摘要:遏蓝菜Thlaspi caerulescens可以在其地上部累积大量重金属如锌、镉等，是公认的超富集植物。由于该植物生物量小，不宜直接用于重金属污染的土壤植物修复，而被广泛作为一种模式植物来进行重金属富集机制研究。遏蓝菜对重金属离子的累积大致经过螯合剂解毒、地上部长距离运输以及在液泡中的储存等生理过程。已经发现的植物体内的金属螯合剂——有机酸、氨基酸、植物络合素(PCs)、金属硫蛋白(MT) 和尼克烟酰胺NA等，区室化以及长距离运输相关的转运蛋白——ZIP (ZRT/IRT like protein)、CDF (Cation diffusion facilitator)、Nramp (Natural resistance and macrophage protein) 和HMA (Heavy metal ATPase) 等家族，以上各种基因、多肽与蛋白等共同参与了植物对金属累积与耐受过程并发挥各自重要的作用。以下主要介绍了遏蓝菜重金属超富集相关的基因、多肽和蛋白，以及它们在重金属螯合作用和运输过程中的功能。

摘要:胚胎晚期富集蛋白 (Late embryogenesis abundant，LEA) 是参与生物体抵抗干旱胁迫的一类重要蛋白。LEA蛋白可分为7组。大多数LEA蛋白具有亲水性及热稳定性。LEA蛋白在水溶液中通常为无折叠状态，但脱水胁迫可诱导其转变为α-螺旋。近年来关于LEA蛋白的研究取得了较多进展。研究结果表明LEA蛋白可定位于细胞内的多种细胞器中，且LEA蛋白可能具有多重保护作用，如保护蛋白质及酶活性、或保护细胞的膜结构、或具有抗氧化作用、结合离子或保护DNA等。以下主要介绍了LEA蛋白的功能、二级结构及保护作用机制。

摘要:体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中，通过体外激活和培养，再移植入受体母畜子宫内，繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率，并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来，美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而，目前体细胞克隆效率相当低下，即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象，在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下，宣布克隆动物产品上市是否为时过早？以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。

摘要:表观重编程异常是核移植胚胎发育异常的重要原因。为了研究克隆山羊胎儿不同组织中H19基因CpG岛甲基化水平和相对表达量，本实验运用亚硫酸盐法和荧光实时定量PCR法分别检测了死亡克隆山羊胎儿和同期普通山羊胎儿 (对照组) 肝脏、胎盘、肾脏、肺脏和心脏组织中H19基因CpG岛甲基化水平和mRNA的相对表达量。结果表明，克隆山羊胎儿胎盘组织中H19基因第5个CpG岛的甲基化水平显著高于对照组 (70％ vs 49.41％，P＜0.05)，H19基因相对表达量显著低于对照组 (883.3 vs 1264.5，P＜0.05)；肺脏组织甲基化水平显著低于对照组 (63.53％ vs 88.24％，P＜0.05)，相对表达量显著高于对照组 (1003.4 vs 515.5，P＜0.05)；其他各组差异不显著 (P＞0.05)。结果说明，H19基因在克隆山羊胎儿部分组织中DNA甲基化重编程异常，而且这种异常影响H19基因的正常表达，这也可能是导致克隆动物死亡的重要因素之一。

摘要:为了保护和合理利用我国地方山羊品种遗传资源提供理论基础，本研究利用国际农粮组织和国际家畜研究所推荐的10对微卫星引物，结合荧光标记PCR，检测了中国9个地方山羊品种和1个引进山羊品种的遗传多样性。所研究的10个品种中7个呈现出高度多态，3个呈现出中度多态。并共检测到119个等位基因，有效等位基因数在1.4641~9.2911之间，座位平均杂合度在0.2618~0.7672之间，品种平均杂合度在0.5196~0.7024之间，其中SRCRSP23位点和河西绒山羊 (HXR) 平均杂合度最高。聚类关系 (NJ和UPGMA) 和主成分分析结果与其起源、育成历史及地理分布基本一致。

