摘要:

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摘要:以酶及微生物细胞催化剂结合工程学方法将廉价、废弃原料进行高效生物转化可实现化学品的可持续生产。近年来，合成生物学、系统生物学及酶工程等技术的快速发展大大推动了化学品的可持续生物制造，既实现了多种新型化学品的生物合成，又显著提高化学品的生物合成效率。为展示化学品生物合成的最新进展并促进绿色生物制造的发展，《生物工程学报》特组织出版化学品生物合成专刊，从酶催化与生物合成机制、微生物细胞合成、一碳生物炼制以及关键核心技术等方面，介绍化学品生物合成的最新前沿、挑战以及潜在解决方案。

摘要:γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成，反应体系成分简单、环境友好。然而，绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小，需要加入无机盐维持最适催化环境，增加了生产附加成分。此外，随着产物γ-氨基丁酸的生成，溶液pH会逐渐上升，不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD，基于酶蛋白表面电荷修饰，选择9个位点进行定点突变及组合突变，酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高，尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活，为野生酶的1.68倍。接下来，通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外，将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达，通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃，菌体量OD₆₀₀=20，底物L-谷氨酸100.0 g/L，5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中，不调节pH，通过分批投料底物L-谷氨酸，γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L，较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活，提高了γ氨基丁酸的转化效率，为实现其规模化工业生产奠定了基础。

摘要:ω-转氨酶(ω-transaminase, ω-TA)作为一种天然的生物催化剂，在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷，大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷，针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA (AtTA)，采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造，获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶AtTA-E104D/A246V/R266Q (M3)。与AtTA野生酶(wild-type, WT)相比，M3的半衰期t_1/2 (35 ℃)由17.8 min提升至102.7 min，提升了4.8倍，半失活温度T¹⁰₅₀比WT (38.1 ℃)提高2.2 ℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明，分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因；底物分子与结合口袋氨基酸之间氢键相互作用的增加以及底物结合口袋体积的增大是导致M3催化效率提升的主要原因。底物谱测定结果表明，相较于WT，M3对11种芳香酮类化合物的催化性能均有所提升，进一步说明M3对手性胺的合成具有更高的应用价值。

摘要:蛋白质是有机生命体内不可或缺的化合物，在生命活动中发挥着多种重要作用，了解蛋白质的功能有助于医学和药物研发等领域的研究。此外，酶在绿色合成中的应用一直备受人们关注，但是由于酶的种类和功能多种多样，获取特定功能酶的成本高昂，限制了其进一步的应用。目前，蛋白质的具体功能主要通过实验表征确定，该方法实验工作繁琐且耗时耗力，同时，随着生物信息学和测序技术的高速发展，已测序得到的蛋白质序列数量远大于功能获得注释的序列数量，高效预测蛋白质功能变得至关重要。随着计算机技术的蓬勃发展，由数据驱动的机器学习方法已成为应对这些挑战的有效解决方案。本文对蛋白质功能及其注释方法以及机器学习的发展历程和操作流程进行了概述，聚焦于机器学习在酶功能预测领域的应用，对未来人工智能辅助蛋白质功能高效研究的发展方向提出了展望。

摘要:利用多酶级联催化反应合成精细化学品是近年来生物催化领域的研究热点。通过构建体外多酶级联体系，可以替代传统的化学合成法，实现多种双官能团功能化学品的绿色合成。本文系统介绍了多酶级联催化反应中不同级联方式的特点及其构建策略，总结了级联反应中元件酶常用的筛选方法、NAD(P)H和ATP等辅酶的再生策略及其在多酶级联反应中的应用，并且阐述了多酶级联催化反应体系在6种双官能团功能化学品，包括ω-氨基脂肪酸、烷基内酰胺、α,ω-二元羧酸、α,ω-二胺、α,ω-二醇、ω-氨基醇合成中的应用。

摘要:脱落酸作为一种抑制生长的植物激素，是平衡植物内源激素和调节生长代谢的关键因子。脱落酸具有提高作物抗旱耐盐、减少果实褐变的作用，同时可降低疟疾发病率、刺激胰岛素分泌，因此在农业和医药领域有着广阔的应用前景。相较于传统的植物提取法和化学合成法，利用微生物合成脱落酸是一种经济、可持续的来源方式。目前利用天然微生物如灰葡萄孢霉菌、蔷薇色尾孢菌等合成脱落酸的研究已经取得了诸多进展，而脱落酸的异源微生物合成研究相对较少。酿酒酵母、解脂耶氏酵母、大肠杆菌等工程菌株作为天然产物异源合成的常用宿主，具有遗传背景清晰、易于操作、便于工业化生产等优势，因此利用微生物异源合成脱落酸是一种更具潜力的生产方式。本文着重从底盘细胞的选择、关键酶的筛选与表达强化、辅因子的调节、增强前体供应及促进脱落酸外排5个方面对微生物异源合成脱落酸的研究进行综述。最后，对该领域的未来发展方向进行了展望。

