2023, Vol. 39
表1(Table 1)
类芽孢杆菌来源D-甘露醇氧化酶的性质及制备D-甘露糖的应用
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.230078
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李冉, 宋聪, 张翔, 贾振华
- LI Ran, SONG Cong, ZHANG Xiang, JIA Zhenhua
- 类芽孢杆菌来源D-甘露醇氧化酶的性质及制备D-甘露糖的应用
- Characterization of a D-mannitol oxidase from Paenibacillus sp. and its application in the preparation of D-mannose
- 生物工程学报, 2023, 39(11): 4682-4693
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(11): 4682-4693
- 10.13345/j.cjb.230078
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文章历史
- Received: February 6, 2023
- Accepted: July 14, 2023
引用本文
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李冉, 宋聪, 张翔, 贾振华. 类芽孢杆菌来源D-甘露醇氧化酶的性质及制备D-甘露糖的应用[J]. 生物工程学报, 2023, 39(11): 4682-4693.
LI Ran, SONG Cong, ZHANG Xiang, JIA Zhenhua. Characterization of a D-mannitol oxidase from Paenibacillus sp. and its application in the preparation of D-mannose[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(11): 4682-4693.
类芽孢杆菌来源D-甘露醇氧化酶的性质及制备D-甘露糖的应用
1. 河北省科学院生物研究所, 河北 石家庄 050000;
2. 河北省微生物研究所有限公司, 河北 保定 071000
2. 河北省微生物研究所有限公司, 河北 保定 071000
摘要：D-甘露糖具有多种功能活性，在食品、医药、农业等行业应用广泛。D-甘露醇氧化酶可以高效地将D-甘露醇转化为D-甘露糖，在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。从类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) HGF5中发掘出一个D-甘露醇氧化酶(PsOX)，与天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的D-甘露醇氧化酶(AldO)氨基酸序列相似性为50.94%，分子量约为47.4 kDa，构建了重组表达质粒pET-28a-PsOX并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，PsOX对D-甘露醇的Km、kcat/Km值分别为5.6 mmol/L、0.68 L/(s·mmol)，最适pH和温度分别为7.0和35 ℃，在60 ℃以下保持稳定。PsOX对400 mmol/L D-甘露醇的摩尔转化率为95.2%。利用PsOX与AldO全细胞分别催化73 g/L D-甘露醇，PsOX反应9 h后反应完全，生成70 g/L D-甘露糖，相较于AldO具有更高的催化效率。PsOX作为新型D-甘露糖氧化酶为D-甘露糖的酶法制备提供了依据。
关键词：D-甘露糖 D-甘露醇氧化酶 酶学性质 全细胞催化
Characterization of a D-mannitol oxidase from Paenibacillus sp. and its application in the preparation of D-mannose
1. Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050000, Hebei, China;
2. Hebei Research Institute of Microbiology Co., Ltd., Baoding 071000, Hebei, China
2. Hebei Research Institute of Microbiology Co., Ltd., Baoding 071000, Hebei, China
Abstract: D-mannose has many functional activities and is widely used in food, medicine, agriculture and other industries. D-mannitol oxidase that can efficiently convert D-mannitol into D-mannose has potential application in the enzymatic preparation of D-mannose. A D-mannitol oxidase (PsOX) was found from Paenibacillus sp. HGF5. The similarity between PsOX and the D-mannitol oxidase (AldO) from Streptomyces coelicolor was 50.94%. The molecular weight of PsOX was about 47.4 kDa. A recombinant expression plasmid pET-28a-PsOX was constructed and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The Km and kcat/Km values of PsOX for D-mannitol were 5.6 mmol/L and 0.68 L/(s·mmol). Further characterization of PsOX showed its optimal pH and temperature were 7.0 and 35 ℃, respectively, while its enzyme activity could be stably remained below 60 ℃. The molar conversion rate of 400 mmol/L D-mannitol by PsOX was 95.2%. The whole cells of PsOX and AldO were used to catalyze 73 g/L D-mannitol respectively. The reaction catalyzed by PsOX completed in 9 h and 70 g/L D-mannose was produced. PsOX showed a higher catalytic efficiency compared to that of AldO. PsOX may facilitate the enzymatic preparation of D-mannose as a novel D-mannose oxidase.
