摘要:支架作为组织工程的关键要素之一, 影响着所接种细胞的分布和增值以及新组织的形成。传统的方法虽然可以制造出各种孔隙率的支架, 但缺乏对支架多孔结构的控制。近年来, 快速成形技术发展迅速, 并成功应用于组织工程支架的制造, 实现了组织工程支架内部多孔结构与复杂外形的精确控制, 从而使得构建理想的组织工程化结构体成为可能。以下回顾了应用快速成形技术制造组织工程支架的优势与潜力, 展望了未来组织工程支架的设计制造发展方向。

摘要:本实验室已经通过基因芯片技术筛选到一个白粉菌诱导后上调表达的抗病相关基因Hv-S/TPK, 并获得了它的全长cDNA序列。利用Hv-S/TPK的特异引物筛选小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系基因组可转化人工染色体(Transformation-competent artificial chromsome, TAC)文库, 获得了阳性TAC单克隆, 并进一步获得了含有Hv-S/TPK cDNA序列的5160 bp(GenBank Accession No. EU153366)的亚克隆。对亚克隆的序列分析结果表明, Hv-S/TPK基因在起始密码子和终止密码子之间有3个内含子和4个外显子, 4个外显子序列与簇毛麦上已得到的Hv-S/TPK的cDNA序列100%同源。对起始密码子上游序列分析结果表明, 该基因的调控序列中, 含有W-Box、OCS-element等与抗病相关的元件。以TAC克隆为探针与小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH), 结果表明含有Hv-S/TPK基因的TAC克隆来自于簇毛麦。

摘要:基因载体的转染、表达效率低和存在安全问题是基因治疗的难点。由于传统病毒及质粒载体含有大量外源基因, 其表达有可能引发较严重免疫副反应。本课题旨在新的设计思路上开发高效安全基因治疗载体。 微链载体利用设计好的Cap序列封闭基因表达框两端, 起到防止细胞内核酸外切酶降解的作用。从pEGFP-N3质粒中分离纯化得到GFP基因作为微链载体的报告基因。将微链载体与原质粒载体(pEGFP-N3质粒)分别转染入真核细胞, 利用荧光显微镜和流式细胞仪检测并比较其转染效率。结果显示微链载体在293、CNE2、3T3、B95-8等真核细胞中的转染、表达效率较高, 并具有较小的细胞毒性。初步证实了微链载体在真核细胞中转染、表达效率及安全性等方面具有一定的优越性。

摘要:采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-a-b融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab), SDS-PAGE和 Western blotting分析表明ST1-LTB-a-b融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达, 融合蛋白分子量约为110 kD; 20 L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为: 重组菌株以1%接种量、5 L/min通气量培养3 h后加终浓度为0.03 mol/L的乳糖诱导, 通气量升至12.5 L/min继续培养6 h, 表达量占菌体总蛋白的38.53%; 表达的ST1-LTB-a-b融合蛋白无毒性但具有免疫原性, 可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染; 构建的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab)有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。

摘要:通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析, 确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000 bp序列发现在-160 和-650处有2个推测的Rim101p结合位点, 对其分别进行定点突变, 然后构建启动子与报告基因LacZ融合质粒, 转化整合到白念珠菌rim101-/-株和野生株中, 检测不同缺铁条件下b-半乳糖苷酶活性。结果发现碱性条件, Rim101p能够正向调控FRP1的表达; 启动子-160处突变对启动子功能影响较弱, 而-650突变使启动子活性大大降低, 此结果和双突变的结果相同, 表明Rim101p主要通过与启动子-650处结合位点相互作用来调控FRP1的表达。

摘要:猪是研究糖尿病最理想的模型动物, 研究胰岛素和胰岛素抵抗是研究糖尿病的重要环节。为明确SOCS-3在胰岛素抵抗中的作用, 分别用100 nmol/L的胰岛素, 300 nmol/L的地塞米松处理原代培养的猪脂肪细胞诱导胰岛素抵抗; 利用半定量RT-PCR技术分别检测SOCS-3、OB、GLUT4和PPARg 基因表达变化。结果发现, 胰岛素增加了GLUT4、SOCS-3和PPARg 基因的表达, 对OB基因表达变化没有显著性影响; 地塞米松诱导的胰岛素抵抗状态下OB和SOCS-3基因表达水平升高, 而GLUT4和PPARγ基因表达水平显著下调。研究结果表明, GLUT4基因表达量水平的升高可能是由于PPARg的高表达引起, SOCS-3基因的不同表达水平对胰岛素信号的抑制效果不同。地塞米松诱导的胰岛素抵抗不仅表现在对葡萄糖转运的抑制, 也反映在抑制了胰岛素信号; 而SOCS-3基因可能是消除胰岛素抵抗的一个有效靶基因。