摘要:将近期引起传染性法氏囊病 (IBD) 免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒 (IBDV) vp2基因，定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中，构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2，转化Escherichia coli DH10Bac感受态，筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞，用间接免疫荧光试验 (IFA) 检测，具有特异性荧光；用IBDV抗体夹心ELISA检测，呈阳性反应，抗原效价达到1.6×103；用Western blotting分析，在53 kDa处出现一条特异蛋白条带；电镜观察，重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒，在感染细胞中发现了“包涵体样”结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原，建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物，免疫2周龄SPF鸡，一次免疫14 d后，ELISA检测抗体效价为8×102，中和抗体效价为1106，攻毒实验的存活率为30％；二次免疫14 d后，ELISA抗体效价为3.2×103，中和抗体效价为2536，存活率为100％。在实验观察7 d内，重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化，法氏囊/体重比高于对照组 (P＜0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

摘要:前期实验在稀释速率为0.027 h?1的高浓度乙醇连续发酵过程中，发现了一种长周期、宽振幅的参数振荡现象。本实验进一步考察了不同稀释速率下的连续发酵过程，发现在稀释速率为0.04 h?1条件下，也能出现类似的振荡现象；在稀释速率为0.027 h?1或0.04 h?1的条件下，改变系统的初始状态可以得到振荡和稳态两种不同的发酵过程。比较振荡和稳态过程的实验数据后，发现在稀释速率为0.04 h?1的条件下，与稳态过程相比，振荡过程的平均残糖浓度降低了14.8％，平均乙醇浓度提高了12.6％，平均设备生产强度提高了12.3％。进一步分析表明：与稳态过程相比，振荡过程动力学行为不仅存在滞后，而且在相同残糖和乙醇浓度条件下，所对应的平均比生长速率提高了53.8％。

摘要:本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因，并将其克隆到表达载体pINA1297中，得到表达载体pINA1297-phyA，利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中，通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株，阳性菌株在YM培养基中28℃培养6 d后酶活达到最大为636.23 U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130 kDa，但通过去糖基化处理后其分子量变为51 kDa，与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5，最适温度为55℃，该酶在pH 2.0~8.0处理1 h后仍有较高酶活，并且90℃处理10 min后还有86.08％的残留酶活，其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。

摘要:植酸酶和内切葡萄糖苷酶广泛应用于动物饲料添加剂中，能更有效地帮助饲料的利用，同时为动物的生命活动提供必需的重要物质。首先构建重组质粒pPICZα-EG，经过线性化后，电转化到含有植酸酶phyA基因的毕赤酵母感受态细胞中，构成含有植酸酶基因和内切葡萄糖苷酶基因的重组体菌株GS115-phyA-EG。经甲醇诱导后其活性分别达到出发菌株GS115-phyA和GS115-EG的39.4％和56.2％。酶学性质的分析显示，最适反应温度和最适反应的pH值分别为55℃和5.5，植酸酶和内切葡萄糖苷酶在温度为45℃~55℃，pH值为4.5~5.5时，酶活相对稳定，均能达到最高酶活的80％以上。结果表明这种在同一个系统种同时表达2种酶的方法能更好地节约时间和成本，使其在饲料工业的应用上有更广阔的前景。

摘要:通过定点突变的方法，在来源于里氏木霉Trichderma reesei的木聚糖酶XYN II的N-末端两个β折叠片层间添加二硫键，以提高木聚糖酶的稳定性。原酶XYN-OU和突变酶XYN-HA12 (T2C、T28C和S156F) 分别在毕赤酵母中分泌表达，突变酶与原酶纯化后进行酶学性质比较。结果表明：突变酶最适反应温度由50℃提高到60℃；在70℃的半衰期由1 min提高到14 min；最适反应pH为5.0，与原酶保持一致，但是在50℃、30 min条件下的pH稳定范围由4.0~9.0扩展到3.0~10.0。对木聚糖酶分子改良的结果反映出在β片层间添加二硫键可以有效改善酶在较高温度下三维结构的刚性，提高热稳定性。