Keywords:
D-mannose D-mannitol oxidase enzyme property whole cell catalysis
D-甘露糖是一种单糖，在自然界中分布广泛，植物、植物细胞壁及果皮中普遍含有具有D-甘露糖单元的多糖和游离的D-甘露糖[1-2]。因其具有低甜度、低热量的特点，相较蔗糖更有益于人们身体健康，常作为蔗糖替代品应用于食品工业[2]。此外，甘露糖可用于预防尿道感染药物，还可用作糖质营养素来应对糖尿病和肥胖症等疾病，具有抗炎、免疫调节等功能[3-4]。在化工领域可作为合成三氟甘露糖、甘露糖醇以及l-核糖等的合成前体[5-7]。
目前D-甘露糖的制备方法有提取法、化学合成法和生物转化法。提取法主要以咖啡渣、棕榈籽为原料[8-9]，通过水解、分离纯化等步骤获得D-甘露糖。从咖啡渣中提取D-甘露糖的产率达60%以上，纯度达98%以上[8]，但是提取法往往需要大量植物原料，而且生产制备受地域、季节的影响。化学合成法是通过D-葡萄糖差向异构化来获得D-甘露糖，转化率为30%−36%，反应条件常需要在酸性(pH 2.3−4.5)、高温(110−160 ℃)环境中进行[10]，存在转化率低、生产工艺复杂、成本较高等问题。
生物转化法因其具有反应条件温和、对环境友好等优点而受到广泛的关注，利用生物转化法制备D-甘露糖成为研究热点。目前通过某些异构酶，如D-甘露糖异构酶(D-mannose isomerase, EC 5.3.1.7)、D-来苏糖异构酶(D-lyxose isomerase, EC 5.3.1.15)能够实现将D-果糖转化为D-甘露糖的过程，转化率在12%−25%之间[11-13]。由于D-果糖价格略高于D-葡萄糖，为进一步降低成本，研究者采用纤维二糖2-差向异构酶(cellobiose 2-epimerase, Cease, EC 5.1.3.11)催化的方式由D-葡萄糖合成D-甘露糖，转化率约为15%[14]。还有研究者采用双酶催化的方式，利用D-葡萄糖异构酶(D-glucose isomerase, EC 5.3.1.5)与D-甘露糖异构酶或D-来苏糖异构酶催化D-葡萄糖合成D-甘露糖，转化率分别约为12%、15%、14%[11, 15-16]。目前报道中的异构酶催化反应为可逆反应，导致转化效率不高，且副产物较多。
为提高生物转化法合成D-甘露糖的转化效率，以D-甘露醇为底物，利用D-甘露醇氧化酶(D-mannitol oxidase，EC 1.1.3.40)合成D-甘露糖为不可逆反应，能够完全将D-甘露醇转化为D-甘露糖，有效提高D-甘露糖产率。来源于天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的AldO是一种已知的能够催化D-甘露醇合成D-甘露糖的糖醇氧化酶[17-18]，本研究从NCBI数据库中挖掘出一个来源于类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. HGF5)的氧化酶PsOX (GenBank登录号为WP_009593092.1)，将PsOX与AldO的氨基酸序列进行比对，发现PsOX具有与AldO相同的底物结合位点，推测其具有D-甘露糖的催化活性。将PsOX与AldO蛋白编码基因分别在大肠杆菌中表达，研究PsOX酶学性质，比较PsOX与AldO的重组全细胞在制备D-甘露糖时的催化效率，以期为D-甘露糖的酶法生产提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒实验室所用菌株大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α和E. coli BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司。表达载体pET-28a(+)为实验室保藏。
1.1.2 培养基LB液体培养基(g/L)：酵母提取物5.0，氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0，pH为7.0。卡那霉素终浓度为50 μg/mL。
LB固体培养基(g/L)：酵母提取物5.0，氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0，琼脂粉15.0，pH为7.0。卡那霉素终浓度为50 μg/mL。
1.1.3 主要试剂和仪器限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准和蛋白分子量标准购自北京全式金生物技术有限公司；质粒DNA小量纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；IPTG、D-甘露醇、D-甘露糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司；4-氨基安替比林、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、辣根过氧化物酶购自罗恩试剂。
pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；UV-2600紫外分光光度计，岛津公司；精密天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；超声破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；核酸电泳仪、蛋白电泳设备、凝胶成像系统和Aminex HPX-87H色谱柱，Bio-Rad公司；高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography, HPLC)、示差折光检测器(differential refractive index detector, RID)，岛津公司。
1.2 方法 1.2.1 PsOX、AldO原核表达载体构建将PsOX (GenBank登录号为WP_009593092.1)、AldO (GenBank登录号为WP_011030685.1)的蛋白质序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行偏向于大肠杆菌的密码子优化并合成，优化的基因序列两端添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。将含有目的片段的质粒及载体质粒利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点双酶切，PsOX、AldO分别连入pET-28a(+)，构建得到重组质粒pET28a-PsOX、pET28a-AldO，转化E. coli BL21(DE3)得到重组菌株E. coli BL21-pET28a-PsOX、E. coli BL21-pET28a-AldO。
1.2.2 PsOX、AldO重组蛋白的诱导表达及纯化将重组质粒转入E. coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，于37 ℃、200 r/min过夜培养。以0.1%的接种量转接到LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃培养至OD600值达到0.6−0.8时，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG，25 ℃诱导14 h，测定菌液OD600数值。诱导后的菌液4 ℃、10 000 r/min离心后，用2 mL磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0)重悬，置于冰水浴中，超声波功率为200 W进行细胞破碎。细胞破碎液经4 ℃、12 000 r/min离心30 min后，上清液即为粗酶液，将上清液利用亲和层析镍柱进行纯化，得到纯酶液。细胞破碎液、纯酶液利用SDS-PAGE进行检测。
1.2.3 PsOX酶活力及酶动力学常数测定酶活力测定方法：反应体系(1 mL)中含50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)，300 mmol/L D-甘露醇。加入100 μL纯酶液起始反应，35 ℃、200 r/min反应10 min，反应液12 000 r/min离心5 min，取100 μL反应液加入5 mmol/L硫酸溶液中，过0.22 μm水相膜后，利用液相色谱检测D-甘露糖含量。液相色谱检测条件：色谱柱为Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，柱温箱为40 ℃，流动相为5 mmol/L硫酸，流速为0.5 mL/min，检测器为RID检测器。酶活力定义为：每分钟生成1 μmol的D-甘露糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。蛋白含量使用Abbkine公司快速蛋白质定量试剂盒进行测定。
酶动力学常数测定参照Heuts等的方法[17]，反应体系包括50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)，3 U/mL辣根过氧化物酶，30 μL/mL纯酶液，分别加入5、10、50、100、200 mmol/L D-甘露醇，置于35 ℃、200 r/min摇床中反应15 min，加入0.1 mmol/L 4-氨基安替比林，1 mmol/L 3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，利用UV-2600紫外分光光度计测定515 nm处吸光度值变化，利用UVProbe软件计算Km值、kcat值。
