摘要:基因组大片段克隆技术是合成生物学研究领域关键的使能技术。传统的大片段克隆技术获取目的大片段的手段存在各种缺陷，比如随机建库克隆需要依靠高通量筛选；PCR难以扩增10 kb以上片段，从小片段拼装费时费力且突变率高；基于限制性酶切连接难以找到片段两端适宜的限制性内切酶酶切位点。最近全基因组合成等前沿研究创造了全新的高性能大片段克隆方法，比如CRISPR/cas9系统中cas9可识别并切割20 bp核酸序列解决了识别位点设计难题，可用来获取任意目的基因片段；组合Gibson或者酵母偶联重组技术组装技术，可高效克隆大片段基因。本文将分类介绍基因组大片段克隆技术，并提出适用不同尺度大小基因克隆的技术选择参考标准。

摘要:长末端重复序列 (Long terminal repeat，LTR) 反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的DNA序列，它们以RNA为媒介，通过“复制粘贴”机制在基因组中不断自我复制。在高等植物中，许多活性的LTR反转录转座子已被详尽研究并应用于分子标记技术、基因标签、插入型突变及基因功能等分析。本文对植物活性LTR反转录转座子进行全面的调查，并对其结构、拷贝数和分布以及转座特性进行系统的归纳，分析了植物活性LTR反转录转座子的gag (种属特异抗原) 和pol (聚合酶) 序列特征，以及LTR序列中顺式调控元件的分布。研究发现自主有活性的LTR反转录转座子必须具备LTR区域以及编码Gag、Pr、Int、Rt和Rh蛋白的基因区。其中两端LTR区域具有高度同源性且富含顺式调控元件；Rt蛋白必备RVT结构域；Rh蛋白必备RNase_H1_RT结构域。这些结果为后续植物活性LTR反转录转座子的鉴定和功能分析奠定了重要 基础。

摘要:天然蛋白质在生物体内主要以线性形式存在，由于多数蛋白质 (酶) 热稳定性较差，制约了其在工业催化、食品制造、医药领域的高效应用。自然界中发现的天然环肽类物质具有首尾相连的环化结构，使蛋白质具有较高的稳定性，为改造酶的结构、提高其热稳定性及拓宽其应用范围提供了新思路。本文根据国内外在蛋白质环化领域的新动态并结合本实验室的研究，系统介绍了内含肽介导的蛋白质反式剪接、表达蛋白连接、转肽酶催化的转肽作用等几种传统蛋白质环化方法，着重介绍了基于新型超强分子粘合剂SpyTag/SpyCatcher介导的蛋白质环化的研究。

摘要:为了提高非手术性小鼠胚胎移植技术的成功率，利用塑料移植导管模拟非手术胚胎移植过程，通过观察染料在子宫角的分布而评估胚胎移植效果，并在此基础上将自然妊娠3.5 d的小鼠囊胚经子宫颈移植受体小鼠。结果表明：将CD-1小鼠囊胚移植假孕2.5 d小鼠单侧子宫角，平均70.9%的胚胎能够发育至成活新生仔鼠，建立了高效非手术性小鼠胚胎移植技术。该方法简便快捷、不易污染、费用低，无需专业的手术器械，且符合实验动物伦理原则，完全可以取代手术法胚胎移植技术，更重要的是，它为人类和其他大动物的胚胎移植提供了研究模型。

摘要:表面增强拉曼光谱 (SERS) 是一种基于纳米颗粒的拉曼光谱，可以高灵敏度地检测流感病毒等重要病原微生物，鉴定不同毒株间的差异。为了建立一种快速检测流感病毒SERS的方法，本实验利用SERS技术对流感病毒H1N1亚型不同毒株在不同温度和pH值的条件下进行了病毒毒价强弱的检测，将流感病毒样品与金纳米颗粒混合静置后用拉曼共聚焦显微镜进行激光扫描。结果显示在pH为7.2、温度为37 ℃的条件下3个H1N1亚型的毒株SERS检测结果显示均出现至少1个大于 (或等于) 3 000的峰值，该状态下病毒毒价最强，最适合病毒生长。另外，细胞生物学方法与SERS技术结果一致，检测中均表现出较好的稳定性和准确性。