摘要:为了实现增强型绿色荧光蛋白基因 (egfp) 在生防真菌淡紫拟青霉9410菌株中的转化，借助中间质粒pcDNA3.1(-) 构建nptⅡ-egfp融合基因的表达载体pUPNGT，然后采用根癌农杆菌介导的转化法将egfp基因转化到淡紫拟青霉9410菌株中。PCR检测和Southern blotting分析结果表明，egfp基因以单拷贝形式整合到淡紫拟青霉9410的基因组中。荧光显微镜观察结果显示，转化子在488 nm下能产生绿色荧光。这些结果说明egfp基因已成功转化至淡紫拟青霉9410菌株并获得表达。这些工作可为淡紫拟青霉在不同条件下的防效评价、环境安全评价等提供新的途径和方法。

摘要:采用电融合法获得了骆驼刺和鹰嘴紫云英属间体细胞杂种。骆驼刺原生质体来自发根农杆菌A4转化系细胞，并经碘乙酰胺处理；鹰嘴紫云英原生质体从甲硫氨酸抗性系细胞分离。双亲及同源融合产物均不能在无激素的筛选培养基上持续分裂，融合后的杂种细胞由于双亲生理互补效应可恢复持续分裂能力而被筛选出来。本实验优化了电融合参数，如直流脉冲、交流脉冲和脉冲次数。融合产物经培养获得的杂种细胞系经形态学、染色体数目检查、生化及随机扩增多态性DNA分析，鉴定出10个杂种克隆，并从3个杂种克隆再生了小植株。

摘要:为探讨心钠素基因转移治疗高血压和慢性心肾功能衰竭等慢性疾病的潜力，首先利用逆转录病毒载体获得可表达和分泌人心钠素的遗传工程细胞，然后将这种细胞植于自发性高血压大鼠SHR的皮下。结果发现，人心钠素遗传工程细胞的移植可使动物血浆中的心钠素浓度在移植后第7天时明显升高。在整个实验期间，虽然实验组动物的血压会随个体发育而逐渐升高，但在实验开始后的42 d内却始终明显低于空载体组，其中第14天血压的差异高达33 mm Hg。在实验开始后的第14天和第21天，实验组动物的尿量也明显增加。以上结果说明，人心钠素遗传工程细胞的皮下移植可明显抑制SHR大鼠血压的上升趋势和改善其泌尿功能，提示该方法具有治疗高血压和慢性心肾功能衰竭等慢性疾病的潜力。

摘要:高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康，因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象，PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段，构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外，还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠，共免疫4次，每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗，第2、4次用重组腺病毒载体疫苗，每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答，末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究，为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。

摘要:单纯疱疹病毒 (Herpes simplex virus，HSV) 包膜糖蛋白D (glycoprotein D，gD) 是HSV的结构蛋白之一，具有重要抗原表位，是目前疫苗研究的热点。为了分离纯化HSV gD1糖蛋白胞外区片段并对其生物学活性进行分析，本研究将化学合成的gD1胞外区基因片段克隆至真核表达载体pCEP4，重组质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达，产物经Western blotting检测后用亲和层析法进行分离纯化，ELISA检测其抗原性。以纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠，ELISA测血清特异性抗体效价以评价其免疫原性。构建的重组质粒经测序显示基因序列完全正确。表达产物的Western blotting分析发现，在相对分子量约46 kDa处有外源蛋白表达，与预期蛋白带一致。用Ni柱得到了纯化的重组gD1蛋白，ELISA检测显示其具有良好的抗原性，免疫小鼠7周后血清中抗体效价达到5×103。重组gD1蛋白的抗原性及免疫原性分析为HSV检测试剂和基因重组亚单位疫苗的研制提供了实验依据。