1.2.4 温度对PsOX酶活力的影响最适温度测定：将1.2.3述反应体系分别加入30 OD600/mL粗酶液，在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃摇床中，200 r/min反应3 h。利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测各pH下D-甘露糖的生成量，将D-甘露糖的生成量最高时的酶活力设为100%，计算不同pH下的相对酶活力。
温度稳定性测定：将30 OD600/mL粗酶液在20、25、30、35、40、45、50、55 ℃条件下孵育1 h后加入到反应体系中，在最适条件下测定残余酶活力，以未经处理酶液的酶活力为对照，分别计算各温度的残余酶活力占对照组酶活力的百分比。
1.2.5 pH对PsOX酶活力的影响将1.2.3所述反应体系中的缓冲液分别换成柠檬酸/柠檬酸钠(pH 5.0−6.0)、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾(pH 6.0−7.5)、Tris-HCl (pH 7.5−8.5)。反应1 h后，利用HPLC检测各pH下D-甘露糖的生成量，将D-甘露糖的生成量最高时的酶活力设为100%，计算不同pH下的相对酶活力。
1.2.6 PsOX重组菌全细胞催化反应条件优化全细胞转化反应体系为：50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)，300 mmol/L D-甘露醇，设置菌体浓度分别为10、20、30、40 OD600/mL，反应9 h后12 000 r/min离心5 min，分别取100 μL上清液加入5 mmol/L硫酸终止反应，利用HPLC检测D-甘露糖的含量，计算转化率。
设置底物浓度分别为200、300、400、500 mmol/L D-甘露醇，加入50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)，30 OD600/mL全细胞，反应9 h后12 000 r/min离心5 min，分别取100 μL上清液加入5 mmol/L硫酸终止反应，利用HPLC检测D-甘露糖的含量，计算转化率。
设置底物浓度为200、300、400、500 mmol/L D-甘露醇，加入50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)，30 OD600/mL全细胞、10 U/mL的辣根过氧化物酶，反应9 h后12 000 r/min离心5 min，分别取100 μL上清液加入5 mmol/L硫酸终止反应，利用HPLC检测D-甘露糖的含量，计算转化率。
1.2.7 PsOX、AldO全细胞催化合成D-甘露糖的比较将30 OD600/mL的PsOX、AldO全细胞、10 U/mL的辣根过氧化物酶，分别加入D-甘露醇浓度为73 g/L的80 mL反应体系，置于500 mL挡板摇瓶中35 ℃、200 r/min反应，定时从反应体系中取样，使用HPLC检测不同取样时间的D-甘露醇、D-甘露糖含量。
1.2.8 PsOX、AldO全细胞在发酵罐中的催化反应将30 OD600/mL的PsOX、AldO全细胞、10 U/mL的辣根过氧化物酶，分别加入D-甘露醇浓度为73 g/L的1 L反应体系，置于3 L发酵罐中35 ℃，串联搅拌控制溶氧值30%−50%搅拌反应，定时从反应体系中取样，使用HPLC检测不同取样时间的D-甘露醇、D-甘露糖含量。
2 结果与分析 2.1 PsOX、AldO序列比对分析在NCBI数据库中发掘到一条来源于类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)的氧化酶蛋白质序列，该蛋白质序列含有419个氨基酸，预测分子量和等电点pI分别为47.4 kDa和6.19。天蓝链霉菌(S. coelicolor)的糖醇氧化酶AldO对苏糖醇、木糖醇、D-山梨醇和D-甘露醇均有催化活性，AldO与底物拟合结果表明Glu320、Arg322、Ser106、Lys375、His343、Thr345为底物结合活性位点[17-18]。将PsOX与AldO蛋白质序列比对(图 1)，其蛋白质序列的相似性为50.94%，PsOX具有与AldO底物结合活性位点一致的氨基酸位点，因此推测PsOX具有D-甘露醇催化活性。
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| 图 1 PsOX与AldO的氨基酸序列比对 Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of PsOX and AldO. 与底物结合相关的残基用圆点标注 Residues related to substrate binding are highlighted by circles. |
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将PsOX与AldO基因分别在大肠杆菌中重组表达，取全细胞破碎液进行SDS-PAGE检测，PsOX与AldO均有可溶性表达，PsOX重组蛋白经镍株纯化后得到纯酶液(图 2)。液相色谱检测结果(图 3)表明，D-甘露醇标准品出峰时间约11.5 min，D-甘露糖标准品出峰时间约11.1 min，PsOX反应液中检测到D-甘露糖，表明PsOX具有催化活性。
