摘要:对代谢工程的发展进行了简要回顾, 分析了代谢工程发展的推动力, 重点评述了本期专栏发表的12篇代谢工程和细胞工厂方面的论文。

摘要:代谢工程从上世纪90年代初期发展至今已有20年历史, 对微生物发酵工业的发展起到了极大的推动作用。以下回顾了代谢工程发展至今的三个重要阶段, 讨论了各阶段中代谢工程在技术方面的进展及其对微生物发酵工业的促进作用。最后还讨论了代谢工程将来发展中的关键问题及解决策略。

摘要:随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。

摘要:细胞内代谢反应流量在系统理解细胞代谢特性和指导代谢工程改造等方面都起着重要的作用。由于代谢流量难以直接测量得到, 在很多情况下通过跟踪稳定同位素在代谢网络中的转移并进行相应的模型计算能有效地定量代谢流量。代谢流量比率分析法能够高度体现系统的生物化学真实性、辨别细胞代谢网络的拓扑结构, 并且能够相对简单快速地定量反应速率等, 因此受到代谢工程研究者越来越多的重视。以下着重介绍并讨论了利用代谢物同位体分布信息分析关键代谢节点合成途径的流量比率、基于流量比率的代谢流量解析、以及应用于代谢工程等的相关原理、实验测量、数据分析、使用条件等, 以期充分发挥代谢流量比率分析法的优势, 并将其拓展推广至更多细胞体系的代谢特性阐明和代谢工程改造中去。

摘要:通过随机突变和定向选择而进行的定向进化(又称分子进化或人工进化)在改造酶的催化特性和稳定性、扩展酶的底物范围等方面具有广泛的应用。近年来, 定向进化也开始应用在对结构基因的启动子区域和具有调节功能的蛋白如转录因子等进行代谢工程改造, 并成功选育了对环境胁迫因素具有较强耐受性, 以及发酵效率提高的微生物菌种。以下着重介绍近年来启动子的定向进化, 包括启动子的强度和调节功能的分子进化, 以及细胞全局转录工程等技术在微生物代谢工程中的应用, 这些定向进化技术使人们可以更精细地调节基因表达水平, 并可同时改变细胞内多个基因的转录水平, 是代谢工程研究新的有力工具。

摘要:丝状真菌作为一种重要的工业微生物, 采用各种表达调控技术对其代谢途径进行改造以便适应生产需求成为当前的研究热点之一。反义RNA技术是代谢工程中调控基因表达的一种重要手段, 且由于其操作简单避免了基因敲除技术的复杂性, 在丝状真菌体系中有着良好的应用前景。本综述中, 从反义RNA的作用机理、真菌体系的基因工程技术以及目前反义RNA技术的应用等方面, 对反义RNA技术在丝状真菌代谢工程中的应用进行了概述。

摘要:以木质纤维素为原料生产乙醇, 预处理是必需的环节, 这一过程中不可避免产生了多种对微生物有抑制作用的化合物, 这些抑制物主要有3大类: 弱酸、呋喃醛类和酚类化合物。这些化合物影响后续乙醇发酵微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生长及发酵性能, 降低了乙醇的得率和产量, 是木质纤维素原料大规模生产乙醇的一个主要障碍。以下介绍了3类抑制物的形成及作用机制, 并介绍了应对抑制物作用、提高酵母发酵能力的措施及研究进展,包括发酵前预处理原料脱毒、通过进化工程驯化菌种或通过对抑制物耐受性相关基因的代谢工程操作提高酿酒酵母耐受性, 及通过发酵过程控制减少抑制物影响等。