摘要:根据GenBank已发表的人、小鼠及大鼠GPR43(G protein-coupled receptor 43)基因序列, 设计并合成一对引物, RT-PCR扩增获得猪GPR43基因cDNA, 并利用PCR技术检测该基因在不同猪种、不同发育阶段、不同部位脂肪组织及原代脂肪细胞中的转录表达规律。结果显示, 成功克隆猪GPR43 cDNA片段, 长度为486 bp (GenBank登陆号为EU122439); 同源性分析发现, 猪GPR43与人、小鼠和大鼠同源性达83%以上; GPR43 mRNA表达量在脂肪型猪种上显著高于瘦肉型猪种, 随月龄增长表达量逐渐上升, 且皮下脂肪表达量较内脏脂肪高; 在猪前体脂肪细胞诱导分化过程中, GPR43 mRNA表达量呈时间依赖性升高。揭示GPR43 mRNA表达与猪肥胖程度、年龄、脂肪沉积部位以及脂肪细胞分化程度密切相关。

摘要:构建含人乳头瘤病毒11型(Human papillomavirus type 11, HPV11)完整开放读码框(Open reading frame, ORF)基因组的质粒并对其功能进行初步验证, 为构建HPV11转基因动物模型奠定基础。分别构建重组质粒pQE-Trisystem- EGFP/HPV11(pE/H)、pQE-Trisystem-EGFP/1.1copyHPV11(pE/1.1H), 将pE/1.1H、pE/H、闭环状HPV11基因组分别转染原代人角质形成细胞(Keratinocyte, KC)并进行检测。在质粒上成功构建了目的序列, 转染后在pE/1.1H组、pE/H组、HPV11组中检测到HPV11E6基因的表达; 在pE/1.1H组、pE/H组中检测到荧光; HPV11组、pE/H组、pE/1.1H组具备促细胞增殖功能, 实验组间比较pE/1.1H组稍弱(P<0.01), 但与对照组相比均差异极显著(P<0.01)。将具有完整ORF的HPV11基因组(1.1copyHPV11)成功构建于质粒上, 其具备野生型HPV11病理表型; 为研究低危型HPV致病机理提供了实验材料和方法学指导; 为进一步构建HPV11转基因小鼠奠定了基础。

摘要:为探讨重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)对CIK(Cytokine-induced killer cells)细胞活化、增殖的影响及CIK细胞的免疫学特性和对肺癌耐药细胞DDP-A549 (DDP: Cisplatin)的杀伤作用。提取健康人外周血中单个核细胞, Ⅰ组细胞接种于前一天用RetroNectin和CD3MAb包被好的培养瓶中, Ⅱ组接种于单独用CD3MAb包被好的培养瓶中, 接种当天加入IFN-γ, 第二天加入IL-2诱导CIK细胞。细胞计数法测定CIK细胞的增殖,并绘制细胞生长曲线, MTT法测定细胞杀伤活性,流式细胞术分析细胞表型。扫描电镜和透射电镜下观察CIK细胞对DDP-A549的杀伤和DDP-A549细胞的改变。RetroNectin对CIK细胞有很强的激活作用, 可使其细胞增殖总数达524.77倍, 其主要效应细胞CD3+CD56+可达(31.40±1.91)%; 对肺癌耐顺铂细胞DDP-A549的杀伤作用明显高于其亲代药物敏感株A549(P<0.01)。但两组CIK细胞对靶细胞的杀伤率在相同效靶比时无明显差异(P>0.05)。RetroNectin能显著增强CIK增殖活性, 但对CIK细胞的杀伤活性并无明显影响。CIK能够显著抑制DDP-A549的生长, 可用于耐顺铂肺腺癌的免疫治疗。

