摘要:环腺苷酸受体蛋白质 (cyclic amp receptor protein, CRP) 是原核生物共有的一类全局转录因子，调控原核生物大肠杆菌Escherichia coli中近一半基因的转录。通过易错PCR或DNA shuffling的方法可以获得CRP突变体文库，然后经过筛选可以得到目的细胞表型——“抗逆性”增强。本研究综述了突变CRP在细胞表型：耐氧化压力、耐渗透胁迫、耐有机溶剂 (甲苯)、发酵中耐醋酸盐类和生物醇生产中耐生物醇中的应用。推论出CRP同样可以应用于相似微生物的表型培育，并展望了CRP的巨大应用潜力。

摘要:传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 蛋白VP4在抑制宿主免疫应答中起重要作用，为制备IBDV VP4的单克隆抗体，以实验室保存的融合蛋白His-VP4免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合、筛选、亚克隆后获得4株能稳定分泌抗VP4的单抗杂交瘤细胞株，分别命名为3B3、3H11、4C8和4G6，经间接ELISA测定4株单抗的亲和力解离常数分别为4.61×10–11、1.71×10–10、4.26×10–11和5.02×10–11，均为高亲和力抗体。4株单抗的重链类型分别为IgG1、IgG1、IgG2b和IgG1。进一步以Western blotting鉴定，该4株单抗均能特异地识别IBDV的VP4蛋白，间接免疫荧光和Western blotting试验表明4株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP4蛋白。该单抗为检测IBDV以及研究IBDV VP4的生物学作用奠定了基础。

摘要:辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能，在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23 (SjRAD23) 编码的cDNA序列，成功获得SjRAD23的基因序列，其ORF为1 053 bp。构建SjRAD23基因重组表达质粒pET28a(+)-SjRAD23，并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达，重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况，该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性IgG、IgG1和IgG2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白rSjRAD23免疫结果与206佐剂对照组比较，rSjRAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率，40.59%肝脏减卵率。结果表明SjRAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。

摘要:利用干酪乳杆菌作为传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2抗原传递系统，探讨口服雏鸡的免疫次数、免疫剂量、免疫途径和攻毒保护效果。用pLA-VP2重组干酪乳杆菌对5日龄雏鸡进行二次和三次免疫，并设108、109、1010 CFU/mL的重组干酪乳杆菌组，间接ELISA检测血清IgG和小肠洗液sIgA，末免后7 d攻毒，计算保护效果。根据确定的2次免疫和109 CFU/mL免疫剂量免疫5日龄雏鸡，分别口服、滴鼻/点眼pLA-VP2/L. casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L. casei和PBS为对照，监测IgG和sIgA抗体水平；末免后7 d检测脾淋巴细胞增殖情况并攻毒，7 d后剖检，观察法氏囊损伤程度并记录病变得分和保护率。结果表明各组的特异性sIgA、IgG抗体水平显著高于对照组 (P<0.01)；口服pLA-VP2/L. casei组的淋巴细胞刺激指数显著高于其他组 (P<0.01)，保护率高达83.3%，免疫保护效果优于滴鼻/点眼组。因此，构建的重组干酪乳杆菌的安全性优于商品活苗，可以作为IBDV候选疫苗。

摘要:分别从大肠杆菌和化脓链球菌中扩增出编码UDP-葡萄糖脱氢酶基因ecohasB和spyhasB，并将其插入T7表达载体pRX2构建重组质粒pRXEB和pRXSB。在大肠杆菌BL21 (DE3) 中重组表达，并对经镍柱纯化后的UDP-葡萄糖脱氢酶的酶学性质进行分析。酶学性质研究表明：spyHasB的最适反应温度是30 ℃，最适pH 10，最适条件下的比活力是12.2 U/mg；ecoHasB的最适反应温度是30 ℃，最适pH 9，最适条件下的比活力是5.55 U/mg。从多杀巴氏杆菌扩增出的透明质酸合成酶基因pmuhasA分别与ecohasB和spyhasB构建共表达载体pBPAEB和pBPASB。将其转化到大肠杆菌BW25113中，经生物转化生产透明质酸 (HA)，并对转化条件进行了优化。结果表明：重组菌株进行透明质酸转化时，UDP-葡萄糖脱氢酶酶活力越高，稳定性越好，HA产量越高；转化条件优化后，pBPAEB/BW25113 和pBPASB/BW25113在摇瓶中的产量分别是1.52和1.70 g/L,比之前报道的提高了2?3倍。

