摘要:利用异源表达系统生产重组蛋白已成为现代基因工程和生物工程研究热点和重点。但是研究者发现并非所有的基因都能在异源宿主中高效表达，除了宿主、分泌途径、启动子等因素外，基因自身的序列也蕴含了多种影响蛋白表达的因素，如密码子偏爱性，密码子对偏爱性，GC含量，mRNA二级结构，mRNA稳定性等。从基因设计的角度对影响蛋白表达的因素和方法进行了综述，尤其是对密码子优化和密码子对优化，详细讨论了与传统基因优化理念截然不同的密码子协调化及密码子对协调化等最新进展。

摘要:5-氨基乙酰丙酸是生物体内吡咯生物合成途径的关键中间产物，具有广泛的应用前景。文中从三方面归纳了国内外关于5-氨基乙酰丙酸的最新研究进展：生产5-氨基乙酰丙酸的微生物筛选分离与诱变；基于C4途径的微生物全细胞生物转化合成5-氨基乙酰丙酸；基于微生物代谢工程改造构建高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌株。最后，预测了未来5-氨基乙酰丙酸的研究方向和焦点。

摘要:甘露糖赤藓糖醇脂是一种糖脂类生物表面活性剂，主要由霉菌和酵母菌等微生物发酵生产，具有良好表面活性和特殊生物活性，其在食品、医药、化妆品等领域有着潜在的应用前景。近年来，其研究在国外备受关注，而国内却鲜有报道。文中综述了甘露糖赤藓糖醇脂的发酵生产、多样性结构及活性、构效关系、生物合成途径等方面的相关研究，对存在问题进行了分析，并探讨了今后的研究重点。

摘要:探讨α-环糊精糖基转移酶 (CGT酶) 活性区域-3亚位点 (47位赖氨酸残基)，-7亚位点 (146~152位氨基酸残基) 以及环化中心位点 (195位酪氨酸残基) 对其催化底物形成γ-环糊精 (CD) 能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变：K47T，Y195I，以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸 (命名为△6)，并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化，利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明，和野生酶相比，所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面，突变酶Y195I的催化产物中，α-CD的含量由68％降为30％，β-CD由22.2％提高为33.3％；而γ-CD由8.9％提高为36.7％，含量提高了4倍，取代α-CD成为产物中的主要成分；γ-CD的实际产量为1.1 g/L，是野生酶 (0.4 g/L) 的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降，但仍然是产物中的主要组分，β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见，活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响，Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明，其最适反应温度和野生酶相同，但最适反应pH有所提高，且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此，突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。

摘要:探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因，对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个 bgl基因 (1 752 bp)，编码的蛋白约65 kDa，推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后，以七叶苷为底物进行了酶学分析，结果表明该酶的最适温度是45 ℃，最适pH在5.5~6.0之间，对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定；70 ℃保温2 h后仍能保持60％的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响，Ca2+对重组酶有轻微的激活作用，而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高，为进一步的研究与应用奠定了基础。

摘要:研究构建能够分泌表达纤维素酶的产乙醇菌株，实现降解木质纤维素生产乙醇的整合生物加工过程。文中通过克隆来自运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB，并通过Red重组将二者整合到大肠杆菌Escherichia coli JM109基因组中，首先构建了一株可以利用葡萄糖进行乙醇发酵的重组菌E. coli P81。随后将来源于多粘芽胞杆菌Bacillus polymyxa1.794的β-葡萄糖苷酶基因bglB在E. coli P81中进行了分泌表达，得到了一株可以进行纤维二糖降解和乙醇发酵双重功能的重组菌E. coli P81(pUC19-bglB)。该菌胞外分泌β-糖苷酶活达到84.78 mU/mL菌液，纤维二糖酶活达到了32.32 mU/mL菌液。该重组菌E. coli P81(pUC19-bglB) 以纤维二糖为碳源进行乙醇发酵，乙醇得率达到了理论产率55.8％，而在葡萄糖和纤维二糖的共发酵中，其乙醇产量达到了理论产率46.5％。构建得到的此株整合生物加工大肠杆菌能够利用β-葡萄糖苷酶生产乙醇，为构建能利用木质纤维素分解产物生产燃料乙醇的高效、稳定生产用工程菌奠定了良好的基础。

摘要:以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此，首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶 (LdhA) 的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株E. coli CICIM B0013-080C (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上，获得了L-乳酸高产菌株E. coli CICIM B0013-090B (B0013-080C，lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后，建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上，发酵27 h，积累L-乳酸132.4 g/L，产酸强度4.90 g/(L·h)，甘油到L-乳酸的得率为93.7％，L-乳酸的光学纯度达到99.95％。

摘要:利用代谢工程手段改造克雷伯菌Klebsiella sp. HQ-3产氢途径中相关代谢调控因子及辅酶因子，以构建高效产氢工程菌。利用简并引物，以Klebsiella sp. 总DNA为模板，克隆了甲酸-氢裂解酶系统的全局转录调控因子 (FNR) fnr基因、编码甲酸脱氢酶 (FDH-H) fdhF基因，以及NADH途径中编码烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)的pncB基因，构建了3种同源过表达重组菌株HQ-3-fnr、HQ-3-fdhF和HQ-3-pncB，以研究同源过表达产氢代谢调控因子及辅酶因子对克雷伯菌累积产氢、细胞生长、代谢终产物的影响。结果表明，过表达fnr、pncB和fdhF基因的克雷伯工程菌的产氢效率比携带空载体的克雷伯对照菌株分别提高12.26％、11.62％和7.28％；重组菌HQ-3-fnr、HQ-3-fdhF和HQ-3-pncB的葡萄糖利用率较克雷伯对照菌株HQ-3-C明显增加，过表达fnr、fdhF基因使代谢合成甲酸量增多；过表达pncB基因能促进NADH合成，使更多的NADH流入消耗NADH较多的乙醇与琥珀酸代谢路径，使得乙醇和琥珀酸含量增加，而乳酸含量降低。

