科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2025年第41卷第1期
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2025,41(1), DOI: 10.13345/j.cjb.250034
摘要：
2025,41(1):1-78, DOI: 10.13345/j.cjb.241014
摘要：
本文对2023–2024年《生物工程学报》发表的合成生物制造相关的综述和研究论文进行了评述，内容涉及底盘细胞，基因(组)编辑，设施、工具和方法，生物传感器，蛋白质设计与改造，肽与蛋白质，酶的筛选、表达、表征和改造，生物催化，生物活性物，植物天然产物，微生物天然产物，微生物资源开发与生物农药，甾体化合物，氨基酸及衍生物，维生素及衍生物，核苷，糖、糖醇、寡糖、多糖和糖脂，有机酸和生物基材料单体，高聚物材料生物降解与生物可降解材料，肠道微生物、活菌药物与合成微生物组，微生物抗逆工程，木质纤维素的生物降解和转化利用，一碳生物技术，生物电子转移与生物氧化还原，生物环保，合成生物制造的风险和监管等26个方面的数百种技术和产品，以期为读者了解合成生物制造相关研发和产业化的最新进展情况提供参考。
本文对2023–2024年《生物工程学报》发表的合成生物制造相关的综述和研究论文进行了评述，内容涉及底盘细胞，基因(组)编辑，设施、工具和方法，生物传感器，蛋白质设计与改造，肽与蛋白质，酶的筛选、表达、表征和改造，生物催化，生物活性物，植物天然产物，微生物天然产物，微生物资源开发与生物农药，甾体化合物，氨基酸及衍生物，维生素及衍生物，核苷，糖、糖醇、寡糖、多糖和糖脂，有机酸和生物基材料单体，高聚物材料生物降解与生物可降解材料，肠道微生物、活菌药物与合成微生物组，微生物抗逆工程，木质纤维素的生物降解和转化利用，一碳生物技术，生物电子转移与生物氧化还原，生物环保，合成生物制造的风险和监管等26个方面的数百种技术和产品，以期为读者了解合成生物制造相关研发和产业化的最新进展情况提供参考。
2025,41(1):79-91, DOI: 10.13345/j.cjb.240400
摘要：
抗生素是由微生物产生或人工合成的具有杀菌或抑菌活性的化学物质，被广泛应用于临床治疗以及畜牧业和水产养殖行业中，使得土壤、水体和食品等环境中抗生素的残留问题非常突出；与此同时，抗生素耐药性问题日益严重，新型抗生素的开发迫在眉睫。全细胞生物传感器可以利用微生物细胞将抗生素信号转换为可读信号，不仅能够简单快速、灵敏准确地对抗生素进行动态检测，还能有效地发现新型抗生素。本文对目前报道的抗生素全细胞生物传感器进行了全面的梳理和总结，将其分为特异型和广谱型两大类型，并重点阐述了两大类型抗生素生物传感器的设计原理与应用实例，为其他抗生素全细胞生物传感器的构建及应用提供了借鉴。
抗生素是由微生物产生或人工合成的具有杀菌或抑菌活性的化学物质，被广泛应用于临床治疗以及畜牧业和水产养殖行业中，使得土壤、水体和食品等环境中抗生素的残留问题非常突出；与此同时，抗生素耐药性问题日益严重，新型抗生素的开发迫在眉睫。全细胞生物传感器可以利用微生物细胞将抗生素信号转换为可读信号，不仅能够简单快速、灵敏准确地对抗生素进行动态检测，还能有效地发现新型抗生素。本文对目前报道的抗生素全细胞生物传感器进行了全面的梳理和总结，将其分为特异型和广谱型两大类型，并重点阐述了两大类型抗生素生物传感器的设计原理与应用实例，为其他抗生素全细胞生物传感器的构建及应用提供了借鉴。
2025,41(1):92-116, DOI: 10.13345/j.cjb.240237
摘要：
蛋白质是生命活动的主要载体，承担着多种复杂而又精巧的催化、输运、调控等生物学功能。这些功能的发挥与蛋白质折叠过程、配体分子的作用以及自身构象转变有着紧密联系。本文从纳米孔单分子水平出发，系统总结了蛋白质在纳米孔检测领域的研究内容和最新进展，包括不同多肽、蛋白质的分子识别，蛋白质折叠过程的构象变化，不同蛋白质的pH响应性，蛋白质与不同分子的相互作用以及纳米孔用于蛋白质测序的应用进展。基于纳米孔单分子技术对蛋白质结构和功能进行研究对探究生命活动本质规律，进而对实现疾病的早期诊断和药物设计的精准治疗具有十分重要的意义。
蛋白质是生命活动的主要载体，承担着多种复杂而又精巧的催化、输运、调控等生物学功能。这些功能的发挥与蛋白质折叠过程、配体分子的作用以及自身构象转变有着紧密联系。本文从纳米孔单分子水平出发，系统总结了蛋白质在纳米孔检测领域的研究内容和最新进展，包括不同多肽、蛋白质的分子识别，蛋白质折叠过程的构象变化，不同蛋白质的pH响应性，蛋白质与不同分子的相互作用以及纳米孔用于蛋白质测序的应用进展。基于纳米孔单分子技术对蛋白质结构和功能进行研究对探究生命活动本质规律，进而对实现疾病的早期诊断和药物设计的精准治疗具有十分重要的意义。
2025,41(1):117-130, DOI: 10.13345/j.cjb.240227
摘要：
鞭毛作为细菌主要的运动器官，是细菌表面重要的蛋白质结构，在细菌运动、趋化性、致病性以及环境感知等方面发挥着重要作用。随着细菌显微追踪技术的发展以及鞭毛可视化工具的开发应用，鞭毛新的运动形态和在细菌生理活动中更加详细的功能作用被逐步发现。本文主要综述了鞭毛可视化方法以及基于此方法对鞭毛功能的研究进展，为研究鞭毛功能提供了更多的思路，为未来其在抑制细菌传播和治疗细菌感染等领域的应用提供了理论基础。
鞭毛作为细菌主要的运动器官，是细菌表面重要的蛋白质结构，在细菌运动、趋化性、致病性以及环境感知等方面发挥着重要作用。随着细菌显微追踪技术的发展以及鞭毛可视化工具的开发应用，鞭毛新的运动形态和在细菌生理活动中更加详细的功能作用被逐步发现。本文主要综述了鞭毛可视化方法以及基于此方法对鞭毛功能的研究进展，为研究鞭毛功能提供了更多的思路，为未来其在抑制细菌传播和治疗细菌感染等领域的应用提供了理论基础。
2025,41(1):131-147, DOI: 10.13345/j.cjb.240265
摘要：
腈水解酶作为一种重要的生物催化剂广泛应用于重要医药中间体的合成，它能高效地将腈基转化为酸和氨，其反应具有温和、绿色环保等优点。腈水解酶不仅具有催化腈生成对应羧酸产物的水解活性，即表现出催化专一性，还兼具催化腈生成酰胺的水合活力，即表现出催化混乱性。腈水解酶的催化混乱性具有两面性：酰胺副产物的存在增加了后续羧酸产物分离纯化的难度和成本；但若能精准调控腈水解酶的催化反应路径实现酶功能的重塑，可以拓宽腈水解酶生物催化的反应类型，为高值酰胺类化合物的生物合成提供新思路和工艺，这对人工酶的创制及生物催化均具有重要意义。本文结合近年来相关的研究成果，综述了当前腈水解酶催化混乱性的研究进展，并从腈水解酶的进化起源、催化结构域以及催化机理等方面，探讨可能影响腈水解酶催化混乱性关键调控因子，为腈水解酶在生物催化领域上的应用提供了借鉴和参考。
腈水解酶作为一种重要的生物催化剂广泛应用于重要医药中间体的合成，它能高效地将腈基转化为酸和氨，其反应具有温和、绿色环保等优点。腈水解酶不仅具有催化腈生成对应羧酸产物的水解活性，即表现出催化专一性，还兼具催化腈生成酰胺的水合活力，即表现出催化混乱性。腈水解酶的催化混乱性具有两面性：酰胺副产物的存在增加了后续羧酸产物分离纯化的难度和成本；但若能精准调控腈水解酶的催化反应路径实现酶功能的重塑，可以拓宽腈水解酶生物催化的反应类型，为高值酰胺类化合物的生物合成提供新思路和工艺，这对人工酶的创制及生物催化均具有重要意义。本文结合近年来相关的研究成果，综述了当前腈水解酶催化混乱性的研究进展，并从腈水解酶的进化起源、催化结构域以及催化机理等方面，探讨可能影响腈水解酶催化混乱性关键调控因子，为腈水解酶在生物催化领域上的应用提供了借鉴和参考。
2025,41(1):148-172, DOI: 10.13345/j.cjb.240257
摘要：