摘要:血管紧张素转化酶 (ACE，EC3.4.15.1) 在调节血压方面具有重要作用，研究证实，ACE-C结构域是体内使血管紧张素I (AngI) 分解的主要活性位点。PCR扩增ACE-C结构域基因片段，克隆至分泌表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母GS115，阳性克隆再次电转，用G418筛选高拷贝的酵母菌落进行表达条件优化，获得0.5 g/L的蛋白表达量及7.178 U/mL的酶活力。经Ni+亲和层析纯化，获得纯度大于97％的目的蛋白。Captopril对酶的抑制试验证明ACE-C结构域可望成为新一代抗高血压药物ACE抑制剂筛选的理想酶靶。

摘要:核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB) 的激活被认为与中枢神经系统变性疾病的进展有关。新近报告Nanog能抑制NF-κB的表达，为验证这一发现，通过限制性内切酶酶切和基因重组的方法，构建携带Nanog基因的重组慢病毒表达载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP，经PCR检测以及测序鉴定后，在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞 (mMSCs) 后，Western blotting法检测在mMSCs中Nanog 基因的表达，PCR、Western blotting和免疫细胞化学法检测NF-κB基因的表达。结果显示所克隆的Nanog基因测序结果与GenBank报道序列完全一致。构建的慢病毒载体质粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP经Sal I和BamH I双酶切后电泳鉴定正确。所获慢病毒感染mMSCs后荧光激发mMSCs可见绿色荧光，Western blotting检测显示Nanog-mMSCs 组表达Nanog，其他两组基本不表达。RT-PCR和Western blotting检测显示Nanog-mMSCs组的NF-κB表达较空载体-mMSCs组及mMSCs组低，有显著性差异。构建携带Nanog基因慢病毒载体并在小鼠骨髓间质干细胞中成功表达，Nanog基因的表达可抑制NF-κB表达，这结果为神经变性疾病的治疗提供了新思路。

摘要:本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5载体包装系统。首先，将5型腺相关病毒 (AAV5) 的rep和cap基因插入I型单纯疱疹病毒 (HSV-1) 基因组非必需基因UL2中，获得重组病毒rHSV1-rep5cap5。其次，构建一种携带AAV5 ITR的通用型载体质粒pAAV5neo，将报告基因EGFP插入pAAV5neo中，得到pAAV5neo-EGFP质粒。将pAAV5neo-EGFP质粒导入BHK-21细胞，用G418选择培养，挑选出表达EGFP并在重组病毒rHSV1-rep5cap5感染下能高效产生rAAV5/5-EGFP的单克隆载体细胞株C020。用rHSV1-rep5cap5感染C020细胞制备rAAV5/5-EGFP，用“氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠-氯仿抽提”方法粗纯化rAAV5/5-EGFP。用100 kDa分子量截流超滤方法进一步纯化和浓缩，获得高纯度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE电泳分析可见3条特征性外壳蛋白带。电镜分析显示病毒颗粒以实心颗粒为主。用rAAV5/5-EGFP病毒按1×105 vg/cell感染体外培养的HEK293细胞，可见30％细胞呈现绿色荧光。本研究提出了一种高效AAV5/5载体生产系统和纯化方法，为重组AAV5载体的进一步应用提供了基础。

摘要:选择适宜的信号肽是实现外源蛋白高效分泌表达的一个重要因素。本研究利用生物信息学方法分析信号肽与外源蛋白之间的相容程度，将其定义为结构融合度，并从数学角度分析拼接信号肽与目的蛋白邻近残基之间的相互作用，提出了信号肽拼接区域与目标蛋白之间的数学模型，利用该模型进行结构融合度特征提取，以此来表征外源蛋白质的可分泌性。模拟结果显示结构融合度特征能有效区分枯草芽孢杆菌宿主的可分泌和不可分泌蛋白。研究结果有助于信号肽的选择，对目的蛋白分泌表达的优化具有一定的指导意义。