摘要:恩拉霉素作为多肽类抗生素，是一种新型、安全的饲料添加剂。本文建立了一条基于大孔树脂初纯和反相色谱精制的分离纯化工艺。该工艺路线首先使用AB-8大孔树脂在0.012 mol/L盐酸溶液-甲醇 (50：50，V/V) 缓冲液条件下洗脱实现恩拉霉素初步纯化，再使用制备型C18反相色谱柱在0.05 mol/L 磷酸二氢钠-乙腈 (70：30，V/V) (pH 4.5) 缓冲液洗脱下实现恩拉霉素a和b的有效分离，a、b两个组分纯度分别达到98.5%和98.0%，a和b两种有效成分的总收率为29.2%。本研究为恩拉霉素a和b两种纯品的制备以及高纯度恩拉霉素产品的生产提供了参考。

摘要:我国南方春大豆种子发育过程中，常处于高温、高湿季节，加之种子本身富含蛋白 (约40%) 和脂肪 (约20%)，导致南方春大豆种子易劣变。本项目组前期差异蛋白质组学研究发现蔗糖结合蛋白在高温高湿胁迫168 h时在种子田间劣变抗性品种湘豆3号发育种子中呈下调表达。为进一步从分子水平了解GmSBP基因表达以及响应高温高湿胁迫的特性，本研究利用RT-PCR技术从大豆扩增出两个GmSBP基因(GmSBP2和GmSBPL)。两个基因编码的蛋白均为亲水性，不完整的膜蛋白。荧光定量PCR分析表明：在高温高湿条件下，种子田间劣变不抗品种宁镇1号和抗性品种湘豆3号发育种子中 GmSBP2和GmSBPL基因表达量均受高温高湿胁迫影响，也会导致种子中蔗糖和可溶性糖含量变化。在籽粒发育过程中，GmSBP2和GmSBPL基因表达量在花后30 d左右达到最高，对应时期的蔗糖和可溶性糖含量也达到最大值。组织特异性显示GmSBP和GmSBPL基因在不同组织间存在差异表达。亚细胞定位结果表明GmSBP2和GmSBPL蛋白均定位在细胞膜和细胞质中。以上结果表明GmSBP2和GmSBPL基因可能参与了植物非生物胁迫的应答过程，这将从一个侧面丰富我们对大豆种子田间劣变性和劣变抗性的认识。

摘要:AAV-ITR单链DNA微载体是一种基于腺相关病毒 (AAV) 倒置末端重复序列 (ITR) 的基因表达载体 (AAV-ITR ssDNA mini vector)。前期研究已证明AAV-ITR单链DNA微载体在HEK 293T细胞中具有较高的转染、表达效率。本文中将相同拷贝数的AAV-ITR单链DNA微载体、3?-ITR末端错配的AAV-ITR单链DNA微载体 (AAV-ITRmm ssDNA mutant vector)、AAV-ITR双链DNA和质粒分别用TurboFect转入小鼠骨骼肌中，比较检测AAV-ITR单链DNA微载体与其他基因表达载体在小鼠体内1周、1个月及3个月的表达效率。组织切片经荧光显微镜观察及荧光灰度值分析表明，相同分子摩尔数的AAV-ITR单链DNA微载体比AAV-ITR双链DNA和质粒在不同时期表达效率都要高且更稳定。提取注射3个月后的肌肉组织的DNA，用荧光定量PCR分析比较各载体的存留分子数。RT-PCR的结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在注射3个月后的存留分子数较其他载体高。综合结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在动物体内具有表达效率高和长久稳定的优势，有可能开发为基因治疗的一种高效、稳定的新型载体。