我国原油对外依存度高，强化原油自给是保障国家能源稳定与持续发展的关键环节。三次采油技术特别是聚合物驱技术已在我国大型油田中实现了广泛应用，其可以在水驱基础上增加15%−20%的采收率。然而，目前广泛应用的驱油聚合物具有不耐温耐盐、单体合成路径复杂、不环保的问题，且聚合物驱后会造成油藏低渗层段孔隙堵塞、非均质性加剧、剩余油资源高度分散、注入井压力升高、注入介质低效循环等问题，制约了聚合物驱后老油田的后续采收。本文通过系统调研分析聚合物驱技术发展历史及现状，创新生物制造技术制备开发驱油聚合物及其单体或单体原料的生物合成技术，以及实现复合驱低成本生物基化学品原料的绿色生物制造，深入研究微生物发酵产物与聚合物驱技术之间的关联，结合微生物制备生物酶用于聚合物生产及聚合物驱后解堵以及微生物代谢产物生物表面活性剂、有机酸、有机醇、生物气、氨基酸等对聚合物驱和聚合物驱后提升油藏采收率的系统讨论分析，提出聚合物驱及聚合物驱后未来发展路径，为保证我国原油高产稳产提供了重要参考。
我国原油对外依存度高，强化原油自给是保障国家能源稳定与持续发展的关键环节。三次采油技术特别是聚合物驱技术已在我国大型油田中实现了广泛应用，其可以在水驱基础上增加15%−20%的采收率。然而，目前广泛应用的驱油聚合物具有不耐温耐盐、单体合成路径复杂、不环保的问题，且聚合物驱后会造成油藏低渗层段孔隙堵塞、非均质性加剧、剩余油资源高度分散、注入井压力升高、注入介质低效循环等问题，制约了聚合物驱后老油田的后续采收。本文通过系统调研分析聚合物驱技术发展历史及现状，创新生物制造技术制备开发驱油聚合物及其单体或单体原料的生物合成技术，以及实现复合驱低成本生物基化学品原料的绿色生物制造，深入研究微生物发酵产物与聚合物驱技术之间的关联，结合微生物制备生物酶用于聚合物生产及聚合物驱后解堵以及微生物代谢产物生物表面活性剂、有机酸、有机醇、生物气、氨基酸等对聚合物驱和聚合物驱后提升油藏采收率的系统讨论分析，提出聚合物驱及聚合物驱后未来发展路径，为保证我国原油高产稳产提供了重要参考。
2025,41(1):173-198, DOI: 10.13345/j.cjb.240335
摘要：
近年来，随着合成生物学的飞速发展，基因工程和分子操作手段日益完善。微藻作为微生物细胞工厂的代表性宿主菌株之一，在生产油脂、色素、蛋白质和生物燃料等高附加值生物产品方面得到了广泛的应用，并在生化能源、食品药品以及环境保护等领域展现出广阔的应用前景。然而，目前基于微藻工艺的生产效率仍然很低，限制了其大规模的工业应用。除了改良菌种和优化培养外，基于外源化学添加剂进行调控也是一种有益的优化策略。这种方法依赖于直接的表型筛选，不需要深入解析生物产品合成过程中涉及的代谢和分解代谢途径中的分子靶点，就可以快速提高微藻高附加值生物产品的产量，获得所需的表型。虽然已有大量关于使用外源添加剂等替代手段来提高微藻生长和高附加值生物产品的产量的研究，但关于添加剂的种类、用途和所针对的菌株以及相关的分子作用机制的分类总结还不够系统和全面。本综述对近年来应用化学诱导剂或增强剂来改善微藻培养中细胞生长和高附加值生物产物积累的实例进行总结，重点介绍了用于微藻培养的外源添加剂的种类、外源添加剂及其组合对微藻生长和高价值生物产品积累的影响以及相关作用的分子机制，为研究人员利用合成生物学的方法来开发合适的细胞底盘以及利用微藻来进行大规模的工业化生产提供了有用的信息。
近年来，随着合成生物学的飞速发展，基因工程和分子操作手段日益完善。微藻作为微生物细胞工厂的代表性宿主菌株之一，在生产油脂、色素、蛋白质和生物燃料等高附加值生物产品方面得到了广泛的应用，并在生化能源、食品药品以及环境保护等领域展现出广阔的应用前景。然而，目前基于微藻工艺的生产效率仍然很低，限制了其大规模的工业应用。除了改良菌种和优化培养外，基于外源化学添加剂进行调控也是一种有益的优化策略。这种方法依赖于直接的表型筛选，不需要深入解析生物产品合成过程中涉及的代谢和分解代谢途径中的分子靶点，就可以快速提高微藻高附加值生物产品的产量，获得所需的表型。虽然已有大量关于使用外源添加剂等替代手段来提高微藻生长和高附加值生物产品的产量的研究，但关于添加剂的种类、用途和所针对的菌株以及相关的分子作用机制的分类总结还不够系统和全面。本综述对近年来应用化学诱导剂或增强剂来改善微藻培养中细胞生长和高附加值生物产物积累的实例进行总结，重点介绍了用于微藻培养的外源添加剂的种类、外源添加剂及其组合对微藻生长和高价值生物产品积累的影响以及相关作用的分子机制，为研究人员利用合成生物学的方法来开发合适的细胞底盘以及利用微藻来进行大规模的工业化生产提供了有用的信息。
2025,41(1):199-215, DOI: 10.13345/j.cjb.240350
摘要：
石油烃污染已成为全球环境问题之一，对环境和人类健康造成严重威胁。在石油烃污染环境修复过程中，微生物修复起着至关重要的作用。然而，被石油烃污染的环境中存在着多种胁迫因素，这些因素限制了微生物修复的效率。本文综述了石油烃污染环境中常见的胁迫因素，以及微生物对这些因素的响应机制，重点探讨了提高石油烃降解微生物耐受性的方法，如非理性改造、基于系统生物学工具或耐受机制进行理性改造、构建微生物混菌体系等。这些方法的应用有望提高微生物在石油烃污染环境中的生存能力和修复效率，为环境修复提供新的思路和技术支持。
石油烃污染已成为全球环境问题之一，对环境和人类健康造成严重威胁。在石油烃污染环境修复过程中，微生物修复起着至关重要的作用。然而，被石油烃污染的环境中存在着多种胁迫因素，这些因素限制了微生物修复的效率。本文综述了石油烃污染环境中常见的胁迫因素，以及微生物对这些因素的响应机制，重点探讨了提高石油烃降解微生物耐受性的方法，如非理性改造、基于系统生物学工具或耐受机制进行理性改造、构建微生物混菌体系等。这些方法的应用有望提高微生物在石油烃污染环境中的生存能力和修复效率，为环境修复提供新的思路和技术支持。
2025,41(1):216-229, DOI: 10.13345/j.cjb.240376
摘要：
我国植物油料产需缺口大，严重依赖进口。二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)与磷脂:二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase,PDAT)是负责三酰甘油合成并影响植物油脂产量和品质的两个关键酶。本文综述了DGAT与PDAT基因的国内外研究进展，重点总结了二者在油料植物油脂合成中的生物学功能，在逆境胁迫下影响植物脂质代谢与生长发育的分子机制，以及合成生物学背景下DGAT和PDAT基因在驱动油脂合成中的重要作用，同时对深入开展DGAT和PDAT基因的机理研究与应用进行了展望，为深入了解植物油脂合成的分子机制，利用DGAT和PDAT基因改良油料作物品质、提高油料产能提供了依据。
我国植物油料产需缺口大，严重依赖进口。二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)与磷脂:二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase,PDAT)是负责三酰甘油合成并影响植物油脂产量和品质的两个关键酶。本文综述了DGAT与PDAT基因的国内外研究进展，重点总结了二者在油料植物油脂合成中的生物学功能，在逆境胁迫下影响植物脂质代谢与生长发育的分子机制，以及合成生物学背景下DGAT和PDAT基因在驱动油脂合成中的重要作用，同时对深入开展DGAT和PDAT基因的机理研究与应用进行了展望，为深入了解植物油脂合成的分子机制，利用DGAT和PDAT基因改良油料作物品质、提高油料产能提供了依据。
2025,41(1):230-241, DOI: 10.13345/j.cjb.240242
摘要：
甲酸是一种重要的太阳燃料，具有很高的生物转化应用前景，尤其是与光合微藻相结合，理论上能最大化人工与生物光合成的优势。然而甲酸对微藻光合电子传递具有明显的抑制，限制了其应用，常规的改造和定向进化策略耗时且普适性不高。本文介绍了一条新的甲酸在光合微藻培养过程中的应用路线，通过将一株分离自微藻高甲酸进化过程的窄食单胞菌或其发酵产物与微藻进行共培养，解除了50 mmol/L甲酸根对莱茵衣藻光合活性的抑制，促进其光合生长，极大提升了胞内蛋白含量(约50%)。初步测试表明，这一策略也同样适用于小球藻和集胞藻，具有普适性。这一策略的提出有望打破甲酸介导的人工-生物杂化光合成技术瓶颈，建立更普适和高效的太阳光能驱动二氧化碳还原制备蛋白质的大宗生物质工艺。