摘要:四乙酰基植物鞘氨醇(tetraacetyl phytosphingosine, TAPS)是一种性能卓越的天然护肤品原料，经去乙酰化后生成的植物鞘氨醇可作为前体合成保湿护肤品神经酰胺，因此广泛应用于护肤化妆品行业。非常规酵母威克汉姆西弗酵母(Wickerhamomyces ciferrii)是已知的唯一可天然分泌四乙酰基植物鞘氨醇的微生物，目前已成为四乙酰基植物鞘氨醇工业生产的宿主。本文介绍了四乙酰基植物鞘氨醇的发现、功能及其生物合成途径，综述了近年来利用单倍体筛选、诱变育种和代谢工程改造威克汉姆西弗酵母高产四乙酰基植物鞘氨醇的研究进展，并展望了实现四乙酰基植物鞘氨醇工业生产的未来发展方向。

摘要:功能膜微域(functional membrane microdomains, FMMs)是细菌细胞质膜上富含脚手架蛋白和聚异戊二烯类物质的结构域，参与细胞生命活动的多个过程。本研究主要聚焦于揭示FMMs与MK-7之间的相关性，并对MK-7合成进行代谢调控。首先，通过荧光标记初步确定FMMs和MK-7在细胞膜上存在相关性；其次通过分析FMMs破坏前后细胞膜上MK-7含量的变化以及细胞膜有序度的变化情况，明确MK-7是FMMs的聚异戊二烯类关键组分；接下来，采用可视化分析探究MK-7合成过程中部分关键酶的亚细胞定位，并通过FloA将胞内游离的途径酶Fni、IspA、HepT和YuxO定位至FMMs中，进而实现MK-7合成途径的区室化，最终成功获得一株高产MK-7的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BS3AT，摇瓶水平MK-7产量达到300.3 mg/L，3 L发酵罐中MK-7产量为464.2 mg/L。

摘要:有机酸是含有一种或多种低分子量酸性基团(如羧基、磺酸基)的可生物合成的有机化合物，广泛应用于食品、农业、医药、生物基材料工业等领域。酵母菌具有生物安全、抗逆性强、底物谱广泛、方便遗传改造，以及大规模培养技术成熟等独特优点，因此利用酵母菌生产有机酸的研究日益受到国内外学者的关注。目前利用酵母生产有机酸还存在浓度低、副产物多，以及发酵效率低等缺陷。随着酵母菌代谢工程和合成生物学技术的发展，利用酵母菌生产有机酸取得了快速进展。本文总结了利用酵母合成11种有机酸的研究，包括内源和异源合成的大宗羧酸和高价值有机酸，并对该领域的未来研究方向进行了展望。

摘要:S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine, SAM)广泛存在于生物体内，主要参与生物体内的转甲基过程、转硫过程及转氨丙基过程，具有重要的生理功能，其生产备受重视。目前SAM生产的研究主要集中于微生物发酵法，该方法与化学合成法和酶催化法相比，成本较低且更容易实现工业化生产。随着需求量的迅速增加，通过菌种改良提高SAM产量备受关注。当前SAM生产菌种改良的主要策略包括常规育种和代谢工程。本文综述了提高微生物生产SAM能力的近期研究进展并探讨了SAM生产中的瓶颈问题及解决方法，以期为进一步提高SAM产量提供思路。

摘要:植物源二萜类天然产物结构复杂且功能多样，具有抗癌、抗炎和抗菌等多种药理活性，在药品、化妆品和食品添加剂等方面广泛应用。近年来，基于植物源二萜类化合物(diterpenoids)生物合成途径中功能基因的逐步揭示和合成生物技术的发展，科研人员采用代谢工程技术构建了多种二萜类化合物的微生物细胞工厂，且多个化合物达到克级产量。本文对植物源二萜类化合物微生物细胞工厂的构建情况进行综述，介绍并探讨植物源二萜类化合物微生物合成的研究进展和改造策略，为高产二萜类化合物细胞工厂构建和工业化生产提供参考。

摘要:以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)为代表的非常规酵母凭借较广的底物利用谱、较强的环境耐受性等优势，已成功实现多种天然产物的高效生产。随着合成生物学及基因编辑技术的发展，针对非常规酵母代谢工程改造的工具和策略也逐渐丰富。本文介绍了几类常见的非常规酵母的生理特性、工具开发及应用现状，并总结归纳了天然产物合成优化中常用的代谢工程策略；最后讨论了现阶段非常规酵母作为天然产物合成细胞工厂的优势和不足，并对后续研究和发展趋势进行了展望。