摘要:为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制，并研究其在多发性硬化症中的信号通路，本研究构建小鼠TBX21 (编码T-bet) 基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后，设计相应引物，用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp?28 bp片段长为1 028 bp的启动子区 (以翻译起始点ATG为+1) 和–3 308 bp?–2 000 bp片段长为1 308 bp的非编码区保守序列 (No-coding conserved sequence, CNS)，再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体 (pGL4.10) 中，构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体 (pGL4.10-TBX21pr-CNS)，电泳与测序鉴定，最后再将pGL4.10-TBX21pr-CNS与内参pRL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中，通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性，并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL4.10与内参pRL-TK。结果表明，成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒pGL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒pRL-TK组相比，293T细胞 (P＝0.012 2) 和Jurkat细胞 (P＝0.002 2) 中转染pGL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中pGL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性，为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。

摘要:为了探讨利用发根农杆菌遗传转化所产生的毛状根来创新香石竹种质的可能性，本文采用叶盘法，建立了发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes对香石竹Dianthus caryophyllus L. 叶片外植体的遗传转化及其植株再生体系。结果表明，发根农杆菌ATCC15834 感染香石竹幼嫩叶片外植体12 d后，从叶片外植体切口中脉处产生白色毛状根，21 d后约90%的叶片外植体产生毛状根。所获得的无菌毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基中快速自主生长。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C 基因以及冠瘿碱合成酶基因已在香石竹毛状根基因组中整合并得到表达。将毛状根置于MS+6-BA 1.0?3.0 mg/L +NAA 0.1?0.2 mg/L中培养15 d后产生淡黄绿色的疏松愈伤组织。愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，培养6周后不定芽分化率为100%；平均每个愈伤组织产生30?40个不定芽；将不定芽转至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培养基中10 d后产生不定根，发育成再生植株。再生植株移植于栽培基质中20 d后，成活率达95% 以上。

摘要:与转基因方法相比，基因瞬时表达系统在基因表达研究上具有快速便捷的特点。为检验水稻miRNA与靶标基因之间的调控关系，将MIRNA基因与GFP /靶标序列融合基因 (或GFP /靶标突变序列融合基因) 构建在同一瞬时表达载体上，并转化水稻原生质体，通过观察含有GFP /靶标序列融合基因和GFP /靶标突变序列融合基因的载体之间的荧光强度差异，以及通过qRT-PCR方法检测靶标和非靶标mRNA水平差异来验证miRNA对靶标基因的调控。用osaMIR156和osaMIR397及其靶标序列对实验设计方法进行验证，荧光显微观察和qRT-PCR检测证明，osamiR156和osamiR397能降低相应靶标序列GFP融合基因的转录物水平和GFP荧光水平。此种水稻原生质体瞬时表达方法用于在体内进行大规模miRNA靶标基因检测。由于其他近缘单子叶植物很可能与水稻有近似的小RNA加工系统，因此对于其他单子叶植物miRNA功能研究也将有很好的应用前景。

摘要:RNA-seq技术能够全面快速地获得物种在某一状态下的转录本序列信息，但测序并组装后的大量Unigene往往不包含完整ORF (Open reading frame)。转录组库具有一定的冗余性，存在着属于同一个转录本的Unigene，这些Unigene因为无重叠区不能拼接而存在转录组库中。基于这种情况，为了拼接铵转运蛋白家族Unigene，首先挑选注释为AMT (Ammonium transporter) 且ORF不完整的所有Unigene (5条)，通过分析Unigene在4个转录组的表达模式，其中2条Unigene (Uni4和Uni5) 具有相同的表达模式，推测可能来自同一转录本。然后通过NCBI blastx将这2条Unigene与参考物种的AMT蛋白质比对，确定其在转录本的位置及序列相互间没有交叠 (如果两条编码序列相互交叠则不能组成同一个转录本)。结果发现Uni4和Uni5分别位于参考转录本5′端和3′端位置，因此假定它们属于同一个转录本，中间空缺约120 bp未知序列。通过试验验证，分别在Uni4和Uni5上设计单正向引物和单反向引物，PCR扩增得到约800 bp片段，将其测序并与两条Unigene比对，证实Uni4和Uni5属于同一转录本且获得了缺失的未知序列。最终拼接得到1 667 bp序列，包含1 482 bp完整ORF，编码494个氨基酸，通过系统进化分析将其归类为amt1亚家族，命名为Seamt1。生物信息学手段预测SeAMT1蛋白与已知的其他物种AMT性质相似。本研究采用转录组Unigene表达模式聚类的方法挖掘潜在的同一转录本Unigene，并且通过另外两组Unigene检验了该方法的可行性。这一便捷方法有助于转录组中Unigene的延伸和拼接，有助于完整ORF的获得及后期基因功能研究。

