摘要:酶工程是酶学与工程科学融合的综合性科学技术, 是现代生物技术的支柱之一。近年来我国在酶工程研究方面取得了较大进步, 为促进国内酶工程研究的发展, 本期“酶工程专刊”集中展现了我国酶工程专家学者在酶促生物转化、医药用酶、饲料用酶、环境修复用酶和生物能源用酶等领域所取得的最新进展。

摘要:酶是细胞新陈代谢的基础, 酶的检测在生物技术、疾病诊断及药物开发等领域都具有十分重要的意义。在检测酶的诸多方法中, 荧光法因其灵敏度高、检测限低等优势发展迅速。以下简述了近年来荧光法在酶检测领域的研究, 根据检测方法的不同分为直接荧光检测法和间接荧光检测法, 其中直接检测法又根据不同的底物标记及检测机理进行分类。以下介绍了各种方法的应用, 并展望了此类方法的前景和发展趋势, 为酶工程及生命科学其他领域的相关研究提供信息。

摘要:野生型生物催化剂对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性, 但生物催化剂在有机合成中应用时多数情况下是非天然底物, 这就要求对野生型生物催化剂进行改造, 以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性(包括区域选择性和立体选择性)。以下根据酶催化剂的类型总结了近几年来通过基因工程改变生物催化剂的立体选择性的最新进展, 盼望起到抛砖引玉的作用, 以此促进我国在这一领域的快速发展。

摘要:近年来工业生物技术飞速发展, 酶学和生物催化领域也取得突破性进展, 特别在酶在非水相中活性及稳定性研究, 耐溶剂生物催化剂的筛选、构建、修饰和改造, 生物相容性和环境相容性好的绿色介质等方面取得了较大的进展。最近的研究热点和未来几年的研究方向主要为: 基于基因组信息的耐溶剂酶的虚拟筛选和构建; 基于自然界筛选新酶基因的耐溶剂酶重构和改造; 离子液体等环境友好的绿色介质系统等几个方面。

摘要:酵母展示技术是将外源蛋白与酵母细胞壁蛋白融合, 并将外源蛋白表达在酵母细胞表面。酵母展示技术已广泛应用于各种功能蛋白的表达及筛选。以下重点介绍酵母展示技术在脂肪酶展示体系构建及其在脂肪酸甲酯、短链芳香酯及糖酯生物合成中的应用。

摘要:非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常可增加底物溶解度, 减少水相中的副反应, 加快生物催化的速率和效率, 在药物及药物中间体和食品等方面具有较大的应用价值。以下探讨了非水相体系对酶活力及酶促反应速率的影响因素, 并阐述酶的化学修饰、固定化及定点突变对酶活力的影响, 进一步分析无溶剂系统、反胶束、超临界流体及离子液体的不同溶剂体系对酶反应速率及催化效率的影响。此外, 还列举一些非水相酶催化反应的应用 实例。

摘要:腈化合物是一类重要的用于合成多种精细化学品的化合物, 它们容易制备, 并且可以合成多种化合物。传统化学水解方法将腈化合物转化为相应的羧酸或酰胺通常需要高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件, 腈转化酶(腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶)由于其生物催化过程具有高效、高选择性、条件温和等特点, 在精细化学品的合成中越来越受到人们的关注。许多腈转化酶已经被开发出来并用于精细化学品的生产。以下介绍了腈转化酶在医药及中间体、农药及中间体、食品与饲料添加剂等精细化学品生产中的应用。随着研究的不断深入, 将会有更多的腈转化酶被开发出来并用于精细化学品的生产。

摘要:工业酶制剂对化工和生物化工产品生产的影响有两方面, 一是直接催化生产, 另一方面是辅助发酵菌进行生产。以下简单回顾了酶制剂在工业领域的应用现状, 注重讨论酶制剂在淀粉糖等方面的直接催化应用和在酒精发酵生产等方面的辅助作用, 分析新型酶制剂对生产过程的影响及带来的益处, 促进行业的可持续发展。

