摘要:甲烷氧化菌是以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的微生物, 其关键酶之一是甲烷单加氧酶(MMOs), 可以在氧气的作用下催化甲烷等低碳烷烃或烯烃羟基化或环氧化, 甲烷氧化菌在自然界碳循环和工业生物技术中具有重要的应用价值。因此, 近20年来对于甲烷氧化菌和MMOs的研究一直倍受生物学家的关注。以下从现代生物技术的角度, 对近年来国内外在甲烷氧化菌的分类与分布, MMOs的结构与功能、甲烷氧化菌与MMOs的基因工程等方面取得的研究成果进行了总结, 全面综述了甲烷氧化菌及MMOs的应用基础研究现状, 并对其今后的研究和应用方向提出了展望。

摘要:采用5￠端引入His-tag的引物从携带有Arresten基因的质粒pCA中扩增血管生成抑制因子Arresten编码基因,构建其植物表达载体pCAMBIAarr并通过冻融法转化根癌农杆菌LBA4404, 获得携带目的基因的重组农杆菌。采用叶盘法以重组农杆菌转化烟草, 在50 mg/mL潮霉素B为选择压力下获得再生烟草植株, 经过Southern 杂交、RT-PCR和Western blotting检测, 获得稳定整合有Arresten编码基因的烟草转基因植株。牛血管内皮细胞BCE增殖抑制实验表明, 采用镍离子螯合次氨基三乙酸亲和层析法从转基因烟草叶片中分离纯化的重组Arresten蛋白具有明显的抑制牛血管内皮细胞增殖的生物活性。

摘要:利用转基因技术是改良大麦品种品质的有效途径。研究了转trxS基因对大麦种子发芽过程中水解酶活性的影响, 结果表明转基因种子中a-淀粉酶、自由态b-淀粉酶和极限糊精酶的活性比未转基因种子高; 转基因种子醇溶蛋白和谷蛋白中巯基的含量提高, 说明该基因能够表达, 为大麦育种和品质改良提供新的途径。

摘要:植物中, UDP-L-鼠李糖是细胞壁骨架的主要成分, 由鼠李糖合成酶催化底物UDP-a-D-葡萄糖合成。本实验从拟南芥基因组中分离了鼠李糖合成酶基因AtRHM1 1058 bp的启动子序列并对启动子5￠端进行了不同长度的缺失。将全长启动子及不同缺失启动子与GUS报告基因进行融合后转化野生型拟南芥, 获得了一系列转基因植株。启动子缺失分析结果表明, AtRHM1基因在转录水平上受葡萄糖的诱导, 参与葡萄糖应答反应的顺式调控元件位于启动子的-931 bp~ -752 bp区域。

摘要:为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座, 我们采用了连续三步‘Gap-repair’的方法。首先, 以pBR322载体作为骨架, 插入预先无痕连接在一起的6个同源臂, 构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术, 第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAP BAC)上亚克隆了 8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上; 第二步, 从hLF BAC上亚克隆29 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列; 第三步, 从mWAP BAC上亚克隆12 kb的mWAP基因5￠端完整侧翼序列, 并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起, 形成一个全长约49 kb的mWAP-hLF杂合基因座。经过 PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证, 我们构建的这个杂合基因座, 达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的。这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术, 将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。

摘要:VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分裂原, 通过与内皮细胞表面特定受体结合, 从而导致新生血管的形成, 其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用, 因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)。采用RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA, 获得KDR-CD的编码基因, 将其克隆至pET-30a载体, 在E. coli BL21(DE3)中进行了成功表达, 采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化, Western blotting结果显示表达的KDR-CD蛋白自身磷酸化, 重组KDR-CD蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。

摘要:磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglycerate mutas)是糖酵解过程中的一种重要酶, 主要催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。利用PCR技术从日本血吸虫19 d童虫中首次扩增到一个PGAM家族基因, 序列分析表明该基因的完整编码框含753 bp, 编码250个氨基酸, 理论分子量28.26 kD, 理论等电点7.01。同源性分析结果表明, 该基因的氨基酸序列具有典型PGAM家族特征, 推测为血吸虫的PGAM基因, 命名为SjPGAM(GenBank Accession No. EU374631)。实时定量PCR分析显示该基因在14 d和19 d童虫中的表达量明显高于其他发育阶段, 42 d雄虫中的表达量高于雌虫。构建了该基因的原核重组表达质粒pET-28a(+)-PGAM, 在大肠杆菌系统中成功获得了表达, 重组蛋白以包涵体形式存在, Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。SjPGAM基因及其表达产物的获得, 为探索PGAM基因家族在血吸虫能量代谢过程中碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育提供了重要基础。