摘要:利用发酵性能优良的自絮凝酵母Saccharomyces cerevisiae flo, 研究开发了重复批次高浓度乙醇发酵系统, 以节省下游加工过程的能耗。在终点乙醇浓度达到120 g/L左右的条件下, 发酵系统的乙醇生产强度达到8.2 g/(L·h)。然而实验中发现, 随着发酵批次的增多, 自絮凝酵母沉降性能逐渐下降, 从发酵液中沉降分离所需时间相应延长, 导致发酵液中高浓度乙醇对酵母的毒害作用加剧, 影响其发酵活性和发酵系统运行的稳定性，发酵装置运行11个批次后无法继续运行。实验结果表明，絮凝能力下降导致的酵母絮凝颗粒尺度减小是其沉降性能下降的主要原因。进一步研究发现, 酵母的絮凝能力通过再培养可以恢复。在此基础上对发酵系统操作进行改进, 每批发酵结束后可控采出一定比例菌体, 调节系统的酵母细胞密度和乙醇生产强度以刺激酵母增殖, 保持其絮凝能力。在达到相同发酵终点乙醇浓度条件下, 虽然发酵系统的乙醇生产强度降低到4.0 g/(L·h)，但运行10 d后絮凝颗粒酵母尺度趋于稳定，继续运行14 d, 未发现絮凝颗粒酵母尺度继续下降的现象，系统可以稳定运行。

摘要:大肠杆菌DC1515是敲除葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)、乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflA)基因的菌株, 具有发酵生产丁二酸的潜力。为进一步提高菌株DC1515的丁二酸生产能力, 将枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶(pyc)基因转入其中。用乳糖代替IPTG诱导pyc表达, 确定了最佳乳糖加入时间、乳糖浓度及诱导温度。在此基础上, 考察了补加乳糖对丁二酸产量的影响。结果表明: 由于ptsG基因缺失, 当培养基中葡萄糖浓度达到15 g/L时, 乳糖诱导作用并不受葡萄糖抑制。优化诱导条件后, pyc过表达菌株的丁二酸产量达15.17 g/L, 为对照菌株的1.78倍。间歇补加乳糖2次至浓度为1 g/L, 丁二酸产量可进一步增至17.54 g/L。研究结果为以葡萄糖为底物生产丁二酸的过程中乳糖诱导外源基因在大肠杆菌中的表达奠定了基础。乳糖诱导降低了成本, 有利于实现丁二酸发酵生产的工业化。

摘要:为了利用大肠杆菌构建模式“细胞工厂”, 必须了解在构建过程中各种因素的影响。本研究选用敲除了lpdA基因的大肠杆菌作为模型细胞, 考察了该突变菌在合成培养基中利用葡萄糖、果糖、木糖和甘露糖累积丙酮酸的能力。结果显示, 在初始糖浓度为10 g/L的情况下, lpdA突变菌可以很好地利用葡萄糖、果糖、木糖和甘露糖转化丙酮酸, 其得率分别达到了0.884 g/g、0.802 g/g、0.817 g/g和0.808 g/g, 且在以葡萄糖、果糖和木糖发酵时, 丙酮酸的积累过程与细胞生长偶联。甘露糖发酵的情况则不同：菌浓度很快达到平台期, 随后丙酮酸积累和甘露糖消耗都表现为线性变化。当在考察了不同的接种量对lpdA突变菌发酵葡萄糖的影响时发现, 大接种量能加快葡萄糖消耗速率、丙酮酸的积累速率和细胞生长速率, 但丙酮酸得率却明显下降。这些结果对构建以大肠杆菌为母体的模式“细胞工厂”有参考价值。

摘要:代谢通量分析是研究微藻光自养培养过程中CO2和光能利用的一个非常有用的工具。本研究建立了聚球藻7942光自养培养代谢网络, 并通过代谢通量方法分析了不同入射光强下的碳代谢流分布和能量代谢。研究结果表明, CO2固定是代谢能量和还原力消耗的主要途径, 分别约占总消耗能量的85%和70%。研究还发现在一定光强范围, 基于ATP生成的细胞得率和最大细胞得率基本维持不变, 分别约为2.80 g/mol ATP和2.95 g/mol ATP, 但基于总吸收光能的细胞得率和对应的光能转换效率则随着光强的增加而降低。