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| 图 2 PsOX与AldO重组蛋白表达的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant PsOX and AldO. M：标准蛋白；1：未诱导细胞破碎液；2：Escherichia coli BL21-pET28a-PsOX细胞破碎液上清；3：E. coli BL21-pET28a-PsOX细胞破碎液沉淀；4：PsOX纯酶液；5：E. coli BL21-pET28a-AldO细胞破碎液上清；6：E. coli BL21-pET28a-AldO细胞破碎液沉淀 M: Standard protein marker; 1: Uninduced whole-cell extracts; 2: Escherichia coli BL21-pET28a-PsOX whole-cell extracts supernatant; 3: E. coli BL21-pET28a-PsOX whole-cell extracts sediment; 4: Purified PsOX; 5: E. coli BL21-pET28a-AldO whole-cell extracts supernatant; 6: E. coli BL21-pET28a-AldO whole-cell extracts sediment. |
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| 图 3 Escherichia coli BL21-pET28a-PsOX全细胞催化活性液相检测图 Fig. 3 The HPLC profile showing the catalytic activity of Escherichia coli BL21-pET28a-PsOX recombinant cells. A：D-甘露醇、D-甘露糖标准品液相图. B：E. coli BL21-pET28a-PsOX全细胞转化D-甘露醇液相图 The HPLC profile of mixed standard sample of D-mannitol, D-mannose (A) and D-mannitol catalyzed by E. coli BL21-pET28a-PsOX (B). |
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测定了PsOX纯酶液的酶活力为34.3 U/mg，对PsOX的酶动力学常数进行测定，结果如表 1所示，PsOX对D-甘露醇的Km值为5.6 mmol/L，低于AldO对D-甘露醇的Km值，表明PsOX对D-甘露醇的亲和度更高。PsOX的kcat/Km值为0.68，高于AldO的kcat/Km值，表明PsOX对D-甘露醇的催化效率更高。
温度是酶促反应的重要影响因素，特别是对酶活力的影响。温度对PsOX的酶活力影响如图 4A所示，PsOX的最适温度为35 ℃，在25−50 ℃时，PsOX的酶活力可保持最高活性的60%以上。PsOX在不同温度孵育1 h后测定其热稳定性情况，如图 4B所示，在35−60 ℃时，PsOX的酶活力能保持在最高活性的60%以上。
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| 图 4 温度对PsOX酶活性的影响 Fig. 4 Effect of temperatures on the activity of PsOX. A：PsOX的最适温度. B：PsOX的温度稳定性 The optimal temperature (A) and thermostability (B) of PsOX. |
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反应体系的pH也是影响酶活力的重要因素。PsOX在不同pH反应液中的酶活力如图 5所示，PsOX的最适pH为7.0，在pH为7.0−7.5时可保持最高活性的60%以上，pH为6.0−8.5时可保持最高活性的40%以上，pH为5.5以下时PsOX没有活性。
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| 图 5 pH对PsOX酶活性的影响 Fig. 5 Effect of pH on the activity of PsOX. |
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为确定PsOX全细胞催化的最适菌量，检测了添加不同菌量时的D-甘露糖含量和转化率(图 6A)，结果表明菌量为30 OD600/mL，甘露糖含量和摩尔转化率最高，分别为284 mmol/L、94.7%，菌量为40 OD600/mL时，甘露糖含量有所下降，可能与菌体对甘露醇的消耗有关，因此反应体系的最适菌体全细胞添加量为30 OD600/mL。