甲酸是一种重要的太阳燃料，具有很高的生物转化应用前景，尤其是与光合微藻相结合，理论上能最大化人工与生物光合成的优势。然而甲酸对微藻光合电子传递具有明显的抑制，限制了其应用，常规的改造和定向进化策略耗时且普适性不高。本文介绍了一条新的甲酸在光合微藻培养过程中的应用路线，通过将一株分离自微藻高甲酸进化过程的窄食单胞菌或其发酵产物与微藻进行共培养，解除了50 mmol/L甲酸根对莱茵衣藻光合活性的抑制，促进其光合生长，极大提升了胞内蛋白含量(约50%)。初步测试表明，这一策略也同样适用于小球藻和集胞藻，具有普适性。这一策略的提出有望打破甲酸介导的人工-生物杂化光合成技术瓶颈，建立更普适和高效的太阳光能驱动二氧化碳还原制备蛋白质的大宗生物质工艺。
2025,41(1):242-255, DOI: 10.13345/j.cjb.240190
摘要：
l-瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，在人体健康方面发挥着重要作用，具有很大的市场需求。尽管微生物细胞工厂已被广泛用于生物合成，但在l-瓜氨酸生物合成方面仍存在着遗传不稳定和效率低等挑战。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株构建了一株高效、无质粒、无需诱导的l-瓜氨酸生产菌株。首先阻断l-瓜氨酸降解并解除反馈抑制，构建出l-瓜氨酸合成底盘菌株，其产量达到0.43 g/L。随后采用推拉抑制策略增强了l-瓜氨酸生物合成，使产量提高到6.0 g/L。接着，强化了NADPH合成和l-瓜氨酸转运系统以提高合成效率，最终l-瓜氨酸产量达到11.6 g/L。最后，在3 L发酵罐中进行分批补料发酵，l-瓜氨酸产量达到44.9 g/L。本研究为l-瓜氨酸的工业化生产奠定了基础，为其他氨基酸代谢网络的改造提供了思路。
l-瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，在人体健康方面发挥着重要作用，具有很大的市场需求。尽管微生物细胞工厂已被广泛用于生物合成，但在l-瓜氨酸生物合成方面仍存在着遗传不稳定和效率低等挑战。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株构建了一株高效、无质粒、无需诱导的l-瓜氨酸生产菌株。首先阻断l-瓜氨酸降解并解除反馈抑制，构建出l-瓜氨酸合成底盘菌株，其产量达到0.43 g/L。随后采用推拉抑制策略增强了l-瓜氨酸生物合成，使产量提高到6.0 g/L。接着，强化了NADPH合成和l-瓜氨酸转运系统以提高合成效率，最终l-瓜氨酸产量达到11.6 g/L。最后，在3 L发酵罐中进行分批补料发酵，l-瓜氨酸产量达到44.9 g/L。本研究为l-瓜氨酸的工业化生产奠定了基础，为其他氨基酸代谢网络的改造提供了思路。
2025,41(1):256-270, DOI: 10.13345/j.cjb.240205
摘要：
O-乙酰-l-高丝氨酸(O-acetyl-l-homoserine,OAH)是一种平台化合物，可用于生产l-蛋氨酸和其他有价值的化合物，但产量低和转化率低等问题限制了其工业化生产和应用。为了解决这一问题，本研究以前期构建的l-高丝氨酸宿主大肠杆菌HS33为底盘，采用系统代谢工程策略构建了一株高产OAH的菌株。首先，强化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)积累、丙酮酸利用以及OAH合成途径(过表达aspB、aspA、thrAC1034T)，获得积累13.37 g/L OAH的初始菌株；随后，整合筛选的辅因子供应基因解决还原力和能量供应问题，将产量提升至15.79 g/L；之后，进一步强化乙酸回用途径，改善乙酰辅酶A供应，结合多源乙酰基转移酶MetX表达使得改造获得的工程菌株OAH28的OAH产量提升至17.49 g/L。最终，在5 L发酵罐中进行生产性能测试，工程菌株OAH产量达到47.12 g/L，葡萄糖转化率为32%，生产强度为0.59 g/(L·h)。上述研究结果为OAH的代谢工程改造实现产量提升提供了一定的理论基础，也为工业化生产提供了有效的借鉴和参考。
O-乙酰-l-高丝氨酸(O-acetyl-l-homoserine,OAH)是一种平台化合物，可用于生产l-蛋氨酸和其他有价值的化合物，但产量低和转化率低等问题限制了其工业化生产和应用。为了解决这一问题，本研究以前期构建的l-高丝氨酸宿主大肠杆菌HS33为底盘，采用系统代谢工程策略构建了一株高产OAH的菌株。首先，强化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)积累、丙酮酸利用以及OAH合成途径(过表达aspB、aspA、thrAC1034T)，获得积累13.37 g/L OAH的初始菌株；随后，整合筛选的辅因子供应基因解决还原力和能量供应问题，将产量提升至15.79 g/L；之后，进一步强化乙酸回用途径，改善乙酰辅酶A供应，结合多源乙酰基转移酶MetX表达使得改造获得的工程菌株OAH28的OAH产量提升至17.49 g/L。最终，在5 L发酵罐中进行生产性能测试，工程菌株OAH产量达到47.12 g/L，葡萄糖转化率为32%，生产强度为0.59 g/(L·h)。上述研究结果为OAH的代谢工程改造实现产量提升提供了一定的理论基础，也为工业化生产提供了有效的借鉴和参考。
2025,41(1):271-287, DOI: 10.13345/j.cjb.240306
摘要：
l-谷氨酸的高效生产依赖于产物的快速外排，其转运系统和细胞膜壁结构的人工改造已成为近年来研究的热点。针对谷氨酸棒杆菌特殊的细胞壁结构和组分，本研究在一株能够组成型分泌l-谷氨酸的菌株SCgGC7中验证了CmpLs转运系统对l-谷氨酸合成及转运的影响。首先，构建了不同CmpLs转运蛋白的敲除菌株，明确了CmpL1和CmpL4敲除可以显著提高菌株的l-谷氨酸生产性能；其次，利用温敏发酵工艺在5 L发酵罐中对上述菌株进行了发酵测试，发现CmpL1和CmpL4敲除菌株可以叠加l-谷氨酸生产的温敏特性，进一步强化高温条件下l-谷氨酸的生产，其中CmpL1敲除菌株表现出更好的l-谷氨酸生产性能，产量和糖酸转化率分别比对照菌株提高了69.2%和55.3%，最后，对发酵终点样品进行了胞内和胞外代谢物组分析，明确了CmpLs转运系统的改造可以明显促进l-谷氨酸外排，强化l-谷氨酸合成和转运的代谢通量，并且发现CmpL1敲除菌株胞内三羧酸循环中间代谢物和l-谷氨酸下游代谢物的积累明显更少，与其更强的l-谷氨酸生产性能一致。不同CmpLs蛋白功能上的冗余和互补，不仅为谷氨酸工业菌株的稳定性改造和性能提升提供了理想的靶点，也为改造谷氨酸棒杆菌的细胞膜壁结构强化其他代谢产物的外排提供了新的靶点和策略。
l-谷氨酸的高效生产依赖于产物的快速外排，其转运系统和细胞膜壁结构的人工改造已成为近年来研究的热点。针对谷氨酸棒杆菌特殊的细胞壁结构和组分，本研究在一株能够组成型分泌l-谷氨酸的菌株SCgGC7中验证了CmpLs转运系统对l-谷氨酸合成及转运的影响。首先，构建了不同CmpLs转运蛋白的敲除菌株，明确了CmpL1和CmpL4敲除可以显著提高菌株的l-谷氨酸生产性能；其次，利用温敏发酵工艺在5 L发酵罐中对上述菌株进行了发酵测试，发现CmpL1和CmpL4敲除菌株可以叠加l-谷氨酸生产的温敏特性，进一步强化高温条件下l-谷氨酸的生产，其中CmpL1敲除菌株表现出更好的l-谷氨酸生产性能，产量和糖酸转化率分别比对照菌株提高了69.2%和55.3%，最后，对发酵终点样品进行了胞内和胞外代谢物组分析，明确了CmpLs转运系统的改造可以明显促进l-谷氨酸外排，强化l-谷氨酸合成和转运的代谢通量，并且发现CmpL1敲除菌株胞内三羧酸循环中间代谢物和l-谷氨酸下游代谢物的积累明显更少，与其更强的l-谷氨酸生产性能一致。不同CmpLs蛋白功能上的冗余和互补，不仅为谷氨酸工业菌株的稳定性改造和性能提升提供了理想的靶点，也为改造谷氨酸棒杆菌的细胞膜壁结构强化其他代谢产物的外排提供了新的靶点和策略。
2025,41(1):288-295, DOI: 10.13345/j.cjb.240359
摘要：