摘要:以下综述了碱性果胶酶的生物制造及其在纺织工业清洁生产中的应用研究进展。微生物发酵法是目前生产碱性果胶酶的主要方式, 枯草芽孢杆菌是碱性果胶酶工业发酵生产中效果较好的野生菌株。影响发酵法生产碱性果胶酶的主要因素有: 底物浓度及其流加方式、细胞浓度、搅拌转速、通气速率、pH、温度等。构建基因工程菌为碱性果胶酶的发酵生产开辟了一条有效途径, 其中重组毕赤酵母的产酶水平最高, 在10吨发酵罐上酶活达1305 U/mL。碱性果胶酶可用于棉织物前处理的精练工艺, 与传统高温碱煮相比, 具有保护纤维、提高精练效率、降低能耗和污染的优势。通过分子定向进化技术对碱性果胶酶进行分子改造, 使其催化特性更加适合于纺织精练工艺, 进而实现纺织工业的清洁生产是未来的研究重点和热点。

摘要:角质酶(EC 3.1.1.74)是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶。角质酶是一种多功能酶, 可水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和各种聚酯, 同时还能催化酸与醇的酯化、脂肪酸盐与醇的转酯化反应, 因此在食品工业、化工工业等诸多领域都具有广泛的应用。近年来研究发现, 角质酶可实现棉纤维的生物精练和合成纤维的生物改性, 是推动纺织工业清洁生产的关键酶制剂。

摘要:自然界降解纤维素的微生物及其降解策略呈现多样性的特点。除了获得纯培养的纤维素降解微生物外, 自然环境中还有大量不可培养的微生物, 这些微生物蕴藏着丰富的纤维素酶和基因资源。环境基因组学和蛋白组学的出现为挖掘这些未知资源提供了必要的技术手段, 并且已经取得了一定的成果。以下综述了相关的研究进展, 并从群落系统微生物学角度, 对天然生境中纤维素的降解机制的研究进行了展望。

摘要:饲料用酶目前已成为世界工业酶产业中增长速度最快、势头最强劲的一部分。畜牧业开发应用饲料用酶制剂有着重大意义: 可缓解饲料资源短缺、人畜争粮的局面, 有利于保障粮食安全; 提供更为安全、优质的动物产品, 有利于保障食品安全; 减轻环境污染, 保障养殖业的可持续发展。饲料用酶的应用效果已在世界范围内得到公认, 但酶的使用量还较低, 其主要原因在于饲料用酶的性质难以满足饲料工业的要求, 以及饲料用酶表达量低, 生产成本较高。因此, 目前的研发趋势主要体现在: 1) 饲料用酶基因资源的高通量筛选技术, 尤其是特殊环境微生物和未培养微生物中的基因资源; 2) 酶蛋白的分子改良技术, 利用蛋白质工程技术定向改良, 创造具有优良特性的酶蛋白质分子, 进一步提高饲料用酶的应用性能; 3) 饲料用酶高效表达和生产技术; 4) 饲料用酶的应用效果快速评估技术和配套应用技术体系。

摘要:随着生物技术和现代药剂学研究的进展, 酶类药物的应用取得了快速发展, 已成为生物药物的一个重要门类。以下对治疗用酶的新品种、作用机理和新技术在治疗酶中的应用、酶作为药物靶点的应用等进行了回顾, 并对未来治疗酶的发展方向进行了讨论。

摘要:配糖体是中草药主要有效成分之一。但是中草药成分并不是活性最佳结构, 中草药口服后其成分在消化系统酶和微生物的作用下, 转化为另一种结构吸收、起药效; 但是体内的这种转化甚微, 往往受到人的个体条件的影响。如果这种体内的转化反应在体外实现, 中草药成分酶转化为高活性成分, 将对创新药、中医药、公众营养食品和保健食品、功能化妆品等意义很大。为此, 以下主要介绍本实验室研究过的中草药配糖体苷酶新微生物筛选、分类鉴定, 特异的中草药配糖体苷酶的发酵产酶和其酶学特性。