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| 图 6 菌量(A)、D-甘露醇浓度(B)、过氧化氢酶(C)对PsOX全细胞生产D-甘露糖的影响 Fig. 6 Effects of biomass amount (A), D-mannitol concentration (B), catalase (C) on D-mannose production catalyzed by whole cell containing PsOX. |
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为确定反应的最适底物浓度，在反应体系中加入不同浓度的D-甘露醇，检测D-甘露糖的含量和转化率，结果如图 6B所示，D-甘露糖含量随底物浓度增加而增加，D-甘露醇浓度为400 mmol/L时以上时，D-甘露醇不能完全反应，摩尔转化率为78.1%；D-甘露醇浓度为300 mmol/L时，D-甘露糖含量为286 mmol/L，D-甘露醇反应完全，摩尔转化率为95.4%。
反应产生的过氧化氢可能影响细胞的催化活性，为减少反应中产生的过氧化氢对转化效率的影响，在反应中加入辣根过氧化物酶以消解过氧化氢，检测不同底物浓度时D-甘露糖的含量及摩尔转化率，结果如图 6C所示。添加过氧化氢酶后，PsOX全细胞能将400 mmol/L D-甘露醇完全转化，产生的D-甘露糖浓度为381 mmol/L，摩尔转化率为95.2%。
2.7 PsOX、AldO全细胞催化合成D-甘露糖的比较将PsOX、AldO全细胞置于挡板摇瓶中进行催化反应，D-甘露醇、D-甘露糖浓度随时间变化如图 7A、7B所示，D-甘露醇浓度为73 g/L (400 mmol/L)时，PsOX反应9 h时，D-甘露醇完全反应，D-甘露糖浓度为70 g/L，转化率为95.9%。AldO反应24 h时，无法将D-甘露醇完全转化，D-甘露糖浓度为22 g/L，转化率为30%。将PsOX、AldO全细胞置于3 L发酵罐中进一步扩大反应规模，结果如图 7C、7D所示，PsOX全细胞转化反应12 h后，无D-甘露醇剩余，D-甘露糖浓度为69.6 g/L，转化率为95.3%。AldO仍然无法将D-甘露醇完全转化，转化率为32.3%。
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| 图 7 PsOX、AldO全细胞催化合成D-甘露糖的比较 Fig. 7 Comparison of whole cell catalytic synthesis of D-mannose by PsOX and AldO. A：PsOX全细胞催化合成D-甘露糖摇瓶反应. B：AldO全细胞催化合成D-甘露糖摇瓶反应. C：PsOX全细胞催化合成D-甘露糖发酵罐反应. D：AldO全细胞催化合成D-甘露糖发酵罐反应 Whole cell catalytic synthesis of D-mannose by PsOX (A) and AldO (B) in shake flask; Whole cell catalytic synthesis of mannose by PsOX (C) and AldO (D) in fermentor. |
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氧化酶在手性砌块化合物的合成中应用广泛，针对目前已报道的通过异构酶合成D-甘露糖转化率较低的问题，本研究以氧化酶作为关键酶催化D-甘露醇合成D-甘露糖，以提高转化效率。从类芽孢杆菌中发掘到一个氧化酶PsOX，与已报道的来源于天蓝链霉菌的氧化酶AldO具有相同的底物催化活性位点，推测其具有D-甘露醇的催化活性。将PsOX与AldO分别在大肠杆菌中异源表达，PsOX与AldO均有可溶性蛋白表达，催化活性检测表明PsOX能够催化D-甘露醇合成D-甘露糖。PsOX对D-甘露醇的Km、kcat/Km值分别为5.6、0.68，相较于AldO表现出更高的底物亲和性和催化效率。PsOX的酶学性质研究表明，其最适pH与最适温度分别为7.0、35 ℃，在30−60 ℃能保持在最佳酶活力的60%上。对PsOX全细胞催化反应体系进行优化，确定最佳菌体添加量为30 OD600/mL，最适甘露醇浓度为400 mmol/L，摩尔转化率为95.2%。
总结了目前报道的具有D-甘露醇催化活性的氧化酶(表 2)，它们对其他糖醇类化合物，如山梨醇、木糖醇、苏糖醇和阿糖醇均有催化活性，但研究主要集中在酶的酶学性质、蛋白结构解析等基础研究，缺乏其在合成糖类物质中的应用研究。本研究比较了PsOX与AldO全细胞催化合成D-甘露糖时的催化效率，底物为73 g/L时，PsOX对D-甘露醇的转化率为95.9%，AldO不能将底物完全转化，转化率约30%。利用发酵罐扩大了催化反应体系，PsOX对D-甘露醇的转化率为95.3%，AldO仍然无法将D-甘露醇完全转化，转化率为32.3%。PsOX相较于AldO，在D-甘露糖的酶法制备中具有更强的工业化应用潜力。