摘要:原核表达小鼠17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-hsd10），制备抗17β-hsd10多克隆抗体，建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法 (Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。采用RT-PCR技术克隆得到小鼠肝脏17β-hsd 10基因，构建原核表达体系pET15b-17β-hsd10/ Escherichia coli BL21(DE3)，IPTG诱导重组蛋白表达，并优化表达条件；目的蛋白用His融合蛋白纯化柱（His-Binding-resin）纯化并免疫BALB/c小鼠和新西兰大耳白兔，免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化，用获得的高效价鼠源和兔源两种多克隆抗体，建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法。表达蛋白约为29.5 kDa，纯化后浓度为1.5 mg/mL，鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104，建立的检测方法对于多种羟基类固醇脱氢酶无交叉反应，特异性良好，可检出含量约为0.05 ?0.1 μg/mL的阳性血清。建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法，简便、快速、敏感，适合实验室研究科研广泛应用。并可能为检测阿尔茨海默病提供新思路和方法。

摘要:头孢类抗生素由于广谱性和低毒性被广泛用于细菌感染的治疗。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸 (7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA) 作为半合成头孢类抗生素的重要中间体，需求量逐渐增加，而7-ADCA主要由G-7-ADCA (苯乙酰-7ADCA) 脱酰基得到。工业上多以化学法合成G-7-ADCA，成本高，污染严重。迫切需要对环境友好且经济高效的合成方法。在前期研究中，构建了一株可以将青霉素G转化为G-7-ADCA的代谢工程菌 (E. coli H7/PG15)。本研究通过单因素试验对E. coli H7/PG15的G-7-ADCA合成过程进行优化，包括底物组成及其最适浓度，转化条件 (菌体浓度、pH、青霉素浓度、MOPS浓度、葡萄糖浓度，铁离子浓度和时间等)。优化后，建立了全细胞催化法生产G-7-ADCA的工艺流程，使G-7-ADCA的产量稳定在15 mmol/L左右，转化率达到30%，具有操作简便、高效和经济的优势。

摘要:腺病毒载体是极具发展前景的基因治疗载体之一，为获得一条新型腺病毒规模化生产工艺，研究采用5 L振荡激流式一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞来生产重组腺病毒载体。细胞经种子链逐步扩增后，接种至AP10生物反应器，采用CD293无血清培养基流加培养悬浮HEK293细胞，细胞密度达约2.0×106个/mL时，以30 MOI (Multiplicity of infection) 感染重组Ad-IFNγ (Recombinant adenovirus-interferon gamma)，48 h后收获细胞，3次冻融裂解离心收获上清病毒粗产品。采用壳蛋白免疫法快速测定粗产品滴度。结果表明，采用振荡激流式一次性生物反应器，流加HEK293细胞悬浮培养6 d，密度可达2.0×106个/mL，Ad-IFNγ粗产量达1.49×1013 IFU (Infectious unit)，单细胞包装量达3 800 IFU/cell。采用阴离子交换层析法纯化重组腺病毒，回收率35.9%。建立了利用5 L激流式一次性生物反应器悬浮培养HEK293细胞生产重组腺病毒载体Ad-IFNγ的初步工艺。

摘要:为了获取表达羧肽酶Taq毕赤酵母工程菌，通过密码子优化，依据毕赤酵母密码子偏爱性，在体外合成了栖热水生菌的耐热羧肽酶Taq基因。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A上并引入6×His标签，构建了重组质粒pHBM905A-Cpase Taq。将该重组质粒转化毕赤酵母GS115，经1%甲醇诱导表达72 h，酶产量达0.1 mg/mL。对纯化的重组酶进行酶活性分析表明在75 ℃，pH为7.5时，该酶比酶活性为80 U/mg。本研究首次证明了羧肽酶Taq能在毕赤酵母中有效分泌表达，可以被大量制备，进而为多肽水解为氨基酸奠定工业基础。

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