摘要:随着人类社会的快速发展, 工业化水平不断提高, 产生大量的污染物并排放到环境中, 给人类的生活和身体健康造成了严重的影响。这些污染物中包含种类繁多的难降解有机物, 如多芳香烃(PAHs)、环硝胺类物质(RDX、HMX和CL-20)、多氯联苯(PCBs)及烷烃类化合物等, 对自然界的污染危害大。微生物可以消除它们对污染的影响, 研究结果表明微生物的代谢或共代谢活动是降解这些物质的有效途径, 降解起始阶段需要一些关键酶的参与活动, 以氧化还原酶为主。这些氧化还原酶一般与细胞膜上其他的活性组分在一起, 形成一个氧化还原系统氧化底物。被氧化的中间物质再通过一系列酶催化继续氧化成三羧酸中间代谢产物被微生物所利用。以下综述了与这些物质降解相关的代谢途径和关键的酶, 展望今后在开展这类研究工作时要加强降解微生物的筛选和相关酶学的研究, 进一步研究这些污染物的代谢或共代谢途径和机理, 为工程化治理环境污染提供依据。

摘要:海绵是生物进化过程中最古老的多细胞动物, 其中大部分能够利用二氧化硅在室温水环境下合成形状、大小和结构极为丰富的硅质骨骼。随着近年来人们发现其骨骼的基本组成单位骨针具有优异的光导性能和机械性能, 海绵生物硅化过程及仿生纳米和微米硅质生物材料合成的研究成为生物技术和材料科学的热点。在海绵生物硅化过程中, 一类被称为硅蛋白(Silicatein)的蛋白质表现出了特殊的催化活性, 也因此得到了生物学家、化学家和材料学家的关注。以下将对硅蛋白的国际研究现状进行了评述, 以期促进国内相关领域的研究。

摘要:以下简述了过氧化氢(H2O2)作为一种信号分子诱导并调节酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞膜的变化。h2o2是一种强氧化剂, 可以跨膜扩散进入细胞中, 形成跨膜梯度; 当外源H2O2达到亚致死剂量时, 酿酒酵母的细胞膜透性和流动性降低, 产生跨膜梯度, 从而限制H2O2向细胞内的扩散速率, 保护细胞免受氧化胁迫的伤害。研究表明, 由H2O2引起的膜透性和流动性的变化与膜的组成有关: 当酵母细胞对H2O2产生适应时, 与膜组成和微区域变化有关的几个基因的表达发生了改变。膜组成的变化和微区域的调整还可能与H2O2依赖的信号途径有关, 即以H2O2为信号分子, 调节膜的变化并赋予细胞对氧化压力更高的适应性, 但这种信号分子的具体传递途径及机制还需要进一步研究。

摘要:运用定向进化-易错PCR的方法, 提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选, 从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28, 脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明, 突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变: A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示, 突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上, 靠近脂肪酶底物结合区域, 与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引, 使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明, 突变株2-28脂肪酶的Km值比发菌株下降了10%, Kcat值提高为原来的2.75倍。

摘要:本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因, PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接, 在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae, 构建了库容为104的初级突变体库, 筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30 min后最大酶活力为25 U/mL, 较之野生型最适条件酶活力提高了4.3 倍。序列分析表明, 突变体有3 个碱基发生了突变: T343A/ C827T/ T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala, 利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示, 这3 个突变氨基酸分别位于第4 个β折叠的第6 个氨基酸、第6 个α螺旋的第1 个氨基酸、第10 个α螺旋和第11 个β折叠之间的转角。

摘要:为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率, 对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1~+78区进行二级结构的优化, 并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少, 自由能显著下降(由原始的-9.5 kcal/mol降至-5.0 kcal/mol), 使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4~5倍和61.9%。在高底物2-羟基苯乙酮浓度(5.0 g/L)下, 优化突变株不对称转化效率较高, 产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1% e.e.和81.8%, 比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明: 优化mRNA翻译起始区的二级结构, 克服蛋白翻译启动的空间位阻, 不仅能促进翻译的顺利进行, 使目标蛋白得到高效表达, 而且有利于蛋白空间结构的正确折叠, 有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。