表 2 不同来源具有D-甘露醇催化活性的氧化酶
Table 2 Oxidases with D-mannitol catalytic activity from different organisms
| Enzyme | Organism | Substrate | Km (mmol/L) | kcat (1/s) | kcat/Km (L/(s∙mmol)) | |
| AldO[17] | Alditol oxidase | Streptomyces coelicolor A3 | D-mannitol | 36±2 | 9.2±0.2 | 0.26 |
| HotAldO[19] | Alditol oxidase | Acidothermus cellulolyticus 11B | D-mannitol | 5.5 | 2.5 | 0.45 |
| SOX[20] | Sorbitol oxidase | Streptomyces sp. H-7775 | D-mannitol | 7.38 | ‒ | ‒ |
| ‒: Means not mentioned. | ||||||
D-甘露糖的制备工艺有很多种[21]，利用生物法合成D-甘露糖多以D-果糖、D-葡萄糖为底物(表 3)，本研究以D-甘露醇为底物，利用PsOX氧化酶能够将73 g/L底物完全转化，提高了转化率，D-甘露糖的产量约70 g/L，生产强度约6 kg/(m3·h)。考虑到以D-甘露醇作为底物合成D-甘露糖在生产中的成本较高，后续可采用多酶级联反应策略，首先利用较廉价底物合成D-甘露醇，如以蔗糖或果糖为底物，利用蔗糖水解酶(sucrose hydrolase, EC 3.2.1.26)、甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase, EC 1.1.1.67)催化合成D-甘露醇[23-24]。还可利用代谢工程构建D-甘露醇生产菌株，能直接以无机盐培养基和葡萄糖果糖作为混合碳源，发酵获得D-甘露醇[25]，再利用D-甘露醇氧化酶催化D-甘露醇合成D-甘露糖。
表 3 生物法合成D-甘露糖
Table 3 Biological synthesis of D-mannose
| Substrate | Enzyme | Organism | Substrate concentrate (g/L) | Condition | Conversion rate (%) |
| D-fructose | Mannose isomerase[11] | Pseudomonas sp. | 300 | pH 7.0, 50 ℃ | 12 |
| Mannose isomerase[12] | Stenotrophomonas rhizophila | 100 | pH 7.0, 50 ℃ | 25 | |
| D-lyxose isomerase[13] | Thermoprotei archaeon | 80 | pH 6.5, 80 ℃ | 20 | |
| N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase[22] | Pseudomonas geniculata | 200 | pH 7.5, 50 ℃ | 39 | |
| D-glucose | Cellobiose 2-epimerase[14] | Caldicellulosiruptor saccharolyticus | 500 | pH 7.5, 75 ℃ | 15 |
| D-glucose isomerase, D-lyxose isomerase[15] | Acidothermus cellulolyticus, Thermosediminibacter oceani | 400 | pH 6.5, 65 ℃ | 15 | |
| D-glucose isomerase, D-lyxose isomerase[16] | Acidothermus cellulolyticus, Peptococcaceae bacterium | 100 | pH 6.0, 70 ℃ | 14 | |
| D-mannitol | Mannitol oxidase | Paenibacillus sp. | 73 | pH 7.0, 35 ℃ | 96 |
总之，D-甘露糖在食品、医药、农业领域应用广泛，利用生物催化的方法实现其高效合成是极具价值的研究方向，本研究提出了一种利用D-甘露醇氧化酶催化D-甘露醇合成D-甘露糖的方法，为D-甘露糖的酶法合成及其“绿色”工业化生产提供了依据。
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