摘要:w型干扰素(IFN-w)与a型干扰素(IFN-a)同属于Ⅰ型干扰素, 都具有抗病毒, 抗增殖和免疫调节的功能, 但它们之间的活性却存在较大差异。通过PCR扩增猫w型干扰素基因(feIFN-w), 根据GenBank公布的猫a型干扰素基因序列,合成猫a型干扰素基因(feIFN-a)。分别构建原核表达载体pET-His/feIFN-a和pET-His/feIFN-w, 转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达。表达产物经Ni-NTA 亲和层析纯化, 复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定。结果显示, 重组猫w型干扰素(feIFN-w)抗病毒活性明显高于重组猫a型干扰素(feIFN-a), 尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV), feIFN-w的活性是feIFN-a的160倍, 对犬瘟热病毒(CDV), feIFN-w的活性是feIFN-a的4倍, 而日本同类产品Intercat?对CDV和AIV均未表现活性。以上研究为以w型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础。

摘要:根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的Ⅰ型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列, 分别设计了两对引物,并以分离的致病性鸡大肠杆菌基因组为模板, 经PCR特异性扩增出pilA基因和ompC基因, 基因产物大小为别为549 bp和1104 bp, 与GenBank报道的参考菌株的两个基因序列的同源性为高达98.18%和97.28%。将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中, 得到两个重组质粒pETpilA和pETompC, 转化大肠杆菌BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(pETpilA)和BL21(pETompC), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析分别可见表达的20 kD和40.9 kD的特异条带; Western blotting结果表明, 两种蛋白可与抗体发生特异性结合, 说明其具有良好的免疫原性。将表达的菌毛蛋白和外膜蛋白的菌株分别制成基因工程疫苗, 免疫小鼠后, 具有很好的保护能力, 表明这两株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株。

摘要:从克隆质粒pGEM-DuIL-18扩增出鸭IL-18全基因片段, 克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒pcDNA3.1/DuIL-18(简称pDuIL-18)。将重组质粒pDuIL-18转染Cos7细胞, 转染细胞中含鸭IL-18基因的mRNA。SDS-PAGE分析表明, 表达产物是与鸭IL-18相符的约23 000的蛋白条带。鸭淋巴细胞转化试验表明, 表达产物对鸭淋巴细胞具有明显诱导转化作用。重组质粒pDuIL-18对H9亚型禽流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明重组质粒pDuIL-18能够提高禽流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答, 为研究能够更好地防制禽流感的新型疫苗提供了新的思路。

摘要:高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行, 目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架, 将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3￠UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域, 构建了pSX12(ORF4-7-3￠UTR)、p5NX12(ORF5-7-3￠UTR)以及p56N12(ORF5-6)三个PRRSV全长嵌合克隆。经DNA转染Marc-145细胞后拯救出嵌合病毒, 并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析; 选取拯救病毒v56N12(ORF5-6)和vSX12(ORF4-7-3￠UTR)免疫29日龄猪进行免疫原性试验, 结果表明, 以v56N12免疫后抗体水平相对较低, 故免疫原性相对较差; 而vSX12病毒免疫后14 d血清ELISA抗体达到阳性值(IDEXX ELISA值 s/p≥0.4), 免疫后28 d中和抗体效价从原来的1:5以下上升到1:15以上, 说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测;免疫后28 d以强毒JX143株攻毒, 结果vSX12免疫组未见发病, 而未免疫攻毒对照组全部发病并有1头死亡, vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6 d后消失, 而对照组攻毒后至少持续13 d, 说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护。本研究构建的三个嵌合病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗, 以及探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础。

摘要:由人羊水中分离羊水多能性干细胞, 通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化。取人羊水标本进行体外培养, 分离得到人羊水干细胞, 已连续传代培养至42代, 采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测。取10~15代羊水干细胞, 悬浮培养使其形成类胚体, 进而向心肌细胞诱导分化。培养的羊水干细胞呈成纤维样, 表达部分胚胎干细胞特异标志基因, 悬浮培养可形成类胚体。类胚体碱性磷酸酶(AP)检测呈阳性, 表达三胚层特异标志基因fgf5、ζ-globin和a-fetoprotein。羊水干细胞形成类胚体后进行诱导, 得到a-actin阳性细胞, 表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2.5、GATA4和a-MHC。试验结果表明, 从人羊水标本中可分离得到具有胚胎干细胞特性的细胞, 经初步检测确定为羊水干细胞, 并能通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化。

