94%，分子量约为47.4 kDa，构建了重组表达质粒pET-28a-PsOX并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，PsOX对D-甘露醇的Km、kcat/Km值分别为5.6 mmol/L、0.68 L/(s∙mmol)，最适pH和温度分别为7.0和35 ℃，在60 ℃以下保持稳定。PsOX对400 mmol/L D-甘露醇的摩尔转化率为95.2%。利用PsOX与AldO全细胞分别催化73 g/L D-甘露醇，PsOX反应9 h后反应完全，生成70 g/L D-甘露糖，相较于AldO具有更高的催化效率。PsOX作为新型D-甘露糖氧化酶为D-甘露糖的酶法制备提供了依据。