摘要:青贮是一种传统的生物质原料保存方法，广泛应用于纤维素乙醇炼制领域尚需要考察其对原料品质和下游乙醇转化过程的影响。文中以秋季 (初、中和末) 收割的柳枝稷为原料，通过青贮、高温水热 (LHW) 预处理、纤维素酶水解和同步糖化与发酵 (SSF) 实验对上述问题予以回答。结果显示，秋季初收割的柳枝稷以不同湿度青贮后pH均小于4.0，干重损失小于2%，各主要成分与青贮前相比无明显变化；LHW预处理中青贮样品半纤维素水解率普遍高于未贮存样品，但青贮同样使原料获得了更高的发酵抑制物产生水平；青贮柳枝稷葡萄糖、木糖和半乳糖产量 (预处理+酶水解) 高于未贮存柳枝稷；经过168 h的SSF，青贮样品乙醇浓度为12.1 g/L，未贮存的秋季初、秋季中和秋季末柳枝稷为底物的浓度分别为10.3 g/L、9.7 g/L和10.6 g/L。综上，青贮有助于提高柳枝稷LHW预处理效率、酶水解率和乙醇产量。

摘要:磷酸甘油酸脱氢酶 (D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH，EC 1.1.1.95) 为L-丝氨酸合成途径的关键酶，其编码基因为serA，其活性受到合成产物L-丝氨酸的反馈抑制调控。为解除丝氨酸的反馈抑制，采用定点突变技术把编码PGDH酶344位组氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密码子定点突变为丙氨酸密码子。改造后的serAFbr被连到表达载体pT7-7上，并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3) 中进行表达，破壁回收粗酶液，通过DEAE阴离子柱纯化PGDH突变体，并对其酶活性和IC50值进行了测定。结果，野生型PGDH酶IC50值为7 μmol/L，而PGDH双突变体N346A/H344A催化活性与野生型相近，在丝氨酸浓度为160 mmol/L时，其酶活仍保持未添加丝氨酸时酶活的96%，基本解除反馈抑制。

摘要:辛伐他汀是重要的降胆固醇处方药物。莫那可林J是辛伐他汀合成过程的关键中间体，也是洛伐他汀生物合成的中间产物。为获得莫那可林J并通过一步法发酵生成辛伐他汀，构建了洛伐他汀生物合成关键基因lovF基因的RNAi载体pMHJ137，通过农杆菌介导的方法转化土曲霉F001，筛选整合到染色体的阳性菌，并在阳性菌株MJ1-24的发酵过程中加入了DMB-S-MMP验证其直接合成辛伐他汀的效率。结果显示MJ1-24不再产生洛伐他汀，产物中仅有莫那可林J累积。如果在发酵过程中加入前体物质，可得到产物辛伐他汀。综上，RNAi技术能够有效实现土曲霉基因沉默。此项技术推进了一步法发酵生产辛伐他汀的工艺开发。

摘要:V型ATP酶 (Vacuolar-type ATPase) 是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外，从而维持细胞内正常的酸碱环境。V型ATP酶B亚基 (V-ATPase B) 作为ATP的催化位点，也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B (BmV-ATPase B) 的功能，首先从家蚕五龄幼虫的中肠cDNA中克隆了BmV-ATPase B基因并构建原核表达载体进行原核表达，获得了重组蛋白，经质谱鉴定正确后，通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体；最后分析了该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示BmV-ATPase B基因序列全长1 473 bp，预测蛋白分子量55 kDa，预测等电点5.3。通过Western blotting对家蚕5龄第3天和上蔟第1天幼虫丝腺的不同区段进行BmV-ATPase B蛋白的表达特征分析，发现在两个时期该蛋白均在前部丝腺高量表达，而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定位，发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋白进行进一步的定位，发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式，为深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。