2-取代喹啉是合成天然产物和药物的重要组成部分。与经典方法相比，2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的脱氢芳构化由于其高原子经济性和可持续性，近年来已成为获得2-取代喹啉的一种有效而直接的方法。然而，现有的化学方法需要使用过渡金属催化剂且反应条件苛刻，相比之下生物催化具有高效、高选择性以及反应条件温和等优点，已经成为有机合成领域的重要方法。本研究通过生物酶挖掘获得一株产单胺氧化酶的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii) ZMU-T06，能够催化2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物脱氢芳构化合成2-取代喹啉类化合物(8个底物，产率为45.7%–48.4%)，并推测了其可能的催化机理，为绿色合成2-取代喹啉类化合物提供新的方法。
2-取代喹啉是合成天然产物和药物的重要组成部分。与经典方法相比，2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的脱氢芳构化由于其高原子经济性和可持续性，近年来已成为获得2-取代喹啉的一种有效而直接的方法。然而，现有的化学方法需要使用过渡金属催化剂且反应条件苛刻，相比之下生物催化具有高效、高选择性以及反应条件温和等优点，已经成为有机合成领域的重要方法。本研究通过生物酶挖掘获得一株产单胺氧化酶的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii) ZMU-T06，能够催化2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物脱氢芳构化合成2-取代喹啉类化合物(8个底物，产率为45.7%–48.4%)，并推测了其可能的催化机理，为绿色合成2-取代喹啉类化合物提供新的方法。
2025,41(1):296-307, DOI: 10.13345/j.cjb.240458
摘要：
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)是一种耗氧脱氢酶，可催化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，这种特殊的作用机制使其具有良好应用前景。但天然GOD催化活力低、热稳定性差成为制约其工业化生产应用的主要因素。本研究以目前报道的热稳定性好的葡萄糖氧化酶AtGOD为源序列，通过进化分析，以期获得性能优良的GOD。筛选并成功合成了6个基因进行功能验证，其中异形曲霉(Aspergillus heteromorphus)的葡萄糖氧化酶AhGODB在毕赤酵母中表达后表现出较好的热稳定性和催化活性。其最适温度为40℃，比活力为112.2 U/mg，70℃处理5 min后的剩余酶活为47%。为进一步提高其活性和热稳定性，利用定向进化结合理性设计的方法获得多个突变体。其中，突变体T72R/A153P最适温度由野生型酶的40℃提高到50℃，比活力由112.2 U/mg提高到166.1 U/mg，70℃处理30 min后的剩余酶活由野生型酶的完全失活提高到33%。综上所述，本研究获得的葡萄糖氧化酶突变体在催化活性和热稳定性上有所提升，具有一定的应用潜力。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)是一种耗氧脱氢酶，可催化葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，这种特殊的作用机制使其具有良好应用前景。但天然GOD催化活力低、热稳定性差成为制约其工业化生产应用的主要因素。本研究以目前报道的热稳定性好的葡萄糖氧化酶AtGOD为源序列，通过进化分析，以期获得性能优良的GOD。筛选并成功合成了6个基因进行功能验证，其中异形曲霉(Aspergillus heteromorphus)的葡萄糖氧化酶AhGODB在毕赤酵母中表达后表现出较好的热稳定性和催化活性。其最适温度为40℃，比活力为112.2 U/mg，70℃处理5 min后的剩余酶活为47%。为进一步提高其活性和热稳定性，利用定向进化结合理性设计的方法获得多个突变体。其中，突变体T72R/A153P最适温度由野生型酶的40℃提高到50℃，比活力由112.2 U/mg提高到166.1 U/mg，70℃处理30 min后的剩余酶活由野生型酶的完全失活提高到33%。综上所述，本研究获得的葡萄糖氧化酶突变体在催化活性和热稳定性上有所提升，具有一定的应用潜力。
2025,41(1):308-320, DOI: 10.13345/j.cjb.240387
摘要：
在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本研究对短小芽孢杆菌属来源漆酶进行定向进化改造，利用高通量筛选方法从随机突变体文库中筛选得到突变体F282L/F306L、Q275P，其比酶活分别为280.87 U/mg、453.94 U/mg，是野生型漆酶的1.42倍、2.30倍；突变体Q275P的温度稳定性有明显提升，其在40、50、70℃孵育4 h后的剩余酶活与野生型漆酶相比均提高了20%以上；突变体F282L/F306L和Q275P相较野生型漆酶对多种金属离子和有机溶剂的耐受性增强。野生型漆酶的Km值为374.97 μmol/L，突变体F282L/F306L和Q275P的Km值分别减小至318.96 μmo/L和360.71 μmo/L，底物亲和性有所提高；F282L/F306L和Q275P对底物2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]的kcat值分别为574.00 s–1、898.03 s–1，分别是野生型漆酶的1.1倍和1.7倍，催化效率较高。在处理纸浆应用中，突变体Q275P处理纸浆效果最好，相比于野生型漆酶，卡伯值降低了0.82，白度提高了2.00% ISO，抗张指数和裂断长分别提高7.8%和7.2%。本研究为漆酶更好地适应造纸工业环境奠定了基础。
在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本研究对短小芽孢杆菌属来源漆酶进行定向进化改造，利用高通量筛选方法从随机突变体文库中筛选得到突变体F282L/F306L、Q275P，其比酶活分别为280.87 U/mg、453.94 U/mg，是野生型漆酶的1.42倍、2.30倍；突变体Q275P的温度稳定性有明显提升，其在40、50、70℃孵育4 h后的剩余酶活与野生型漆酶相比均提高了20%以上；突变体F282L/F306L和Q275P相较野生型漆酶对多种金属离子和有机溶剂的耐受性增强。野生型漆酶的Km值为374.97 μmol/L，突变体F282L/F306L和Q275P的Km值分别减小至318.96 μmo/L和360.71 μmo/L，底物亲和性有所提高；F282L/F306L和Q275P对底物2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]的kcat值分别为574.00 s–1、898.03 s–1，分别是野生型漆酶的1.1倍和1.7倍，催化效率较高。在处理纸浆应用中，突变体Q275P处理纸浆效果最好，相比于野生型漆酶，卡伯值降低了0.82，白度提高了2.00% ISO，抗张指数和裂断长分别提高7.8%和7.2%。本研究为漆酶更好地适应造纸工业环境奠定了基础。
2025,41(1):321-332, DOI: 10.13345/j.cjb.240238
摘要：
筛选具有催化还原复杂羰基化合物能力的羰基还原酶对于R型托伐普坦(R-tolvaptan,R-TVP)的生物合成具有重要意义。本研究分别采用硫酸铵盐析、葡聚糖分子排阻、离子交换层析、亲和层析以及蛋白质质谱的方法对兔肝脏粗酶中的目标羰基还原酶进行分离纯化和鉴定。以兔肝脏基因组为模板，PCR扩增得到羰基还原酶rlsr5的基因片段，并成功构建重组表达菌株。对诱导表达的RLSR5进行亲和层析纯化后，表征其酶学性质。研究结果表明，rlsr5基因序列为972 bp，编码蛋白的分子量为40 kDa，属于二聚体蛋白，每个单体由(α/β)8-桶结构组成。RLSR5可以不对称还原前手性酮7-氯-1-[2-甲基-4-[(2-甲基苯甲酰基)氨基]苯甲酰基]-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1-苯氮䓬(prochiral ketone,PK)合成R-TVP。该酶的比活为36.64 U/mg，产物的光学纯度e.e.值为99%。该酶反应最适pH值为6.0，最适温度为30℃。该酶不是金属离子依赖性的酶，Mn2+对酶活力有促进作用。本研究为光学纯托伐普坦的生物催化合成奠定了基础。