摘要:通过功能筛选方法, 从中国南海海洋表层海水微生物元基因组文库筛选得到了6个β-葡萄糖苷酶阳性克隆。对其中的一个阳性克隆pSB47B2进一步亚克隆和序列分析, 获得一新型β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1B)开放阅读框。以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌, bgl1B被高效活性重组表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了重组Bgl1B (rBgl1B)。纯化的rBgl1B催化pNPG水解反应的最适pH为6.5, 最适温度为40oC。在最适反应条件下, rBgl1B水解pNPG的活性达到39.7 U/mg, Km和Vmax 分别为0.288 mmol/L、36.9 μmol/min。纤维二糖是rBgl1B的有效作用底物, 其Km和Vmax 分别为0.173 mmol/L、35 μmol/min。但rBgl1B不能催化转化蔗糖、乳糖、麦芽糖以及CMC。rBgl1B催化pNPG的水解反应对高浓度的Na+有较好的耐受性, 而低浓度的Ca2+、Mn2+对该酶活有一定促进作用。不同于许多来源于真菌的酸性β-葡萄糖苷酶, rBgl1B在pH 7.0到9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性。

摘要:本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株, 并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC 3.316为出发菌株, 通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株, 研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变, 选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性, 酶活力平均达到23 IU/mL, 与出发菌株CGMCC 3.316相比提高39%。此外, 该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性, 并与3-3M和出发菌株进行比较, 结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。

摘要:展示酶的酵母细胞作为全细胞催化剂, 既具有固定化酶的优点, 又有制备简单、成本较低的特点。本研究将细胞表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B, CALB)的重组毕赤酵母用于非水相中催化合成短链芳香酯, 通过滴定和气相色谱的方法测定底物酸的转化率, 从底物的碳链长度、醇的结构、酵母冻干粉的添加量、底物浓度及底物的酸醇摩尔比等方面考察了展示CALB的毕赤酵母全细胞催化合成短链芳香酯的特性。研究结果表明: 该全细胞催化剂可催化C10以下的酸和醇直接酯化合成多种短链芳香酯, 酸的转化率达到90%以上; 其中己酸和乙醇为酶的最适底物; 酵母冻干粉的添加量20 g/L(306.0 U/g-dry cell)、己酸浓度0.8 mol/L、酸醇摩尔比1:1.1是合成己酸乙酯的最佳条件。在此条件下反应1.5 h, 己酸的转化率达到97.3%。在现有的关于脂肪酶非水相催化合成短链芳香酯的报道中, 该全细胞催化剂显示出较好的底物耐受性以及较高的催化反应速率。因此, 展示CALB的毕赤酵母全细胞催化剂在合成短链芳香酯方面具有较大的商业化应用潜能。

摘要:利用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B, CALB)的毕赤酵母细胞为全细胞催化剂, 以葡萄糖为酰基受体, 月桂酸为酰基供体, 在非水相体系中催化合成糖酯。用硅胶柱层析对产物进行初提, 再用制备液相色谱进一步分离纯化, 并用高效液相色谱-质谱鉴定纯品性质。对该酶法合成糖脂反应体系进行了优化, 其中考察了有机溶剂种类、复合溶剂体系中二甲基亚砜(DMSO)体积百分比、酶量、底物摩尔比、水活度和温度等几个影响酯化反应的因素。结果表明: 在5 mL反应体系中, 以叔戊醇/二甲基亚砜(DMSO30%, V/V)为反应介质, 添加初始水活度为0.11的全细胞催化剂0.5 g, 葡萄糖0.5 mmol/L, 月桂酸1.0 mmol/L, 60°C下反应72 h后, 葡萄糖月桂酸单酯的转化率达到48.7%。

摘要:肌肽(β-Ala-L-His)是一种高效抗氧化剂, 广泛应用于生物、化工、医药等领域。应用微水相酶促合成类肌肽, 效率高价格低, 且具有相似性质, 开发前景广阔。本研究以L-丙氨酸和4,5-二羧酸咪唑制备类肌肽4(5)-丙氨酰胺-5(4)-羧酸咪唑, 正交实验下的最佳合成条件为: 四氢呋喃:pH 8磷酸缓冲溶液＝10:1.6 (V/V), L-丙氨酸:4,5-二羧酸咪唑=1:3 (m/m), α-胰凝乳蛋白酶:底物=1:200(m/m), 35oC下磁力搅拌1.5 h。硅胶G60薄层色谱(TLC)分离反应产物, Rf=0.81处出现新斑点; 刮下该点纯化后进行紫外扫描, 高效液相色谱(HPLC)和核磁共振, 紫外光谱253 nm处吸收明显增强, 310 nm处出现新吸收峰; 253 nm、310 nm、330 nm高效液相色谱保留时间均为4.5 min; 13C核磁共振显示8组碳原子。结合胰凝乳蛋白酶的催化机理, 得出产物结构为4(5)-丙氨酰胺-5(4)-羧酸咪唑。