摘要:哮喘是当今世界威胁公共健康的最主要的慢性肺部疾病，作为治疗中重度和难治性哮喘的特效药奥马珠单抗治疗费用相对昂贵，生物类似药CMAB007的研制可以降低治疗费用。本研究用质谱分析一种奥马珠单抗生物类似药CMAB007与原研药的一致性，分别从氨基酸分析、肽图、N/C端序列，还原质谱，寡糖含量，N 糖分析等层面对CMAB007和奥马珠单抗进行了系统的比对研究，为进一步临床研究打下基础。结果表明CMAB007和奥马珠单抗氨基酸序列一致，赖氨酸剪切也基本一致，带唾液酸修饰糖形和带核心岩藻糖形比例相近，高甘露糖形比例差异不大，CMAB007略低于奥马珠单抗。因此CMAB007满足生物类似药在结构比对上一致性的要求，有望成为国内首先上市的重组抗人IgE单克隆抗体药物。

摘要:构建人NOVA1基因的真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1，转染PC12细胞后筛选最佳转染条件，进而结合细胞免疫组织化学研究NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达分布，并探究其抗低氧活性。根据NCBI数据库NOVA1基因序列设计上下游引物，以pCR4-TOPO-NOVA1载体为模板采用聚合酶链式反应扩增获得NOVA1基因的全长cDNA编码序列，限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pCMV-Myc真核表达载体，酶切及直接测序验证后采用脂质体转染法转染入PC12细胞，针对转染比例和转染时间进行优化，进而采用实时定量PCR和Western blotting检测NOVA1蛋白的表达，最后采用细胞免疫组织化学检测NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达定位及其抗低氧活性。通过酶切和直接测序验证，成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1；质粒和Lipo2000最佳转染比例为1:2.5，最佳转染时间为72 h；最佳转染条件下NOVA1基因和蛋白的表达水平显著增加，转染pCMV-Myc-NOVA1质粒后，NOVA1蛋白主要分布于细胞核和细胞质；过表达NOVA1的PC12细胞增殖活性明显增加。本文采用分子克隆的方法成功构建了NOVA1基因的真核表达载体，通过条件优化实现了高效表达并测定过表达NOVA1蛋白具有明显的抗低氧活性，不仅为深入揭示NOVA1蛋白的作用机理提供了重要参考，而且为NOVA1蛋白潜在的药物开发提供了重要技术支撑。

摘要:苯丙氨酸羟化酶 (PAH) 是芳香族氨基酸羟化酶家族 (AAAHs) 的一员，催化苯丙氨酸 (Phe) 转化为酪氨酸 (Tyr)。运用Western blotting技术检测沙蚕PAH免疫原性。制作沙蚕头部石蜡切片，运用免疫组织化学技术，检测PAH蛋白表达定位情况。解剖剥离沙蚕脑组织，提取总RNA，运用RT-PCR技术克隆pah基因片段，构建质粒并转化入大肠杆菌中扩增，挑单一均匀菌落培养，双酶切鉴定后测序并比对同源性。Western blotting结果表明pah表达的蛋白存在于沙蚕脑内，免疫组化标记技术结果表明苯丙氨酸羟化酶主要分布在日本刺沙蚕前脑中腹侧、中脑背侧和两侧。RT-PCR结果表明沙蚕脑内存在苯丙氨酸羟化酶基因，且与多种动物pah具有同源性。在蛋白质和核酸水平鉴定了低等环节动物日本刺沙蚕脑组织内苯丙氨酸羟化酶的存在，为进一步研究无脊椎动物中枢神经系统内芳香族氨基酸羟化酶的基因分化奠定基础。

摘要:赖氨酸脱羧酶，可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物，可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体，将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌，得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中，对LN18进行摇瓶培养，发酵液酶活可达到35 U/g发酵液，从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa，粗酶的最适温度和pH值分别为55 ℃和5.5，与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶CadA在pH 8.0几乎没有酶活不同，产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响，Mg2+对酶活有促进作用，Fe2+ 、Zn2+、Ca2+有一定的抑制作用。

摘要:

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