摘要:红球菌属在生物降解、生物修复、生物转化和生物表面活性剂等领域得到了日益广泛的应用。本研究以红球菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18.1为载体, 以腈水合酶为模式酶, 研究了大肠杆菌tac、lacZ启动子和红球菌酰胺酶启动子(ami-1/ami-2)在红球菌中的启动效率。结果表明, 启动子Ptac、Pami-1(7 bp SD-ATG间隔)、Pami-2(13 bp SD-ATG间隔)和PlacZ在紫红红球菌ATCC 33278中启动表达腈水合酶的比酶活分别是野生菌株的7.5、6.3、5.3和1.8倍, 表明这些启动子都可以被红球菌的RNA聚合酶所成功识别。采用PlacZ启动子在红球菌宿主中启动b-半乳糖苷酶报告基因(lacZ), 结果表明, lacZ能够在红球菌中高效表达, 是优选的红球菌报告基因。

摘要:研究发现门多萨假单胞菌NK-01在菌体内积累中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAMCL)的同时也能够合成褐藻寡糖分泌到发酵液中, 其产量与培养基的碳氮比有关, 高碳氮比有利于褐藻寡糖的合成。本研究利用紫外-可见分光光度法、傅立叶红外光谱分析、1H和13C核磁共振对褐藻寡糖的结构进行了分析鉴定, 发现褐藻寡糖的结构是由b-D-甘露糖醛酸、a-L-古洛糖醛酸通过b-(1→4)/ a-(1→4)键连接而成的无支化线性多糖, 并且在单体的2位或3位羟基上部分乙酰化。凝胶渗透色谱(GPC)对分子量的测定结果为2054。

摘要:为建立重组鲨肝刺激物类似物(r-sHSA)的高密度发酵方法, 本研究在利用单因素实验和均匀设计实验优化摇瓶发酵培养基的组成和浓度以及诱导剂(IPTG)浓度的基础上, 利用5 L发酵罐进行了放大试验, 探讨了补料方式、补料培养基的组成和浓度、诱导剂加入时间和诱导后菌体的收获时间对工程菌生物量和r-sHSA产量的影响。结果表明: 在改良LB培养基(0.97% 甘油, 0.91% 酵母粉, 0.72%胰蛋白胨, 0.782% KH2PO4, 0.267% K2HPO4·3H2O, 0.062% MgSO4·7H2O, 0.5% NaCl, pH 7.0)中, 当pH控制在7.0、溶氧浓度为25%~30%的前提下, 采用指数补料方式加入优化后的补料培养基(620 g/L 甘油, 94.8 g/L胰蛋白胨, 3.3 mL/L 微量元素, 7.5 g/L MgSO4·7H2O)进行培养, 在工程菌的OD600达到23时, 加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导6 h后收获菌体, 菌体的生物量可达(123.27±1.184) g/L, r-sHSA产量为(2.662±0.041) g/L, 比优化前提高了13.7倍。

摘要:酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、无污染物排放、产物易分离回收等优点, 越来越得到关注。全细胞催化剂, 无需酶的提取和纯化, 减少了酶活损失, 有望大幅降低生产成本; Rhizopus oryzae IFO4697全细胞可以有效催化植物油脂合成生物柴油, 进一步提高全细胞在催化植物油脂甲醇解制备生物柴油过程中的稳定性, 对于工业放大具有重要意义。本实验对固定化全细胞Rhizopus oryzae IFO4697催化植物油脂合成生物柴油的稳定性进行了系统地研究, 结果表明: 反应体系水含量对于全细胞催化剂的反应活性和催化稳定性有重要影响, 5%~15%含水量适宜; 研究范围内, 载体粒度及干燥方式对稳定性影响不显著; 经过戊二醛交联后, 全细胞催化油脂甲醇解反应的稳定性显著提高, 1200 h反应后, 仍然可以保持75%的生物柴油得率; 真空抽滤直接回用的方式有利于稳定性的保持。在优化条件下, 回用20个批次, 生物柴油得率可维持在80%。

