摘要:

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摘要:植物次生代谢产物种类极其丰富，是人类的宝贵资源，这些产物及其合成途径相关酶具有空间特异性分布的特征。植物次生代谢途径的调控是个复杂的过程，受代谢产物水平、多酶复合物相互作用等多种因素的影响。通过遗传操作改造代谢过程，调控产物在植物体内的含量，是一条切实可行和具有广阔发展空间的途径。目前，改造植物次生代谢途径可以采取单基因操作和多基因操作两种策略进行。

摘要:sall4基因是sall基因家族的一个成员，在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用，有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用，对猪的sall4基因进行了克隆测序，并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5￠和3￠RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列 (2 372 bp)，序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型，同源性可达70％~80％，而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段，同源性降至30％~55％。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官，其中除卵巢组织呈高量表达之外，脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高；在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低，其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中，在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关，预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。

摘要:Nisin是一种广泛应用于食品工业的抗菌素。通过基因工程手段分别构建了Nisin A前体结构基因nisA的穿梭表达载体pMG36ek-nisA和整合型载体pDG780-nisA，并转入Nisin A产生菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis ATCC 11454中，得到两株基因工程菌FMM1和FMM2。对比工程菌和原始产生菌的生长状态及Nisin A产量，结果表明FMM1的生长速度、生物量以及发酵液的酸碱度没有显著变化，而Nisin A产量提高了31％；相反，FMM2的生物量较原始菌株显著降低，但Nisin A产量也有一定程度的提高。通过RT-PCR检测工程菌与原始产生菌Nisin A生物合成基因簇中11个基因的转录水平，结果显示FMM1和FMM2的11个基因的转录水平均有提高，其中FMM1提高更为显著。因此推测，nisA是Nisin A高产的关键因素之一，其游离型过量表达能显著提高Nisin A的产量。该研究为采用基因工程手段提高Nisin A的产量提供了新的思路，并对Nisin A的大规模工业生产有指导意义，同时，也为其他抗菌肽产生菌的基因工程改造提供了参考。

摘要:cry1Ah1基因是本实验室克隆的具有自主知识产权的模式基因，对鳞翅目害虫水稻二化螟等具有高毒力，具有较好的应用前景。为提高cry1Ah1基因在水稻中的表达量，探讨密码子使用频率对基因表达的影响，依据水稻密码子使用频率设计5种不同的优化方案，提高GC含量并去除剪切信号等不稳定因素后合成cry1Ah1基因杀虫活性区域。优化后的基因在大肠杆菌Rosetta (DE3) 中正常表达了65 kDa蛋白，表达蛋白对2龄小菜蛾和水稻二化螟初孵幼虫都具有良好的杀虫活性。优化的基因转化水稻日本晴后，PCR阳性率达到87％以上，实时荧光定量RT-PCR和ELISA分析表明全部采用最高频率密码子的优化方案效果最好，Cry1Ah蛋白平均表达量占可溶性蛋白的0.104％。

摘要:哺乳动物肝细胞中cyp2e1基因所编码的蛋白CYP2E1在代谢异型有机物方面起着重要作用，转cyp2e1基因植物可以代谢多种小分子有机污染物；但cyp2e1基因在植物体内的表达调控和代谢机理尚不完全清楚。文中将含有cyp2e1基因的质粒pSLD50-6和对照gus基因的质粒pKH200转入根癌农杆菌GV3101，利用根癌农杆菌转基因技术将cyp2e1基因和对照gus基因成功转入烟草，分别获得了转cyp2e1和gus基因再生植株。选取PCR鉴定的再生植株进行荧光定量PCR (qRT-PCR) 分析，结果表明：在转录水平上，转cyp2e1基因烟草中，乙醇处理后cyp2e1基因的表达明显下降，苯和甲苯处理后cyp2e1基因的表达量稍有下降；而丙酮、甲醛处理和缺氧条件下cyp2e1基因的表达有不同程度的升高。此外，苯处理后，转cyp2e1基因烟草中NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5酶的基因活性显著提高，说明烟草中NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5酶与CYP2E1酶的解毒过程有关，可能起到哺乳动物体内的NADPH-P450氧化还原酶和细胞色素b5的功能，参与CYP2E1酶催化过程的电子传递链。