筛选具有催化还原复杂羰基化合物能力的羰基还原酶对于R型托伐普坦(R-tolvaptan,R-TVP)的生物合成具有重要意义。本研究分别采用硫酸铵盐析、葡聚糖分子排阻、离子交换层析、亲和层析以及蛋白质质谱的方法对兔肝脏粗酶中的目标羰基还原酶进行分离纯化和鉴定。以兔肝脏基因组为模板，PCR扩增得到羰基还原酶rlsr5的基因片段，并成功构建重组表达菌株。对诱导表达的RLSR5进行亲和层析纯化后，表征其酶学性质。研究结果表明，rlsr5基因序列为972 bp，编码蛋白的分子量为40 kDa，属于二聚体蛋白，每个单体由(α/β)8-桶结构组成。RLSR5可以不对称还原前手性酮7-氯-1-[2-甲基-4-[(2-甲基苯甲酰基)氨基]苯甲酰基]-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1-苯氮䓬(prochiral ketone,PK)合成R-TVP。该酶的比活为36.64 U/mg，产物的光学纯度e.e.值为99%。该酶反应最适pH值为6.0，最适温度为30℃。该酶不是金属离子依赖性的酶，Mn2+对酶活力有促进作用。本研究为光学纯托伐普坦的生物催化合成奠定了基础。
2025,41(1):333-351, DOI: 10.13345/j.cjb.240362
摘要：
大豆低聚糖因含大量蔗糖和棉子糖影响了其益生元价值。果聚糖蔗糖酶可催化蔗糖和棉子糖生成高附加值的低聚果糖和蜜二糖等组分。为获得高效转化大豆低聚糖的果聚蔗糖酶，本研究首先从我国西沙群岛及渤海湾沿海区域微生物中挖掘果聚糖蔗糖酶基因，然后对其进行酶学性质和催化性能表征，最后将其在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行重组胞外表达。结果显示，从耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)中挖掘出的新型果聚糖蔗糖酶BhLS 39，其以蔗糖和棉子糖为底物时的最适温度分别为50℃和55℃，最适pH值均为5.5，Kcat/Km分别为3.4和6.6 L/(mmol·s)。5 U酶处理400 g/L棉子糖30 min后获得的蜜二糖转化率为84.6%，BhLS 39催化蔗糖可生成左聚型低聚果糖和果聚糖。本研究实现了BhLS 39在枯草芽孢杆菌中的重组胞外表达，并通过共表达胞内伴侣蛋白DnaK和胞外伴侣蛋白PrsA使其重组胞外活性提高到17 U/mL，是对照菌的5.2倍。本研究挖掘出的BhLS 39有利于大豆低聚糖的提质增效，也可促进其他重组蛋白在枯草芽孢杆菌中实现高效重组表达。
大豆低聚糖因含大量蔗糖和棉子糖影响了其益生元价值。果聚糖蔗糖酶可催化蔗糖和棉子糖生成高附加值的低聚果糖和蜜二糖等组分。为获得高效转化大豆低聚糖的果聚蔗糖酶，本研究首先从我国西沙群岛及渤海湾沿海区域微生物中挖掘果聚糖蔗糖酶基因，然后对其进行酶学性质和催化性能表征，最后将其在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行重组胞外表达。结果显示，从耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)中挖掘出的新型果聚糖蔗糖酶BhLS 39，其以蔗糖和棉子糖为底物时的最适温度分别为50℃和55℃，最适pH值均为5.5，Kcat/Km分别为3.4和6.6 L/(mmol·s)。5 U酶处理400 g/L棉子糖30 min后获得的蜜二糖转化率为84.6%，BhLS 39催化蔗糖可生成左聚型低聚果糖和果聚糖。本研究实现了BhLS 39在枯草芽孢杆菌中的重组胞外表达，并通过共表达胞内伴侣蛋白DnaK和胞外伴侣蛋白PrsA使其重组胞外活性提高到17 U/mL，是对照菌的5.2倍。本研究挖掘出的BhLS 39有利于大豆低聚糖的提质增效，也可促进其他重组蛋白在枯草芽孢杆菌中实现高效重组表达。
2025,41(1):352-362, DOI: 10.13345/j.cjb.240178
摘要：
为筛选鉴定具有良好稳定性的壳聚糖酶，从源于贫瘠盐碱土壤的高产蛋白酶萎缩芽孢杆菌中克隆壳聚糖酶基因并在大肠杆菌中表达，利用镍柱纯化等方法获得萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶(Bacillus atrophic chitosanase,BA-CSN)，并对BA-CSN的最适温度、最适pH、底物特异性、动力学参数等性质进行表征。结果表明，BA-CSN的分子量为31.13 kDa，最适反应温度为55℃，最适pH为5.5，在温度低于45℃、pH 4–9时具有良好的稳定性，且在pH为3.0和10.0时处理4 h以内也具有较好的稳定性；K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Co2+对BA-CSN具有激活作用，其中Mn2+的激活作用最为显著，而Fe3+、Cu2+、Ag+对BA-CSN有抑制作用；BA-CSN水解胶体壳聚糖的相对酶活最高，对胶体几丁质也有较好的酶解能力；在最适催化条件下，BA-CSN对胶体壳聚糖催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax分别为9.94 mg/mL、26.624 μmol/(mL·min)。本研究证明BA-CSN对酸碱有较强的耐受性，具有广阔的工业应用前景。
为筛选鉴定具有良好稳定性的壳聚糖酶，从源于贫瘠盐碱土壤的高产蛋白酶萎缩芽孢杆菌中克隆壳聚糖酶基因并在大肠杆菌中表达，利用镍柱纯化等方法获得萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶(Bacillus atrophic chitosanase,BA-CSN)，并对BA-CSN的最适温度、最适pH、底物特异性、动力学参数等性质进行表征。结果表明，BA-CSN的分子量为31.13 kDa，最适反应温度为55℃，最适pH为5.5，在温度低于45℃、pH 4–9时具有良好的稳定性，且在pH为3.0和10.0时处理4 h以内也具有较好的稳定性；K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Co2+对BA-CSN具有激活作用，其中Mn2+的激活作用最为显著，而Fe3+、Cu2+、Ag+对BA-CSN有抑制作用；BA-CSN水解胶体壳聚糖的相对酶活最高，对胶体几丁质也有较好的酶解能力；在最适催化条件下，BA-CSN对胶体壳聚糖催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax分别为9.94 mg/mL、26.624 μmol/(mL·min)。本研究证明BA-CSN对酸碱有较强的耐受性，具有广阔的工业应用前景。
2025,41(1):363-375, DOI: 10.13345/j.cjb.240210
摘要：
基于转录因子的转录调控是广泛应用于微生物细胞工厂的一种有效的调控方式。目前，已实现应用的酿酒酵母内源天然转录调控元件较少，且存在基础表达高或动态范围窄等问题，无法满足异源化合物的特定代谢调控需求。植物中含有丰富的转录调控元件，但大多元件的序列和功能尚未充分表征和优化，在微生物细胞工厂中的应用更是处于初级阶段。本研究选取了蒺藜苜蓿中天然调控元件，包括转录因子MtTASR2和MtTASR3以及其结合的启动子ProHMGR1，对其进行功能表征和工程化改造，构建了诱导型转录调控工具，并将其应用于酿酒酵母中β-胡萝卜素异源合成途径的特异性调控，使β-胡萝卜素产量相比出发菌株提高7.31倍。本研究进一步证明了植物源转录调控元件可用于调节酿酒酵母中基因的表达，为其在微生物细胞工厂中的特异性调控和应用提供了新的策略和思路。
基于转录因子的转录调控是广泛应用于微生物细胞工厂的一种有效的调控方式。目前，已实现应用的酿酒酵母内源天然转录调控元件较少，且存在基础表达高或动态范围窄等问题，无法满足异源化合物的特定代谢调控需求。植物中含有丰富的转录调控元件，但大多元件的序列和功能尚未充分表征和优化，在微生物细胞工厂中的应用更是处于初级阶段。本研究选取了蒺藜苜蓿中天然调控元件，包括转录因子MtTASR2和MtTASR3以及其结合的启动子ProHMGR1，对其进行功能表征和工程化改造，构建了诱导型转录调控工具，并将其应用于酿酒酵母中β-胡萝卜素异源合成途径的特异性调控，使β-胡萝卜素产量相比出发菌株提高7.31倍。本研究进一步证明了植物源转录调控元件可用于调节酿酒酵母中基因的表达，为其在微生物细胞工厂中的特异性调控和应用提供了新的策略和思路。