摘要:嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125菌株的基因组中, 一个编码木糖苷酶的基因(BH1068)被克隆并在大肠杆菌中获得高效表达。通过全面分析纯化蛋白, 确证了它的木糖苷酶功能。该酶在pH 4~9的范围内保持稳定, 最适pH值为中性, 有较宽的最适温度(35°C~45°C), 且能在45°C范围内保持稳定。这些特性使得该酶可在较为宽广的条件下对木聚糖进行酶促降解。该酶对人工合成底物对硝基苯-b-木糖苷(p-nitrophenyl-b-xylose, pNPX)的比活力为174 mU/mg蛋白质, 且木糖对其反馈抑制较弱(抑制常数Ki为300 mmol/L)。结果显示该酶是活性较高且较耐木糖抑制的细菌源木糖苷酶。该酶与商品化的木聚糖酶一起水解山毛举木聚糖(Beechwood xylan)时显示了增效作用, 且水解率可获40%。该酶最适pH为中性, 对木糖耐受等特性与大多数来源于真菌、最适pH为酸性、对木糖敏感的木糖苷酶将有较好的互补。结果表明该酶在木聚糖或含木聚糖多糖的单糖化过程可能发挥重要作用。

摘要:利用反向遗传学的方法对水稻OsCIPK10基因的功能进行了分析。结果表明, 过量表达OsCIPK10基因的转基因水稻与野生型水稻在株型、抗高盐和耐低钾能力方面没有明显差异, 但是小RNA干扰表达OsCIPK10基因的转基因水稻表现出显著的抗盐性。在缺钾胁迫条件下OsCIPK10基因的表达升高, 推测该基因在应答高盐和低钾的非生物胁迫过程中起作用。OsCIPK10基因启动子与报告基因GUS融合表达的转基因水稻的染色结果显示: OsCIPK10基因呈组成型表达, 但是在维管组织表达水平更高。

摘要:FtsH (Filamentation temperature-sensitive H)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的ATP依赖型金属蛋白酶。同源性分析表明, 在拟南芥和水稻基因组中分别有12个和9个ftsH基因。ftsH基因在染色体上的分布有明显的偏爱性, 如拟南芥的1、2、5号染色体和水稻的1、5号染色体。亚细胞定位分析表明, 所有FtsH蛋白均定位于叶绿体或线粒体中。系统进化分析表明, 21个FtsH蛋白成员可分为8个类群, 其中AtFtsH12在水稻中没有发现种间同源物。每个类群成员的蛋白序列高度保守, 种内同源物显示出大于80%的相似性, 而种间同源物的相似性也大于70%。类群内的同源基因并非平行进化产生的, 拟南芥基因组中进化出AtftsH1/5、AtftsH2/8、AtftsH3/10和AtftsH7/9共4个同源基因对, 而水稻基因组中只有OsftsH3/8和OsftsH4/5 两个同源基因对。每一类群中的成员在基因外显子-内含子边界分布上表现出高度保守性, 在蛋白功能结构域的可变残基上具有偏爱性, 而内含子在碱基组成和序列长度上表现出广泛的变异。拟南芥和水稻ftsH基因家族的比较分析为其他物种ftsH基因的特性和功能研究奠定了基础。

摘要:本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6), 优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系, 将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白, 经尿素梯度透析复性溶解, 免疫新西兰大白兔, 成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性, 并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明, 成功构建的拟南芥WUS原核表达载体, 在E. coli中以0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10 h后, 融合蛋白得到高水平表达, 亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上, 所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性, 可用来检测纳克级蛋白抗原。

摘要:用3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定提取自条斑紫菜的R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)经激光介导对人肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率, 并检测细胞凋亡率。结果显示在120 mg/L浓度下, R-PE在氩离子激光器100 J/cm2辐照下对应的细胞存活率为27%, C-PC在He-Ne激光器35 J/cm2辐照下对应的细胞存活率为47%; 单用2种激光器辐照对应的细胞存活率分别为65%和70%; 单用2种蛋白处理细胞在72 h后出现对细胞生长的显著抑制, 最大抑制率分别为31%(R-PE, 120 mg/L)和27%(C-PC, 250 mg/L)。120 mg/L的2种藻胆蛋白在对应激光辐照下, 于照后8 h 达到细胞凋亡率最大值, 分别为31.54%(R-PE)和32.54%(C-PC)。本实验证明条斑紫菜R-PE和C-PC具有可开发成为光敏剂的应用前景。

摘要:本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法 & Hoechst 33342 染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标, 对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较, 最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序, 即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作, 将供核体细胞注射到卵周隙, 然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9 kV/cm, 脉冲时程10 ms, 方波2次间隔2 s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验, 自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内, 最后2头母牛产下2头克隆牛犊, 结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。