摘要:通过PCR扩增软化芽孢杆菌a-CGT酶基因, 将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中, 分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明, 重组毕赤酵母发酵上清液中a-CGT酶活性仅0.2 U/mL, 重组枯草杆菌产酶达到1.9 U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化, 当以TB为出发培养基, 初始pH 6.5, 温度为37oC时, 摇瓶培养24 h后a-CGT酶环化活性达到4.5 U/mL (水解活性为3200 IU/mL), 是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。

摘要:为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(PGL)的产量和生产强度, 在诱导期采用多种碳源与甲醇混合添加的模式。实验结果发现: 甘油、山梨醇、乳酸与甲醇的混合添加均可以提高PGL的产量, 其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著。研究表明, 通过双碳源混合流加可以提高细胞活力, 增强醇氧化酶活力, 提高毕赤酵母表达外源蛋白效率。当山梨醇的流速为3.6 g/(h·L)时, PGL酶活可达1593 U/mL, 生产强度为16.7 U/(mL·h), 比对照分别提高了84.6%和45.2%, 实现了碱性果胶酶的高效生产。

摘要:利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A, 将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上, 构建重组表达质粒pPIC9K-pelA, 电击转化毕赤酵母 GS115, 得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导, 将发酵上清液浓缩后, 用盐酸法测定其酶活可以达到2.3 U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定, 发现重组毕赤酵母分泌了1个约38 kD的蛋白, 与该酶基因产物的理论值相符, 并通过水解圈法测定验证, 均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.

摘要:本研究利用酶在微水溶剂中的“构象记忆”特性, 以壳聚糖微球为载体, 以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)为研究对象, 将HRP于活性构象下冻干“固定”后, 在二氧六环:水=99:1(V/V)微水介质中与载体进行共价交联, 同时与传统水介质中共价交联固定化的HRP进行比较。结果发现, 两种介质中固定化HRP的最适温度都提高到60°C, 最适pH均为6.5, 而微水相中固定的酶活力损失较低, 酶活比传统水相中固定的酶高6倍以上; 70°C保温30 min后, 微水相中固定的酶保留75.42%的活力, 而水相中固定的HRP仅存15.4%的活力; 微水相中固定的HRP具有更好的操作稳定性和热稳定性, 60°C下连续操作5次之后, 微水相固定的HRP保留77.69%的酶活, 而水相固定的HRP仅存16.67%的酶活; 微水相中固定的HRP在苯酚的去除中表现得更具优势; 微水相中共价交联制备的CS-HRP-SWCNTs/Au酶修饰电极对H2O2的响应信号比水相中共价固定的酶电极强2.5倍, 灵敏度更高。本研究表明利用酶的“构象记忆”在微水介质中进行共价交联是固定化酶的一种可行方法, 所制备的固定化酶具有更优良的性质。

摘要:采用化学共沉淀法合成10 nm的Fe3O4磁性纳米粒子(MNPs)。以辣根过氧化物酶(HRP)为对照, 研究了四氢呋喃、1,4-二氧六环、丙酮、N,N-二甲基酰胺、甲醇和二甲亚砜等6种水溶性有机溶剂对Fe3O4 MNPs过氧化物酶样活性的影响。结果表明, 在有机溶剂浓度(V/V)为30%~75%时, Fe3O4 MNPs相对酶活力迅速下降至近于完全失活。在15%有机溶液中, Fe3O4 MNPs的最适反应温度多为50oC, 最适反应pH在3.6左右。经15%有机溶液处理后的水相反应酶活显示, Fe3O4 MNPs表现出对有机溶剂较强的热稳定性和pH稳定性, 且对75%有机溶液也具有良好的稳定性。以上多数性质均优于相同条件下的HRP组, 表明Fe3O4 MNPs 是一种比HRP对水溶性有机溶剂更稳定的过氧化物酶。由于Fe3O4 MNPs具有易制备、成本低、易于磁分离和可循环使用的特点, 因此其具有替代HRP用于有机催化的应用潜力。