2025,41(1):376-384, DOI: 10.13345/j.cjb.240223
摘要：
生物酶元件作为合成生物学系统的芯片对生物制造产业有着至关重要的作用。发展多样性新功能酶元件可为合成生物学系统提供丰富的工具盒并助力其发展。本研究报道了一种基于非天然辅因子的新型人工酶构建方法，通过非天然氨基酸结合点击化学策略将4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)辅因子通过共价键引入至优选蛋白骨架中，成功构建了一种以叔胺辅因子为催化中心的新型人工酶。该人工酶成功实现了一例环状烯酮与对硝基苯甲醛之间发生的非天然不对称Morita-Baylis-Hillman (MBH)反应，转化率高达90%、对映选择性(e.e.)为38%。本研究不仅为新型人工酶的设计提供了一种有效策略，而且为发展酶催化非天然MBH反应建立了理论基础。
生物酶元件作为合成生物学系统的芯片对生物制造产业有着至关重要的作用。发展多样性新功能酶元件可为合成生物学系统提供丰富的工具盒并助力其发展。本研究报道了一种基于非天然辅因子的新型人工酶构建方法，通过非天然氨基酸结合点击化学策略将4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)辅因子通过共价键引入至优选蛋白骨架中，成功构建了一种以叔胺辅因子为催化中心的新型人工酶。该人工酶成功实现了一例环状烯酮与对硝基苯甲醛之间发生的非天然不对称Morita-Baylis-Hillman (MBH)反应，转化率高达90%、对映选择性(e.e.)为38%。本研究不仅为新型人工酶的设计提供了一种有效策略，而且为发展酶催化非天然MBH反应建立了理论基础。
2025,41(1):385-396, DOI: 10.13345/j.cjb.240302
摘要：
基因合成技术是支撑合成生物学发展的使能技术。现有的基因从头合成技术存在操作步骤多、效率低、错误率高且长度有限等问题，难以支撑合成生物学日益拓展的庞大需求。其中DNA片段的组装和纠错是基因合成的关键环节。本研究首先通过平衡序列设计软件能力、PCR扩增能力以及组装酶组装能力等参数，将约10 kb病毒基因组序列进行合理拆分后设计寡核苷酸序列；然后使用高保真聚合酶进行两步PCR反应，完成3.0 kb DNA片段的从头合成，并使用T7核酸内切酶I分别对不同阶段的PCR产物进行纠错反应；最后将从头合成并经过纠错的3.0 kb DNA片段进行约10 kb片段的组装并测序验证。结果表明，本方法可成功获得约10 kb DNA片段，有效降低组装过程中的大片段突变概率，组装错误率最低可至0.36 errors/kb。综上，本研究开发了一种高效从头合成约10 kb病毒基因组方法，辅以T7核酸内切酶I纠错，可1 d内获得约10 kb病毒基因组片段，5 d内获得病毒基因组的正确质粒。该方法优化了基因从头合成流程，降低了错误率，简化了合成与组装步骤，并进一步降低了病毒基因组组装成本。
基因合成技术是支撑合成生物学发展的使能技术。现有的基因从头合成技术存在操作步骤多、效率低、错误率高且长度有限等问题，难以支撑合成生物学日益拓展的庞大需求。其中DNA片段的组装和纠错是基因合成的关键环节。本研究首先通过平衡序列设计软件能力、PCR扩增能力以及组装酶组装能力等参数，将约10 kb病毒基因组序列进行合理拆分后设计寡核苷酸序列；然后使用高保真聚合酶进行两步PCR反应，完成3.0 kb DNA片段的从头合成，并使用T7核酸内切酶I分别对不同阶段的PCR产物进行纠错反应；最后将从头合成并经过纠错的3.0 kb DNA片段进行约10 kb片段的组装并测序验证。结果表明，本方法可成功获得约10 kb DNA片段，有效降低组装过程中的大片段突变概率，组装错误率最低可至0.36 errors/kb。综上，本研究开发了一种高效从头合成约10 kb病毒基因组方法，辅以T7核酸内切酶I纠错，可1 d内获得约10 kb病毒基因组片段，5 d内获得病毒基因组的正确质粒。该方法优化了基因从头合成流程，降低了错误率，简化了合成与组装步骤，并进一步降低了病毒基因组组装成本。
2025,41(1):397-415, DOI: 10.13345/j.cjb.240385
摘要：
威克汉姆西弗酵母(Wickerhamomyces ciferrii,W.c)是一种异宗生殖的非常规酵母，能够大量生产并分泌四乙酰基植物鞘氨醇(tetraacetyl phytosphingosine,TAPS)。由于其在TAPS生产方面的优异性能，本研究旨在构建W.c的遗传操作系统，以提升四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的产量，并通过诱变和基因工程手段筛选高产菌株，从而为进一步开发鞘脂类代谢产物的工业生产奠定基础。本研究通过选取2个自主复制元件(CEN,2μ)并挖掘11个内源启动子元件以建立威克汉姆西弗酵母中的遗传操作系统，发现过量表达鞘脂代谢内部途径的Syr2和Lcb2能显著提高TAPS的产量。同时使用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和流式细胞术建立了威克汉姆西弗酵母单倍体交配型鉴定方法，从双倍体ATCC 14091出发，筛选到5株单倍体菌株。其中a-型单倍体W.c 140生产TAPS水平最高，产量达到4.74 mg/g，滴度达到32.61 mg/L。使用常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术和本研究构建的遗传操作技术获得诱变菌株W.c 140-A9和W.c 140-A11及过表达重组菌株W.c 140 OELcb2和W.c 140 OESyr2。与出发株W.c 140相比，诱变株TAPS产量分别提高了61.39%和67.09%。过表达重组菌株产量提高至原来的2.24和2.56倍，达到10.60 mg/g和12.14 mg/g，超过了双倍体ATCC 14091的产量。本研究所构建的遗传操作系统和获得的出发菌株为后续在威克汉姆西弗酵母中建立更多遗传工程技术奠定了基础。
威克汉姆西弗酵母(Wickerhamomyces ciferrii,W.c)是一种异宗生殖的非常规酵母，能够大量生产并分泌四乙酰基植物鞘氨醇(tetraacetyl phytosphingosine,TAPS)。由于其在TAPS生产方面的优异性能，本研究旨在构建W.c的遗传操作系统，以提升四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的产量，并通过诱变和基因工程手段筛选高产菌株，从而为进一步开发鞘脂类代谢产物的工业生产奠定基础。本研究通过选取2个自主复制元件(CEN,2μ)并挖掘11个内源启动子元件以建立威克汉姆西弗酵母中的遗传操作系统，发现过量表达鞘脂代谢内部途径的Syr2和Lcb2能显著提高TAPS的产量。同时使用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和流式细胞术建立了威克汉姆西弗酵母单倍体交配型鉴定方法，从双倍体ATCC 14091出发，筛选到5株单倍体菌株。其中a-型单倍体W.c 140生产TAPS水平最高，产量达到4.74 mg/g，滴度达到32.61 mg/L。使用常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术和本研究构建的遗传操作技术获得诱变菌株W.c 140-A9和W.c 140-A11及过表达重组菌株W.c 140 OELcb2和W.c 140 OESyr2。与出发株W.c 140相比，诱变株TAPS产量分别提高了61.39%和67.09%。过表达重组菌株产量提高至原来的2.24和2.56倍，达到10.60 mg/g和12.14 mg/g，超过了双倍体ATCC 14091的产量。本研究所构建的遗传操作系统和获得的出发菌株为后续在威克汉姆西弗酵母中建立更多遗传工程技术奠定了基础。