摘要:为探讨羟丙基壳聚糖基共混膜作为组织工程技术中角膜细胞培养载体的可行性, 分别制备了羟丙基壳聚糖/硫酸软骨素、羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素以及羟丙基壳聚糖/氧化透明质酸/硫酸软骨素三种共混膜。测定其透光率、含水量和蛋白吸附性能; 在共混膜上培养兔角膜上皮细胞, 通过观察角膜上皮细胞在不同载体膜上的生长状态、贴附情况, 测定细胞活性以及上清液中乳酸脱氢酶的活性, 研究三种壳聚糖基载体膜片与角膜上皮细胞的相容性。膜片理化性质测定结果表明三种共混膜片具有良好的透明度, 适宜的含水量和较强的蛋白吸附性能; 细胞相容性实验结果表明羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素共混膜对细胞的损伤最小, 有利于细胞在膜上的贴附和生长, 表现出良好的细胞相容性, 有望作为角膜细胞载体体外构建组织工程化角膜。

摘要:对虾白斑综合症病毒(WSSV)是全世界对虾养殖业最主要的病原体之一, 虽然对该病毒的研究已较为深入, 但目前仍无有效的防治方法。本研究应用噬菌体展示技术, 构建了抗变性WSSV的单链抗体噬菌体展示文库, 分别以WSSV病毒粒子和原核表达的囊膜蛋白VP28为靶分子对该文库进行淘选。经过数轮淘选后, 得到5个能特异识别WSSV的单链抗体, 且首次获得了能特异识别WSSV线性抗原表位的单链抗体P75E8。并通过免疫胶体金电镜分析, 对5种单链抗体对应在病毒粒子上的表位进行了定位。为获取识别多种WSSV抗原的抗体提供了新的方法路线, 也为获取特异性识别线性表位的单链抗体提供了一种新的淘选技巧。

摘要:采用定点突变技术改造杀虫晶体蛋白, 是提高其杀虫活性的有效途径, 但目前在突变位点和氨基酸种类的选取上还存在很大的盲目性。以杀小菜蛾活性明确的23个杀虫晶体蛋白上的4个关键结构域为研究对象, 用主成分分析法处理20种氨基酸1369种性质参数后的第一个主成分的得分向量来表征氨基酸差异, 实现序列数据化。通过逐步回归找到了6个关键氨基酸位点: X3、X9、X12、X13、X14和X19, 并进一步通过偏最小二乘二次多项式回归寻根最优氨基酸残基L/X3、S/X9、S/X12、T/X13、A/X14和G/X19, 从而建立了杀虫晶体蛋白的序列特征与其杀小菜蛾活性间关系的定量模型。这有助于快速地预测出有利于提高杀小菜蛾活性的氨基酸位点和种类, 从而提高定点突变改造杀虫晶体蛋白的效率。

摘要:为揭示长双歧杆菌NCC2705 (Bifidobacterium longum NCC2705)果糖代谢途径, 建立其果糖发酵模型。以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础, 进行了果糖和葡萄糖生长的菌体比较蛋白质组学研究, 利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS鉴定差异蛋白, 进一步通过半定量RT-PCR验证二者显著差异表达蛋白。果糖生长的菌体蛋白中鉴定到了所有葡萄糖降解途径中的酶和蛋白质, 另外鉴定到3倍以上差异蛋白点9个, 其对应的5个蛋白在果糖发酵中上调。半定量RT-PCR验证显著差异蛋白, 显示在果糖发酵中具有高水平表达是ABC 转运系统的果糖特异性-结合蛋白BL0033和ATP结合蛋白BL0034。果糖的发酵时间和浓度梯度试验显示诱导时间越长、浓度越高, BL0033的表达量越高。第一, 比较蛋白谱证明果糖和葡萄糖以相同途径降解。第二, BL0033的表达是受果糖诱导的, 果糖的吸收可能是通过一个特殊的转运系统, 即ABC转运系统将果糖从胞外转运到胞内, 其中BL0033和BL0034共同作为系统元件扮演了重要角色。

摘要:从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性b-葡萄糖醛酸酶基因, 以热激载体pHsh为表达质粒, 在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后, 酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明, b-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC, 最适反应pH为5.0, pH 5.8~ 8.2之间酶的稳定性较好, 80oC的半衰期为2 h, SDS-PAGE结果显示分子量为65.9 kD, 与理论推算值相吻合。以对硝基苯-b-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时, 其动力学参数Km值0.18 mmol/L, Vmax值为312 u/mg。初步的应用分析表明, 该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。