摘要:迅速升温的生物柴油投资热导致了其副产物甘油的大量积累, 这一现状使得开发和利用甘油生产各种精细化工产品备受关注。本实验通过构建基因工程菌来生物转化甘油生产3-羟基丙醛, 为甘油下游产品的开发开辟了一条新途径。3-羟基丙醛是一种重要的化学中间体, 同时也是一种有效地抗菌剂和生物组织的固定剂, 在化学工业中具有广泛的应用前景。实验主要利用甘油脱水酶N末端序列, 并根据NCBI中公布的甘油脱水酶的氨基酸序列设计了一对克隆引物, 并以菌株罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)的基因组DNA为模板进行PCR扩增, 获得约为1.6 kb的片段, 将其克隆到T载体上进行测序, 对测序结果进行分析, 重新设计两端含有EcoR I和Hind III酶切位点的表达引物, 利用PCR扩增得到了甘油脱水酶基因, 该基因片段长度为1674 bp, 编码558个氨基酸。将所得片段定向克隆到pET28b载体中, 转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中, 筛选阳性单克隆。经IPTG诱导后, 进行SDS-PAGE电泳, 在约65 kD处检测出一蛋白表达条带, 另外还对该重组菌进行比活力测定, 最高比活力可达1.14 U/mg, 比野生型菌株提高了86.88%。

摘要:脂肪酶是重要的工业用酶, 在食品加工、生物柴油的合成等领域具有广泛的应用。但是在应用中有机溶剂对脂肪酶具有一定的毒性, 因此获得耐有机溶剂的脂肪酶基因并实现高效表达是脂肪酶规模化应用的前提。本研究应用PCR技术首次从耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36基因组DNA中扩增得到脂肪酶Ⅲ基因lip3(GenBank Accession No. FJ979867), 其编码区长度为741 bp, 编码247个氨基酸, 推测蛋白分子量大小为31.6 kD。它与腐生葡萄球菌lip3推测的基因(GenBank Accession No. AP008934)只有83%的同源性。将该基因与大肠杆菌表达载体pET-DsbA连接, 转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-DsbA-lip3, 在pH 8、25 oC条件下, OD600为1.0时用0.4 mmol/L IPTG诱导12 h酶活达到25.8 U/mL。重组酶在甲醇、正己烷、异辛烷、正庚烷等有机溶剂中具有较好的耐性。lip3基因的克隆及在大肠杆菌中有效表达的研究为进一步进行基因工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。

摘要:研究了固定化脂肪酶Lipozyme TL IM和Novozym 435催化毛棉籽油和乙酸甲酯制备生物柴油的过程。通过向反应体系中添加甲醇, 可减少乙酸的抑制, 明显提高生物柴油得率, 确定最佳反应条件为: 正己烷作溶剂, 乙酸甲酯与油摩尔比9:1, 添加油重3%的甲醇、油重10%的Lipozyme TL IM和5%的Novozym 435复合使用, 温度55°C, 反应8 h, 生物柴油得率达到91.83%。最后探索了酶催化毛棉籽油合成生物柴油的动力学, 得到动力学方程。

摘要:以二氧化硅纳米材料为载体, 采用吸附法对脂肪酶进行固定化, 研究了不同条件对固定化脂肪酶的催化活性的影响, 得到最佳的固定化条件: 给酶量为28 300 U/g, 固定化温度为45oC, pH值为7.5, 时间为10 h, 此时固定化酶的活力约为3867 U/g载体。固定化酶的最适反应温度为45oC, 比游离酶的反应温度高5oC, 最适pH下降到5.5, 低于游离酶的反应pH(pH 7)。固定化酶的热稳定性和pH稳定性较游离酶有了很大的提高, 其在70 oC以下能保持70%以上的酶活力, 而游离酶在50 oC下残余酶活力仅为30%。在pH 5~8的范围内, 固定化酶的酶活力能保持50%以上, 而游离酶只能保持20%左右。用固定化的中性脂肪酶催化不同的油品, 即大豆油、菜籽油及泔水油生产生物柴油, 菜籽油的酯化率最高。