摘要:2,3-丁二醇是克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的主要副产物，为减少2,3-丁二醇的产生，利用Red重组技术对克雷伯氏菌2,3-丁二醇合成途径关键酶基因budC和budA进行了敲除。突变株发酵性能实验结果表明，所获得的两株突变株生长性能受到不同程度的影响；budC基因的缺失使菌株1,3-丙二醇产量提高了10％，2,3-丁二醇降低为原来的70％，而budA基因缺失则使菌株无2,3-丁二醇和1,3-丙二醇的产生，但乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的产量较出发菌株都有明显增长。通过进一步对budC基因缺失菌株主要产物分析，推测在该菌中存在2,3-丁二醇回补途径，这一结果为低副产物克雷伯氏菌的改造提供了新依据。

摘要:对生物体内已有的或者人工组装的生物合成途径进行优化操作涉及两个重要问题：代谢途径中关键酶的活性及蛋白表达水平。对于酶表达水平的研究，传统的做法是采用强启动子控制下的靶蛋白过量表达策略。靶蛋白的过量表达通常会导致细胞内积累大量的无活性包涵体，从而严重影响细胞的生理状态和相关生物途径的有效运转。针对这一问题，设计一种分子开关来精确调控生物合成过程中关键酶的表达水平，对于研究生物合成途径的代谢节律以及促进生物合成途径高效运转都具有重要的实用价值。基于细菌群落中普遍存在群感效应的基本原理并结合酶促催化的动力学特征，首先在大肠杆菌群落中建立信号分子高丝氨酸内酯 (AHL) 介导的细胞–细胞交流机制，将靶基因egfp置入到启动子PluxI的控制之下。在细胞生长过程中，产生的AHL累积到一定浓度启动靶基因表达。通过在细胞生长的不同阶段启动AHL降解酶AiiA的表达控制环境中信号分子AHL的浓度水平，从而控制靶基因egfp的转录效率，最终实现对靶蛋白EGFP表达水平的精确控制。通过检测细胞的生长状态、靶基因在mRNA水平、蛋白质水平的表达情况证明人工设计的分子开关可以便捷高效地控制靶基因表达水平，具有时空调节的严谨性。该分子开关有望广泛应用于代谢工程和合成生物学等研究领域中。

摘要:弗里德赖希共济失调 (Friedreich ataxia，FRDA) 是一种常染色体隐性遗传性疾病，由frataxin (FXN)第一个内含子中GAA重复扩增导致其表达量减少所致。FXN是一种线粒体蛋白，可以调节细胞中铁的代谢，参与铁硫簇和血红素的合成，去除氧化应激等。前期研究发现FRDA病人受累组织有特异性表达的FXN亚型蛋白。为了检测小鼠不同组织中Fxn亚型蛋白的表达，首先要获得具有高度特异性和灵敏性的小鼠Fxn抗体。利用PCR技术扩增小鼠Fxn基因，通过酶切、连接、转化等常规分子克隆方法构建重组原核表达质粒pET24(+)-mFxn，经转化大肠杆菌BL21 (DE3)，表达可溶性含有his6标记的融合蛋白。该蛋白不含Fxn氨基端77个氨基酸的信号肽，含有130个氨基酸，理论分子量为14.38 kDa。表达的蛋白经Ni-NTA柱和连续梯度离心纯化，获得目的蛋白作为抗原；免疫新西兰大白兔制备抗血清并用硫酸铵沉淀初步纯化得到多克隆抗体。经Western blotting和免疫荧光分析测试，所获得的抗体能够特异性识别细胞内源Fxn，也可应用于组织的免疫沉淀和免疫荧光。这是首次报道利用鼠源Fxn作为免疫原制备的具有高度特异性和灵敏性的Fxn抗体，为深入研究小鼠frataxin亚型蛋白的存在和功能奠定了基础。

摘要:基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道，研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1，融合his-tag标签，构建酵母表达载体，在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明，P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示：P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高，且远高于BL21(DE3) 中的表达，相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3) 的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达，为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础，也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。

摘要:针对蓝细菌代谢工程改造的需求，成功构建了可以在模式蓝细菌菌株集胞藻PCC6803中高效表达外源基因的3个基因组整合表达平台，以及1个可以在多株蓝细菌中表达的广宿主穿梭表达平台。该表达平台通过选用集胞藻PCC6803中1,5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶的启动子驱动外源基因的表达，应用“SD-AUG”翻译融合的策略提高外源蛋白翻译效率，以及加入终止子序列Trbc以提高转录终止效率，实现了对外源基因的高效表达。利用lacZ作为报告基因，检测了所构建表达平台pFQ20在集胞藻中的基因表达效率，结果显示β-半乳糖苷酶的活性为109 Miller。同时，基于pFQ20表达平台在集胞藻PCC6803中表达了来自大肠杆菌的硫酯酶基因tesA’，蛋白印迹实验结果显示了硫酯酶的成功表达。该表达平台为在蓝细菌中开展遗传研究及基因工程改造提供了有用的遗传工具，其构建策略为在蓝细菌中构建高效稳定的外源基因表达元件提供了借鉴。

摘要:

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