2025,41(1):416-426, DOI: 10.13345/j.cjb.240216
摘要：
转氨酶是一类催化氨基酸和酮酸之间氨基转移反应的酶，在有机胺及其衍生物的合成中具有重要作用。然而天然酶通常对非天然底物催化效率低，限制了其广泛应用。对转氨酶的蛋白质改造可有效提升其催化性能，从而拓宽应用范围。本研究基于对甲氧基-2-氨基芐胺肟(para-methoxy-2-amino benzamidoxime,PMA)与酮类化合物之间产生荧光显色反应从而能够有效监测酮类化合物浓度变化的机制，建立了适用于转氨酶活性的高通量筛选方法，通过体系的系统优化，显著提升了筛选方法的高效性、灵敏性和精确性，以4-羟基-2-丁酮为底物，构建了放线菌(Actinobacteria sp.)来源的转氨酶突变文库，成功获得了活力提升的突变体，提高了(R)-3-氨基丁醇的酶法合成效率。本研究为高效筛选、改造转氨酶并实现其应用奠定了重要基础。
转氨酶是一类催化氨基酸和酮酸之间氨基转移反应的酶，在有机胺及其衍生物的合成中具有重要作用。然而天然酶通常对非天然底物催化效率低，限制了其广泛应用。对转氨酶的蛋白质改造可有效提升其催化性能，从而拓宽应用范围。本研究基于对甲氧基-2-氨基芐胺肟(para-methoxy-2-amino benzamidoxime,PMA)与酮类化合物之间产生荧光显色反应从而能够有效监测酮类化合物浓度变化的机制，建立了适用于转氨酶活性的高通量筛选方法，通过体系的系统优化，显著提升了筛选方法的高效性、灵敏性和精确性，以4-羟基-2-丁酮为底物，构建了放线菌(Actinobacteria sp.)来源的转氨酶突变文库，成功获得了活力提升的突变体，提高了(R)-3-氨基丁醇的酶法合成效率。本研究为高效筛选、改造转氨酶并实现其应用奠定了重要基础。
2025,41(1):427-436, DOI: 10.13345/j.cjb.240222
摘要：
近年来，噬菌体Φ29(Phi29) DNA聚合酶因其具有恒温高保真扩增的能力，成为热点关注对象。为了进一步推进这类等温聚合酶的工业化应用，本研究将已表征的Phi29 DNA聚合酶序列针对微生物宏基因组进行新酶挖掘与表征。在植物宿主群体的宏基因组中，鉴定出一种新酶—— Php29 DNA聚合酶，该酶具有更高的链置换活性(与噬菌体Φ29的相似度达到59.5%)。实验验证结果表明，该酶也具备3ʹ→5ʹ核酸外切酶活性，其扩增产物可用于进一步的催化反应。Php29 DNA聚合酶的挖掘和验证为未来等温扩增酶的工业化应用提供了有益参考。
近年来，噬菌体Φ29(Phi29) DNA聚合酶因其具有恒温高保真扩增的能力，成为热点关注对象。为了进一步推进这类等温聚合酶的工业化应用，本研究将已表征的Phi29 DNA聚合酶序列针对微生物宏基因组进行新酶挖掘与表征。在植物宿主群体的宏基因组中，鉴定出一种新酶—— Php29 DNA聚合酶，该酶具有更高的链置换活性(与噬菌体Φ29的相似度达到59.5%)。实验验证结果表明，该酶也具备3ʹ→5ʹ核酸外切酶活性，其扩增产物可用于进一步的催化反应。Php29 DNA聚合酶的挖掘和验证为未来等温扩增酶的工业化应用提供了有益参考。
2025,41(1):437-447, DOI: 10.13345/j.cjb.240158
摘要：
生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1,4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1,4-丁二胺高产菌株的筛选效率。为研究调整生物传感器特性的策略，本研究开发了一种以转录调节因子PuuR为基础的1,4-丁二胺生物传感器，其同源的操作子puuO被组装在大肠杆菌组成型启动子PgapA中，以控制下游的高能绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein,sfGFP)作为报告蛋白表达。最终该传感器在1,4-丁二胺浓度处于0–50 mmol/L时GFP/OD600值与1,4-丁二胺浓度之间能稳定地表现出线性关系。本研究采用大肠杆菌基因组中不同强度的启动子对1,4-丁二胺生物传感器进行分子改造，探究并改进基于PuuR的1,4-丁二胺生物传感器的功能性质，为高通量筛选高产1,4-丁二胺的工程菌株奠定了基础。
生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1,4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1,4-丁二胺高产菌株的筛选效率。为研究调整生物传感器特性的策略，本研究开发了一种以转录调节因子PuuR为基础的1,4-丁二胺生物传感器，其同源的操作子puuO被组装在大肠杆菌组成型启动子PgapA中，以控制下游的高能绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein,sfGFP)作为报告蛋白表达。最终该传感器在1,4-丁二胺浓度处于0–50 mmol/L时GFP/OD600值与1,4-丁二胺浓度之间能稳定地表现出线性关系。本研究采用大肠杆菌基因组中不同强度的启动子对1,4-丁二胺生物传感器进行分子改造，探究并改进基于PuuR的1,4-丁二胺生物传感器的功能性质，为高通量筛选高产1,4-丁二胺的工程菌株奠定了基础。
2025,41(1):448-460, DOI: 10.13345/j.cjb.240406
摘要：
混凝土广泛应用于房屋土建工程以及道路桥梁等，其开裂问题一直是工程界的一大难题。为了开发有效、可行的混凝土修复技术，本研究结合微生物技术与微胶囊技术采用锐孔法制备了一种多层复配微胶囊，并以微胶囊的包埋率与机械性能为评价标准，优化了微胶囊的配方和干燥方式。而后表征了微胶囊钙转结晶过程以及产物晶型，并与游离细胞钙转过程进行对比。最后，测试了微胶囊的掺入对试件的机械性能、抗渗性能以及自修复效果的影响。结果表明：配方为蜡样芽胞杆菌湿菌体1.0%、氯化钙1.5%、海藻酸钠3.0%、营养物质5.0%、丙三醇6.0%、壳聚糖0.6%、尿素2.0%的风干多层复配微胶囊，其包埋率为95.3%，破裂力为59.7 N，硬度为150.8 N。该微胶囊能够在囊内的微生物发生钙转反应时，由固态转变为流动的胶态。微胶囊与游离细胞钙转反应产生的碳酸钙都是较稳定的方解石晶型，但微胶囊产的颗粒大小更加均匀，更有利于在裂缝中累积，从而增强修复的稳固性。将微胶囊投入混凝土试件，当掺量为0.45%时，试件的抗折强度提高了17.3%，试件的抗压强度提高了12.3%。在抗渗水试验中，添加了微胶囊的试件较掺入游离细胞的试件对水泥混凝土有更好的抗渗性补偿。裂缝自修复效果证明多层复配微胶囊能够对0.7 mm宽度以下的裂缝实现完全修复，对0.8 mm宽度裂缝修复率为95%。本研究开发了一种能够在混凝土中保护微生物并提供其生长所需营养的多层复配微胶囊，为微生物诱导碳酸钙沉淀在混凝土裂缝修复提供了新的思路。
混凝土广泛应用于房屋土建工程以及道路桥梁等，其开裂问题一直是工程界的一大难题。为了开发有效、可行的混凝土修复技术，本研究结合微生物技术与微胶囊技术采用锐孔法制备了一种多层复配微胶囊，并以微胶囊的包埋率与机械性能为评价标准，优化了微胶囊的配方和干燥方式。而后表征了微胶囊钙转结晶过程以及产物晶型，并与游离细胞钙转过程进行对比。最后，测试了微胶囊的掺入对试件的机械性能、抗渗性能以及自修复效果的影响。结果表明：配方为蜡样芽胞杆菌湿菌体1.0%、氯化钙1.5%、海藻酸钠3.0%、营养物质5.0%、丙三醇6.0%、壳聚糖0.6%、尿素2.0%的风干多层复配微胶囊，其包埋率为95.3%，破裂力为59.7 N，硬度为150.8 N。该微胶囊能够在囊内的微生物发生钙转反应时，由固态转变为流动的胶态。微胶囊与游离细胞钙转反应产生的碳酸钙都是较稳定的方解石晶型，但微胶囊产的颗粒大小更加均匀，更有利于在裂缝中累积，从而增强修复的稳固性。将微胶囊投入混凝土试件，当掺量为0.45%时，试件的抗折强度提高了17.3%，试件的抗压强度提高了12.3%。在抗渗水试验中，添加了微胶囊的试件较掺入游离细胞的试件对水泥混凝土有更好的抗渗性补偿。裂缝自修复效果证明多层复配微胶囊能够对0.7 mm宽度以下的裂缝实现完全修复，对0.8 mm宽度裂缝修复率为95%。本研究开发了一种能够在混凝土中保护微生物并提供其生长所需营养的多层复配微胶囊，为微生物诱导碳酸钙沉淀在混凝土裂缝修复提供了新的思路。