摘要:热休克蛋白27 (Heat shock protein 27，HSP27) 是一种具有多重功能的小热休克蛋白，它在一些病毒的生命周期中也发挥着重要作用。为研究HSP27对流感病毒感染的调节作用，首先在原核及真核细胞中克隆并表达了人源的HSP27蛋白，并验证了HSP27和A型流感病毒NS1蛋白能够相互结合。通过荧光素酶检测试验发现，HSP27可以抑制病毒感染细胞中β干扰素 (IFN-β) 的表达，但不依赖于其自身的磷酸化状态，而且HSP27与NS1共同对于IFN-β的表达具有叠加抑制效果。进一步的结果表明HSP27可能通过RIG-I样RNA解旋酶 (RLH) 途径中MDA5因子抑制IFN-β的表达。研究表明，HSP27在被感染细胞的天然免疫中发挥一定作用，有助于进一步阐明宿主因子对于流感病毒感染的调节机理。

摘要:对羟基丁酸-羟基己酸共聚酯 (PHBHHx) 膜进行表面改性，研究神经干细胞 (NSCs) 在改性后的PHBHHx膜表面的贴附、增殖及分化情况，为开发新型脑组织工程支架材料奠定基础。采用溶剂挥发法制备PHBHHx膜，扫描电镜观察其表面性状；分别通过脂肪酶处理，NaOH处理的方法对PHBHHx膜进行表面改性，测量接触角以检测膜表面亲水性。分离培养孕14.5 d大鼠胚胎大脑皮质NSCs，接种在表面改性后的PHBHHx膜表面进行体外培养，扫描电镜观察膜表面细胞形态，MTT法检测细胞活力，免疫细胞化学染色观察NSCs存活和分化情况。结果显示，与未处理的PHBHHx膜相比，脂肪酶、NaOH处理能够显著提高PHBHHx膜表面亲水性，增加NSCs在PHBHHx膜表面贴附数量；NSCs在改性后的PHBHHx膜表面能够良好地存活并分化为神经元和胶质细胞。结果提示PHBHHx膜表面碱处理通过提高材料表面亲水性和粗糙程度，增加其与NSCs的生物相容性，改性后的PHBHHx材料是一种非常有潜力的新型脑组织工程支架材料，有望在NSCs移植修复脑损伤中发挥作用。

摘要:旨在探究聚乙二醇修饰重组细胞珠蛋白 (PEG modified recombinant cytoglobin，PEG-rCygb) 对小鼠急性肝损伤的保护作用。采用CCl4诱导KM小鼠急性肝损伤模型，尾静脉注射PEG-rCygb，收集血清及肝脏组织检测各项生化指标及组织病理学变化。结果表明，PEG-rCygb治疗组小鼠肝脏系数减小, 血清中AST﹑ALT水平降低, 肝组织匀浆中MDA含量减少, GSH含量增加，T-SOD、CAT活性升高。肝组织切片HE染色显示PEG-rCygb可以缓解肝细胞脂肪变性, 减少炎症因子, 减轻肝细胞损伤。体外细胞学实验表明rCygb经PEG修饰后对H2O2造成的肝星状细胞 (HSC) 氧化损伤发挥的保护作用增强。研究结果显示PEG-rCygb提高了机体对自由基的清除能力, 对CCl4引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

摘要:旨在建立一种分泌型荧光素酶基因标记的小鼠原位移植型肝癌模型并观察其对干扰素β基因治疗的反应。首先建立稳定表达分泌型荧光素酶Gluc (Gaussia princeps luciferase) 的小鼠肝癌细胞Hepa 1-6/Gluc;将该细胞通过脾注射至C57BL/6小鼠肝脏建立原位移植型肝癌模型，通过检测外周血Gluc活性监测小鼠体内肿瘤生长情况；用此模型观察水动力注射干扰素β质粒DNA的抗肿瘤效果。结果表明，通过脾注射Gluc基因标记的Hepa 1-6细胞可以建立小鼠原位移植型肝癌模型;外周血Gluc活性可以有效反映体内接种肿瘤细胞的数量和肿瘤的生长情况;通过监测外周血Gluc活性可灵敏反映干扰素β基因治疗对肿瘤生长的抑制作用。本研究表明，利用Gluc为报告基因建立的小鼠原位移植型肝癌模型可以体外实时监测肿瘤的生长情况，并能灵敏可靠地用于抗肿瘤治疗效果的评价。