摘要:圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)是一种能够天然合成多种类胡萝卜素和油脂的非模式酵母。该菌能够利用各种廉价原料，耐受甚至同化利用多种有毒木质纤维素水解副产物。目前，该酵母被广泛用于微生物油脂、萜烯类化合物、各种高价值酶、糖醇和聚酮化合物的生产研究。鉴于其广阔的工业应用前景，研究人员对其开展了多维度的理论和技术的探索，包括基因组、转录组、蛋白组、遗传操作平台等。本文着重阐述近年来圆红冬孢酵母的代谢工程和天然产物合成的研究进展，并展望其细胞工厂构建中面临的挑战和可能的应对决策。

摘要:公认食品安全的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是合成生物学中被广泛研究的底盘细胞，常作为生产高值或大宗化学品的微生物细胞工厂。近年来，通过各种代谢工程改造策略，已有大量化学品的合成途径在酿酒酵母中建立并优化，且部分化学品具备了产业化价值。作为真核生物，酿酒酵母具有完整的细胞内膜系统及其组成的复杂细胞器区室，而这些细胞器区室往往含有某些化学品合成所必需的较高浓度前体底物(如线粒体中的乙酰辅酶A)，或更加充足的酶、辅因子、能量等，可为目标产物的生物合成提供更适宜的物理、化学环境，但同时不同细胞器的结构特点有时也成为特定化合物合成的障碍。为此，研究人员在深入分析不同细胞器自身特点的基础上，结合目标化学品合成途径与细胞器之间的适配度，对细胞器开展了大量针对性改造工作以提高产物合成效率。本文详细综述了酿酒酵母中线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、脂滴和液泡等细胞器的途径改造及优化策略，以及利用细胞器区室化合成化学品的研究进展，并对目前存在的困难和挑战以及未来研究方向进行了总结与展望。

摘要:L-色氨酸作为一种必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前，微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此，本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等，获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上，将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块，并借助启动子工程，通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块，获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中，工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L，糖酸转化率提升至18.55%，达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略，构建了高产L-色氨酸生产菌株，为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。

摘要:己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸，是合成尼龙-66的关键前体。目前，生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞，首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶，成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株；接着，对合成路径限速酶进行表达优化，使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L；随后，通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应，优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L；最后，在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵，己二酸的产量达到22.3 g/L，转化率为0.25 g/g，生产强度为0.31 g/(L·h)，具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。

摘要:利用光能驱动二氧化碳(carbon dioxide, CO₂)还原生产化学品对于缓解环境压力、解决能源危机具有重要意义。光捕获、光电转化和CO₂固定等作为影响光合作用效率的关键因素，同时也制约着CO₂的资源化利用效率。为了解决上述问题，本文从生物化学与代谢工程相结合的角度，系统总结了光驱动杂合系统的构建、优化与应用，并从酶杂合系统、生物杂合系统以及杂合系统应用3个方面分析了光驱动CO₂还原合成化学品的最新研究进展。在酶杂合系统方面，采用的策略主要有提升酶催化活性、增强酶稳定性等；在生物杂合系统方面，采用的方法主要包括增强生物捕光能力、优化还原力供应以及改善能量再生等；在杂合系统应用方面，主要阐述了光驱动CO₂还原生产一碳含能化合物、生物燃料以及生物食品等。最后，从纳米材料(包括有机材料和无机材料)和生物催化剂(包括酶和微生物)两个方面，展望了人工光合系统的进一步发展方向。

摘要:当前的线性经济发展模式依赖化石能源且增加二氧化碳的排放，加剧全球变暖和环境污染。因此，亟需开发碳捕获和利用的技术，建立循环经济。利用产乙酸菌进行碳一气体(一氧化碳和二氧化碳)转化是一项前景广阔的技术，具有较高的碳源灵活性和产物选择性，能够合成多种化学品和燃料。本文聚焦产乙酸菌在碳一气体转化过程中的生理代谢机制、遗传和代谢工程改造、发酵工艺优化以及提升碳原子经济性等方面的研究进展，以期为产乙酸菌气体发酵的工业规模放大及“负碳”生产提供参考。

摘要:甲醇来源丰富、价格低廉，已成为生物制造行业极具吸引力的底物之一。构建微生物细胞工厂实现甲醇到增值化学品的生物转化，具有过程绿色、条件温和、产品体系多样等优势，不仅能拓展基于甲醇的产品链，还能缓解当前生物制造“与民争粮、与粮争地”的问题，是实现绿色生物制造的重要手段。因此，阐明不同天然甲基营养菌中涉及甲醇氧化、甲醛同化和异化途径对于后续基因工程改造工作至关重要，也更有利于构建新型非天然甲基营养菌。本文讨论了甲基营养菌中甲醇代谢途径的研究现状，并结合近年来天然和人工合成甲基营养菌在甲醇生物转化中的应用进展及面临的挑战。