2025,41(1):461-473, DOI: 10.13345/j.cjb.240398
摘要：
虎杖是传统中药之一，其主要活性成分虎杖苷具有调节糖代谢、脂代谢、镇咳平喘、抗菌抗炎等药理作用，但传统的虎杖苷制备方法不足以满足当下市场需求。本研究聚焦于绿色高效的虎杖苷制备方法，在已获得的糖基转移酶UGTBS三联突变体IGW (Y14I/I62G/M315W)基础上，以白藜芦醇为底物，通过双酶偶联一锅法生物催化高效制备虎杖苷，同时实现尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate-glucose,UDPG)的循环再生。对双酶偶联催化体系进行条件优化，在35℃，pH为8.0，IGW:AtSuSy1酶活比3:4，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)体积比5%，尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)浓度0.10 mmol/L，蔗糖浓度0.6 mol/L的条件下，1 h内2 mmol/L白藜芦醇的转化率可达80.6%，虎杖苷的产物占比可达90%以上。本研究通过双酶偶联体系实现了UDPG的循环再生，缩短了反应时间，同时探究了分批补料策略，在一锅法偶联反应中24 h虎杖苷产量可达到6.28 g/L。本研究为绿色高效制备虎杖苷提供了新的策略。
虎杖是传统中药之一，其主要活性成分虎杖苷具有调节糖代谢、脂代谢、镇咳平喘、抗菌抗炎等药理作用，但传统的虎杖苷制备方法不足以满足当下市场需求。本研究聚焦于绿色高效的虎杖苷制备方法，在已获得的糖基转移酶UGTBS三联突变体IGW (Y14I/I62G/M315W)基础上，以白藜芦醇为底物，通过双酶偶联一锅法生物催化高效制备虎杖苷，同时实现尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate-glucose,UDPG)的循环再生。对双酶偶联催化体系进行条件优化，在35℃，pH为8.0，IGW:AtSuSy1酶活比3:4，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)体积比5%，尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)浓度0.10 mmol/L，蔗糖浓度0.6 mol/L的条件下，1 h内2 mmol/L白藜芦醇的转化率可达80.6%，虎杖苷的产物占比可达90%以上。本研究通过双酶偶联体系实现了UDPG的循环再生，缩短了反应时间，同时探究了分批补料策略，在一锅法偶联反应中24 h虎杖苷产量可达到6.28 g/L。本研究为绿色高效制备虎杖苷提供了新的策略。
2025,41(1):474-485, DOI: 10.13345/j.cjb.240324
摘要：
S-甲基-l-半胱氨酸亚砜(S-methyl-l-cysteine sulfoxide,SMCO)是一种具有多种功能特性的非蛋白质含硫氨基酸。目前关于催化S-甲基-l-半胱氨酸(S-methyl-l-cysteine,SMC)生物合成SMCO的酶鲜有报道。本研究将栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的黄素单加氧酶基因(spfmo)通过大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)进行异源表达，并对其酶学性质进行了分析。重组SpFMO的最适催化条件为30℃、pH 8.0，该条件下比酶活为72.77 U/g；此外，适当的Mg2+可以提高SpFMO的酶活；经酶动力学分析，该酶对底物SMC的酶促反应动力学参数Km值为23.89 μmol/L，催化效率kcat/Km为61.71 L/(min·mmol)。在最适条件下，SpFMO催化SMC在9 h内生成SMCO的产率为12.31%。本研究为酶法合成SMCO提供了一定参考。
S-甲基-l-半胱氨酸亚砜(S-methyl-l-cysteine sulfoxide,SMCO)是一种具有多种功能特性的非蛋白质含硫氨基酸。目前关于催化S-甲基-l-半胱氨酸(S-methyl-l-cysteine,SMC)生物合成SMCO的酶鲜有报道。本研究将栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的黄素单加氧酶基因(spfmo)通过大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)进行异源表达，并对其酶学性质进行了分析。重组SpFMO的最适催化条件为30℃、pH 8.0，该条件下比酶活为72.77 U/g；此外，适当的Mg2+可以提高SpFMO的酶活；经酶动力学分析，该酶对底物SMC的酶促反应动力学参数Km值为23.89 μmol/L，催化效率kcat/Km为61.71 L/(min·mmol)。在最适条件下，SpFMO催化SMC在9 h内生成SMCO的产率为12.31%。本研究为酶法合成SMCO提供了一定参考。
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摘要：
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
2021,37(9):3151-3161, DOI: 10.13345/j.cjb.200734
摘要：
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单增李斯特菌的分布和存活与其形成生物膜的能力有关，生物膜对逆性环境有抵抗力，细菌会从生物膜中分离导致食品持续性的污染。生物膜的形成、成熟和结构取决于多种外部和内部因素，并且多种调控机制起着重要作用。文中旨在阐述单增李斯特菌生物膜形成过程中的调控机制 (包括胞内作用、胞间作用和种间作用)，以控制食品加工环境中致病性生物膜的形成，从而为食品安全提供新的干预策略。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
2023,39(10):4275-4294, DOI: 10.13345/j.cjb.230297
摘要：
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
本研究旨在通过蛋白质工程手段获得结构均一性更好、活性更高、抗真菌能力更强的家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38的串联多聚体蛋白。利用原核表达技术获得BmSPI38串联多聚体蛋白，并通过蛋白酶抑制剂胶内活性染色、蛋白酶抑制实验和真菌生长抑制实验等探讨串联多聚体化对BmSPI38的结构均一性、抑制活性和抗真菌能力的影响。活性染色结果表明，基于多肽柔性接头的串联表达能够极大提高BmSPI38蛋白的结构均一性。蛋白酶抑制实验表明，基于接头的串联三聚体化和四聚体化能提高BmSPI38对微生物蛋白酶的抑制能力。孢子萌发实验表明，His6-SPI38L-tetramer对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分生孢子萌发的抑制能力显著强于His6-SPI38-monomer。真菌生长抑制实验显示，能够通过串联多聚体化来增强BmSPI38对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）的抑制能力。本研究成功实现BmSPI38的串联多聚体在大肠杆菌中的异源活性表达，并证实可通过串联多聚体化来增强BmSPI38的结构均一性和抗真菌能力，不仅可为培育抗真菌转基因家蚕提供重要的理论依据和新策略，还将推动BmSPI38的外源生产及在医疗领域的应用。
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
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