摘要:利用非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型, 比较了新鲜及培养后的CD34+和CD34-细胞在体内植入及重建造血能力。从新鲜脐血及培养后的单个核细胞(MNC)中分离出CD34+和CD34-细胞, 经尾静脉输注入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠体内, 6周后处死存活的小鼠, 取其骨髓、脾脏和外周血细胞, 分别进行细胞表型分析、造血集落形成单位和人特异性基因的检测。经检测, 输注CD34+细胞和混合细胞的小鼠, 其体内CD45+细胞及人源各系血细胞的含量相近, 两者均远远高于输注CD34-细胞的小鼠。输注培养后CD34-细胞的小鼠饲养6周后全部死亡,输注培养后CD34+细胞的小鼠存活率约为66.7%, 而输注培养后混合细胞的小鼠全部存活, 且在两组存活的小鼠体内均能检测到CD45+细胞及人源各系血细胞。结果表明: 无论是新鲜还是培养后的CD34+细胞均具有在NOD/SCID小鼠体内植入和重建造血能力, 而CD34-细胞不具有该能力, 但CD34-细胞与CD34+细胞同时输注有助于提高小鼠的存活率, 说明其对CD34+细胞在小鼠体内发挥植入和造血重建能力有一定的辅助作用。

摘要:在对产琥珀酸放线杆菌代谢分析的基础上选育出高产突变株对琥珀酸的工业生物转化有重要意义。在矩阵分析代谢通量基础上, 围绕柔性节点下的副产物乙酸及乙醇的降低分别实施软X诱变及定点突变选育, 并对比分析了突变株与出发株相关酶活及基因序列变化。针对出发株的流量分析显示产物琥珀酸的代谢通量为1.78(mmol/g/h), 主要副产物乙酸与乙醇的代谢通量分别为(0.60mmol/g/h)和(1.04 mmol/g/h), 并发现乙醇代谢加剧了琥珀酸合成中的H电子供体的不足; 筛选出的氟乙酸抗性突变株S.JST1的乙酸代谢通量降低了96%, 为0.024 ( mmol/g/h), 酶活检测表明磷酸乙酰转移酶(Pta)的酶比活力从602降低到74, 进一步的序列对比分析发现pta突变基因中产生了一个突变位点; adh定点复合突变株S.JST2的乙醇代谢通量降低了98%, 为0.020 (mmol/g/h), 酶活检测表明Adh的酶比活力从585降低到62, 最终突变株S.JST2琥珀酸累积产量达65.7 g/L。围绕产琥珀酸放线杆菌Pta及Adh酶活的降低实施定向选育, 在降低副产物流量的同时, 有助于改善细胞H供体代谢平衡进而提高琥珀酸的流量。所获突变株具有工业应用潜力。

摘要:采用液体培养的方法研究了培养基磷缺乏对黄瓜毛状根生长及其抗氧化酶活性及培养基中氮源和钙利用的影响。结果表明, 黄瓜毛状根在完全缺磷的培养基中几乎不能生长; 而培养基无机磷缺乏会抑制黄瓜毛状根的生长, 且浓度越低, 其抑制作用越明显, 毛状根变得越纤细而长, 侧根数减少且短小。与全磷培养相比, 磷缺乏培养基培养的黄瓜毛状根可溶性蛋白含量明显偏低, 但其SOD和POD活性则明显升高。与完全缺磷(对照)相比, 在培养过程中不同无机磷浓度培养的黄瓜毛状根的SOD和POD活性均比对照低。当黄瓜毛状根在不同磷缺乏浓度的液体培养基中培养时, 随着培养时间的延长, 培养基的电导率逐步下降, 并与培养基起始无机磷浓度成正比; 其培养基的铵态氮和硝态氮不断被吸收和利用, 培养至15d时, 培养基中的铵态氮已绝大部分被消耗完毕, 但直至培养30d时培养基的硝态氮仍未被消耗完毕。培养基中无机磷缺乏会降低黄瓜毛状根对培养基硝态氮的吸收和消耗以及抑制黄瓜毛状根对钙的吸收。而适当提高培养基的无机磷浓度可促进黄瓜毛状根对培养基中钙的吸收和消耗。