摘要:旨在初步筛选出成骨不全症 (Osteogenesis imperfecta，OI) 患者血清中差异表达的骨相关microRNAs (miRNAs)，通过探讨其在该疾病中的可能作用，为进一步研究成骨相关miRNA的功能及miRNA在成骨不全症诊断中的应用奠定基础。首先用geNorm和NormFinder等程序挑选出适于血清miRNAs定量检测的内参基因，然后利用实时荧光定量PCR技术对miRanda，Targetscan和Pictar软件以及文献报道筛选出的骨形成相关miRNAs进行定量检测，最后用配对t检验统计学方法筛查出差异表达的骨相关miRNAs。结果显示6个候选内参基因在不同年龄、性别和用药情况的成骨不全症患者和健康个体血清中的表达稳定性良好 (表达稳定值M<1.5)，后经标准化因子配对差异 (Pairwise variations) 分析确定最适内参数目为4个 (配对差异值V4/5 = 0.133<0.15)，分别是miR-16、Let-7a、snRNAU6、miR-92a。通过在16个成骨不全症患者以及8个健康对照个体的血清中进一步检测miR-16、Let-7a、snRNAU6和miR-92a，发现其表达稳定性依然良好 (M<1.5)。对100余种骨相关miRNAs进行实时荧光定量检测，发现11种miRNAs在成骨不全症患者血清中有差异表达 (P<0.05)，并且生物信息学分析显示这些差异表达的miRNAs 很可能在成骨不全症的发生发展中起重要作用。以上实验结果表明成骨不全症患者血清中存在多种差异表达的骨相关miRNAs，而且这些miRNAs很可能成为一种用于成骨不全症血清学检查及诊断的生物标志物。

摘要:为研究心脏发育关键基因nkx2.5的功能及应用价值，构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒，并检测nkx2.5过表达拮抗氧化应激损伤的效应及机制。采用AdEasy 腺病毒表达系统构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒，建立H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡模型，分别用Ad-Nkx2.5重组病毒或对照病毒感染细胞，采用Hoechst33342染色观察细胞形态变化、MTT法检测细胞存活率，免疫印迹检测caspase-3活化、细胞色素C的胞浆含量。并通过Real-time PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax表达。结果发现，nkx2.5过表达促进H9c2细胞存活，抑制H2O2诱导的caspase-3活化及线粒体细胞色素C的释放。Nkx2.5过表达上调bcl-2表达，显著下调H2O2诱导的bax表达。并发现H2O2对Nkx2.5核定位无明显影响。结果显示重组腺病毒介导的Nkx2.5过表达可通过调控凋亡相关基因表达，抑制线粒体凋亡途径，保护心肌细胞抗氧化损伤。

摘要:为在毕赤酵母中表达纤维连接蛋白C端肝素结合域 (Fibronectin C-terminal heparin-binding domain FNCHBD) 多肽并研究其功能，通过PCR技术扩增FNCHBD目的基因，将目的基因与T载体连接，经测序正确后，插入pAo815SM酵母表达载体增加基因拷贝数，然后酶切克隆入酵母表达载pPIC9K；将重组质粒Sal I 酶切线性化后转化毕赤酵母菌株，筛选工程菌，经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵上清液，表明有重组蛋白FNCHBD多肽的高表达，表达产物通过离心、超滤、离子交换层析纯化，纯化产物通过SDS-PAGE、Western blotting印迹、质谱及肝素亲和层沉析对表达产物进行鉴定。结果表明利用酵母工程菌成功表达和纯化了FNCHBD多肽，多肽的分子量接近32 kDa，纯化产物的纯度可达95％以上，能被FN多克隆抗体特异识别且具有多肽肝素结合活性，为后续结构及功能的研究奠定基础。