摘要:规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关Cas蛋白所构建的CRISPR/Cas系统是古细菌或细菌中特有的一种获得性免疫系统。研究人员将其开发成基因编辑工具之后，凭借其高效、精准和通用性强等优点迅速成为合成生物学领域的热门研究方向，在生命科学、生物工程技术、食品科学及农作物育种等多个领域引发了革命性的影响。目前基于CRISPR/Cas系统单基因编辑与调控技术日益完善，但在多重基因编辑和调控方面仍存在挑战。本文聚焦基于CRISPR/Cas系统的多重基因编辑与调控技术开发及应用，针对单个细胞内实现多位点基因编辑或调控和细胞群体内实现多位点基因编辑或调控技术，依据作用原理对其进行了系统总结和阐述，包括基于CRISPR/Cas系统的双链断裂、单链断裂以及多重基因调控技术等。这些工作丰富了多重基因编辑与调控的工具，为CRISPR/Cas系统在多领域的应用作出了贡献。

摘要:基因组大尺度遗传操纵是指对基因组大片段DNA的敲除、整合、易位等遗传改造。相较于小规模基因编辑，基因组大尺度遗传操纵可实现更多遗传信息的同步改造，对于探究多基因相互作用等复杂机制的理解有重要意义。同时，基因组大尺度遗传操纵技术可对基因组开展更大规模的设计重构，甚至创建全新的基因组，在复杂功能重塑方面具有重要创新潜力。酵母是一种重要的真核模式生物，因其安全性和易于操作而被广泛应用。本文系统总结了酵母基因组大尺度遗传操纵的工具包，包括重组酶介导的大尺度操纵、核酸酶介导的大尺度操纵、从头合成大片段DNA以及其他大尺度操纵工具，介绍了它们的基本工作原理与典型应用案例。最后，对大尺度遗传操纵面临的挑战和发展进行了展望。

摘要:氨基酸是蛋白质的基本组成单元，对人和动物的营养健康十分重要，广泛应用于饲料、食品、医药和日化等领域。目前，氨基酸主要通过微生物发酵可再生原料生产，氨基酸产业是我国生物制造的重要支柱产业之一。氨基酸菌株主要通过随机诱变和代谢工程改造结合筛选获得。菌株生产水平进一步提高的核心限制之一是缺乏高效、快速和准确的筛选方法，因此，发展氨基酸菌株的高通量筛选方法对关键功能元件挖掘及高产菌株的创制筛选至关重要。本文综述了氨基酸生物传感器的设计，及其在功能元件、高产菌株的高通量进化筛选和代谢途径动态调控中的应用研究进展，讨论了现有氨基酸生物传感器存在的问题和性能提升改造策略，并展望了开发氨基酸衍生物生物传感器的重要性。

摘要:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认的食品安全菌株，目前已被用于多种高附加值产品的生物合成，包括被广泛用作营养化学品和药物中间体的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)。响应目标产物的生物传感器被广泛用于代谢工程中的动态调控和高通量筛选等方面，以提高生物合成效率。但是，枯草芽孢杆菌中缺乏可高效响应NeuAc的生物传感器。因此，本文首先测试和优化了能将胞外NeuAc转运进胞内的转运蛋白，获得了一系列具有不同转运能力的菌株，以用于后续响应NeuAc的生物传感器的验证；随后将响应NeuAc的转录因子Bbr_NanR的结合位点插入枯草芽孢杆菌组成型启动子的不同位置，筛选具有活性的杂合启动子；接下来，通过在具有NeuAc转运能力的枯草芽孢杆菌中表达Bbr_NanR，选择能响应NeuAc的杂合启动子，并进一步通过优化Bbr_NanR表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器，其中生物传感器P535-N2能灵敏地响应胞内NeuAc浓度的变化，具有最大的动态范围，为(180–20 245) AU/OD；P566-N2则具有最高的激活倍数，为122倍，是已报道的枯草芽孢杆菌中响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器的2倍。本文构建的响应NeuAc的生物传感器可用于高产NeuAc的酶突变体和枯草芽孢杆菌菌株的筛选，为枯草芽孢杆菌生物合成NeuAc提供了高效、灵敏的分析和调控工具。

摘要:自然界中存在着大量的天然微生物群落，不同种群的微生物通过通信及分工拓展了单菌的性能边界，降低了整体的代谢负担并增加了对环境的适应性。合成生物学依据工程设计原理构建或改造基本功能元件、基因线路和底盘细胞，从而对生命的运行过程进行具有目的性的重新编程，获得丰富及可控的生物学功能。将这种工程设计的原理引入菌群，获得结构明确及功能可调的合成群落，可以为合成功能菌群的理论研究到应用提供思路及方法。本文回顾了近年来合成功能菌群领域的相关工作，对合成功能菌群的设计原则、构建方法以及应用进行详细介绍，并对未来的发展进行了展望。