摘要:Leptin是由脂肪组织分泌的内源因子, 在调节机体能量平衡过程中起重要作用。Leptin促进脂解的研究由来已久, 但其作用机理尚不完善。本研究旨在通过系统检测关键脂酶mRNA的表达变化来探讨Leptin促进脂解的分子机理。运用形态学观察、油红O 染色和RT-PCR鉴定培养的猪原代脂肪细胞; 甘油测定试剂盒和游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒分别检测甘油和FFA的释放; 半定量RT-PCR检测关键脂酶mRNA的表达。结果显示: 100 nmol/L的Leptin可显著上调ATGL、TGH-2、HSL、MGL和LPL mRNA的表达(P<0.01), 但同时下调Perilipin mRNA的表达(P<0.01); Leptin呈浓度依赖性促进甘油的释放(P<0.01), 但对FFA的释放影响不显著(P>0.05)。以上结果提示, Leptin可能主要通过上调ATGL、MGL、LPL和下调Perilipin的表达促进猪原代脂肪细胞的脂解; 同时推测, FFA释放的相对稳定可能是由Leptin通过上调UCPs的表达而增加FFA的消耗引起的。

摘要:应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因, 克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZaA, 构建成重组表达质粒pPICZa-PTD-NPY。PCR和酶切鉴定及测序正确后, 经限制性内切酶Sac I线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中。阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达。经过120 h的诱导, 取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳, 表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白, Western blotting实验证实表达产物具有特异性。获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白, 为下一步的应用研究提供了物质基础。

摘要:为研究狐g-干扰素的生物学活性, 应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出g-干扰素(VuIFN-g)cDNA。序列分析表明VuIFN-g cDNA全长501 bp, 编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白, 与已发表的银黑狐和犬IFN-g 核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%; 氨基酸同源性均为100%。应用原核表达系统高效表达北极狐g-干扰素成熟肽蛋白, SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19 kD, 以不溶性的包涵体形式存在。重组蛋白经纯化和复性, 在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制, 并测出北极狐重组g-干扰素的活性单位分别为1.0×106 u/mg和1.56×105 u/mg, 为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础。

摘要:为了明确杀虫晶体蛋白中各个Loop的结构与功能的关系, 以及Loop突变对Cry1Ba蛋白杀虫活性的影响, 首先通过三维结构模拟以及同源序列分析的方法, 找到Cry1Ba蛋白三个结构域及三个Loop相对应的氨基酸片段; 然后通过重叠引物PCR将编码Cry1Ba蛋白结构域Ⅱ中的三个Loop进行了相应的突变, 共获得了5个突变体M1 (Loop1: 340WSNTR344—缺失(Cry1A))、M2 (Loop2: 402Y—G)、M3 (Loop2: 400GIYLEP405—PSAV (Cry3A))、M4 (400GIYLEPIH407—ILGS(Cry1A))、M5 (Loop3: 472LQSRV476—AGAVYTL (Cry1A))。将这些突变体在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达, 提取蛋白, 分别对小菜蛾进行了生物活性测定。生测结果表明, Loop1的缺失突变M1的毒力, 与Cry1Ba (LC50 0.96 mg/mL)相比, 显著降低, LC50为35.51 mg/mL; 在Loop2的突变中, 单个氨基酸的突变 (Y/G)M2的毒力略有下降 (LC50为1.31 mg/mL); 而另两种突变 (M3和M4)对小菜蛾的毒力明显下降, LC50值分别为11.56 mg/mL、34.8 mg/mL; Loop3的突变M5对小菜蛾的毒力略有提高 (LC50 0.81 mg/mL), 但差异不显著。对Cry1Ba蛋白突变前后结构与功能之间关系的分析结果表明, Loop区突变对Cry1Ba蛋白的结构和功能影响非常显著; Loop1和Loop2在决定Cry1Ba对小菜蛾的毒性方面起着重要作用。