摘要:为了更好地利用农业废弃物, 提高其综合利用率, 减少传统化学方法及秸秆焚烧过程造成的环境污染, 实验对鸡腿菇、黑曲霉和里氏木霉3株产木质纤维素降解酶系的菌株进行混合平板产酶筛选, 结果显示鸡腿菇和里氏木霉平板培养相容性良好, 且产酶量高。在相容性实验的基础上, 对鸡腿菇和里氏木霉的最优产酶条件进行了研究。在最优条件下: 鸡腿菇和里氏木霉接种比例按5: 2, 接种时间间隔为12 h, 26oC、150 r/min下, 发酵3 d产漆酶活力达3267.2?U/mL, 比单独发酵提高106%。

摘要:3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体降解途径中的关键酶, 红平红球菌在甾体药物制备中有重要价值。以本实验室从土壤中自行筛选的分枝杆菌Mycobacterium sp. NwIB-01为出发菌株, 利用Rhodococcus erythropolis SQ1已报道的ksh序列与已全基因组测序的分枝杆菌序列数据库进行比对分析, 根据同源基因设计简并引物获得部分ksh序列, 通过染色体步移扩增出全长ksh(命名为M.S.-ksh), 该基因与耻垢分枝杆菌M. smegmatis mc2155的ksh同源性为85%。构建pET32-ksh表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 获得高表达重组转化子菌株, 经IPTG低温诱导, SDS- PAGE电泳分析, 目的蛋白主要为可溶性表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上, 用Ni2+亲和层析柱纯化, 纯度达90%以上。本研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。

摘要:通过设计正交实验, 考察了培养基中各组分及其浓度对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)/pET28-dexYG诱导产酶结果的影响。在获得最佳培养条件的基础上, 考察温度、蔗糖浓度和pH值对右旋糖酐产量的影响。结果表明: 菌浓OD600达到2.0时, 加入异丙基硫代-b-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)至0.25 mmol/L, 25°C 诱导培养4 h, 产酶活力最高, 达到110.16 U/mL, 蔗糖浓度对产量的影响比较显著。研究结果得到高效表达的培养条件, 为实现该酶的工业化应用打下了基础。

摘要:将黄曲霉毒素氧化酶(AFO)固定在壳聚糖(CS)-单壁碳纳米管(SWCNTs)杂交膜中, 组装在聚邻苯二胺(POPD)修饰的金电极(Au)表面, 制备了对杂色曲霉素(ST)敏感的生物传感器(AFO/CS-SWCNTs/POPD/Au)。运用原子力显微镜(AFM)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)和交流阻抗技术(EIS)对电极组装过程进行了表征。循环伏安法研究表明, AFO在修饰电极上发生了准可逆的氧化还原反应, 是表面控制过程, 其式量电位为-0.436 V (vs.Ag/AgCl), 说明包埋在CS-SWCNTs中的AFO和电极之间发生了直接电子传递。AFO修饰电极对ST具有明显的电催化作用, 其表观米氏常数为7.13 mmol/L, 催化电流与ST浓度在10~310 ng/mL范围内呈线性关系, 相关系数为0.997, 检出限为3 ng/mL (S/N=3), 响应时间小于10 s。组装的生物传感器具有较好的稳定性与重现性, 连续检测20 ng/mL的ST标准溶液11次, 电流值RSD为3.9%; 放置一个月后, 其电流响应值仍为初始值的85.6%。该方法具有较高的选择性和灵敏度, 应用于实际样品检测时, 其回收率在87.6%~105.5%之间。建立的ST含量的电化学测定方法简便快捷, 测定结果令人满意。

摘要:本研究选择7种吸附和离子交换树脂进行了假丝酵母脂肪酶(Candida sp. lipase)的固定化试验, 通过测定固定化后各脂肪酶的酶活, 筛选出固定化效果较好的弱碱性阴离子交换树脂D301; 并通过扫描电镜将D301与脂肪酶Novozym 435的表面形貌做比较, 进一步选定D301树脂作为载体, 并对其采用戊二醛交联固定化, 研究并优化了其固定化条件。结果表明, 5%戊二醛溶液的加入量为8 mL, 处理时间为5 h, 酶液浓度为1.0 g/L, 磷酸缓冲盐溶液pH 6.0, 固定化处理10 h效果最好, 获得的固定化酶活力可达35 U/mg, 酶的固定化效率约为3.5 U/(mg·h)。