摘要:有机酸是重要的化工原料, 从市政污泥厌氧发酵过程提取有机酸、用于生产高附加值的产品可以实现废物资源化。本研究在确定最佳有机溶剂和萃取剂的基础上, 考察了有机溶剂对城市污泥厌氧发酵生产有机酸的影响。结果表明, 较合适的溶剂和萃取剂分别为磺化煤油和三烷基氧膦。少量磺化煤油对城市污泥发酵产生产有机酸有一定促进作用。

摘要:利用随机森林-通路分析法, 通过袋外样本OOB的分类错误率筛选特征代谢通路, 在特征通路上作基因表达相关性研究并对通路上的基因采用MAP(Mining attribute profile)算法挖掘不同实验条件下基因的共调控表达模式, 对共调控表达模式进行聚类。分析结果显示同一特征代谢通路上的基因表达倾向相似, 有2条特征代谢通路存在共表达模式,其中一条通路含108个表达模式,对这些模式进行聚类, 其最低聚类的相似系数仍高达0.623, 说明同一特征代谢通路上的基因共表达模式在不同实验条件下仍具有高度的相似性。对以通路作为基因模块进行复杂疾病的研究具有借鉴意义。

摘要:本实验旨在构建雪莲类PEBP基因原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化类PEBP基因所编码的蛋白, 为进一步研究奠定基础。将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到原核表达载体pET30(+)上, 转化感受态表达菌株BL21(DE3), 低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达, 纯化产物, Western blotting鉴定目的蛋白。IPTG低温诱导PEBP, 经SDS-PAGE分析, 其相对分子量约为28 kD, 与预期相符, 表达量约占菌体蛋白的26.8%, 并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白, Western blotting鉴定为阳性。成功构建了原核表达载体pET-PEBP, 获得了高效表达产物, 并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础。

摘要:本研究旨在建立人IFN-g体外释放检测法, 用于人结核病的特异性诊断。克隆表达了人IFN-g基因, 利用纯化的重组IFN-g免疫小鼠, 获得两株高效价的单克隆抗体。用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-g多克隆抗体建立了检测人IFN-g的夹心ELISA, 检测灵敏度达到31.25 pg/mL。采集111位结核病阳性病人与292位临床健康对照者肝素抗凝全血,利用结核菌特异性抗原ESAT-6/CFP-10融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-g, 用所建立的夹心ELISA及商品化试剂盒平行检测所有样本, 结果表明两种方法的检测结果相符。结核患者的检测灵敏度为95.5%, 健康对照的阳性检出率为16.7%, 患者与健康对照的阳性检出率差异极显著(P<0.01), 证实所建立的方法灵敏度与特异性均很高, 具有良好的应用前景。

摘要:采用分子量为20 kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰重组人干扰素a-2b(IFN a-2b), 建立了修饰反应及分离纯化工艺。考察了修饰反应各因素对单修饰转化率以及单修饰产物体外活性的影响, 获得了优化的修饰反应条件, 即在pH 6.5, 20 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中, 干扰素a-2b的浓度为4 mg/mL, PEG与IFN a-2b的摩尔比为8:1, 4oC时反应20 h; 在优化的反应条件下, 单修饰PEG-IFN a-2b的转化率达到55%。并且, 采用离子交换层析对修饰产物进行分离纯化, 单修饰产品纯度达到97%, 体外活性保留达到未修饰干扰素a-2b的13.4%, 其在SD大鼠体内的循环半衰期得到了较大的延长, 且具有较好的水溶液稳定性。

摘要:制备Asia I口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合, 采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株, 腹水效价均在100×29以上; 以纯化后的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原, 利用Asia I型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测Asia I型口蹄疫抗体。临床应用表明, 该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%, 和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。

摘要:对关中奶山羊配种后6~7天的桑椹胚和囊胚, 分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法进行处理。将处理后的胚胎培养于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上, 分离培养山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)。对分离传代的山羊ESCs分别进行免疫组化染色, RT-PCR检测和体外诱导分化试验。结果表明, 全胚培养法易于胚胎贴壁形成原代集落, 采用全胚培养法获得的ESCs有一株目前已传至18代。山羊ESCs Nanong、Oct4、SSEA-3免疫组化染色呈阳性, SSEA-1免疫组化染色呈弱阳性, SSEA-4免疫组化染色呈阴性, RT-PCR检测显示其表达Nanog、Oct4、端粒酶、CD117。山羊ESCs经DMSO体外诱导可以向心肌细胞分化, 这些试验均表明该细胞具有ESCs的生物学特性。