摘要:采用模拟废水, 对新型高负荷螺旋式自循环(Spiral automatic circulation, SPAC)厌氧反应器的运行性能进行了实验室模拟研究。结果表明: 在30oC, 水力停留时间(HRT)为12 h, 进水COD浓度从8000 mg/L升至20 000 mg/L的条件下, 反应器的COD去除率为91.1%~95.7%, 平均去除率为93.6％。在进水浓度为20 000 mg/L, HRT由5.95 h缩短至1.57 h的工况下, COD去除率从96.0%降低至78.7%, 反应器达到最高容积负荷率306 g COD/(L·d), 最大容积COD去除率240 g/(L·d), 最高容积产气率131 L/(L·d)。该反应器对基质浓度的连续提升具有良好的适应能力。进水COD浓度由8000 mg/L提升至20 000 mg/L时, 出水COD浓度一直处在较低水平(平均为852?mg/L), 容积COD去除率和容积产气率分别提高162%和119%。该反应器对HRT的连续缩短也有良好的适应能力。HRT由5.95 h缩短至1.57 h时,反应器容积COD去除率和容积产气率分别升高191%和195%。

摘要:以pUG6为模板, 设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物, 构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒, 转化啤酒酵母G-03, 获得一株G-03/a转化菌, 遗传稳定性良好, 测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%, 发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%, 成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6 d后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母, 能够提高啤酒的风味稳定性。

摘要:应用原子力显微镜(Atomic force microscope, AFM)在单细胞水平上研究食品防腐剂苯甲酸钠(Sodium benzoate, SB)的生物毒性, 从可视化的角度分析了淋巴细胞与不同浓度SB作用不同时间后其形态及其膜超微结构的影响。结果与正常淋巴细胞相比, 随着与淋巴细胞作用的SB浓度和作用时间的增加, 细胞形态及细胞膜明显发生改变, 其超微结构也趋复杂。经SB作用后的细胞高低差Rp-v、均方根粗糙度Rq、平均粗糙度Ra、平均高度4个几何参数值均明显发生改变。对经SB作用后的淋巴细胞进行统计学分析, 并探讨了其作用机制。

摘要:Taxol is the most effective antitumor agent developed in the past three decades. It has been used for effective treatment of a variety of cancers. A taxol-producing endophytic fungus Pestalotiopsis pauciseta (strain CHP-11) was isolated from the leaves of Cardiospermum helicacabum and screened for taxol production. The fungus was identified based on the morphology of the fungal culture and the characteristics of the spores and screened for taxol production. The amount of taxol produced by this endophytic fungus was quantified by HPLC and it produced 113.3 mg/L, thus the fungus can serve as a potential material for fungus engineering to improve taxol production. This fungal taxol also had strong anticancer activity against some cancer cells viz., BT 220, H116, Int 407, HL 251 and HLK 210 tested by Apoptotic assay and it is indicated that with the increase of taxol concentration from 0.005–0.05 mmol/L, taxol induced increased cell death through apoptosis.

摘要:从序列出发快速确定氧化还原酶的辅酶依赖类型对于了解其结构和功能、催化机制及构建辅酶再生体系具有重要指导作用。对Chou提出的伪氨基酸组成方法进行了修正并用于提取氧化还原酶序列特征值, 采用k-近邻算法预测其辅酶依赖类型。当λ=48, w=0.1时, 10倍交叉验证结果表明: 其ROC曲线下面积为0.9536, 预测精度达92.0%, 比最优条件下伪氨基酸组成预测精度提高了3.5%; 与其他7种常见特征值提取方法相比, 修正的伪氨基酸组成表现最好。结果表明从序列出发预测氧化还原酶辅酶依赖类型是可行的, 且修正的伪氨基酸组成可望成为一种新的有效提取蛋白质序列特征值方法。

摘要:应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。

摘要:发酵动力学研究是实现发酵过程最优化控制及发酵过程放大的前提条件。本研究对羊肚菌液体深层发酵动力学进行了研究, 在Matlab软件平台上, 应用遗传算法对比了真菌生长较常用的Monod与Logistic方程在描述羊肚菌生长动力学时的优劣, 并对羊肚菌的生长、胞外多糖产生和基质消耗模型进行了参数估计。结果表明, Logistic方程与试验数据拟和情况更好, 并给出了羊肚菌液体深层发酵的动力学模型具体形式, 经验证, 模型的平均误差为5.8%。利用遗传算法选择羊肚菌动力学模型, 并进行参数估计与其他方法相比具有快速、搜索面广、接近全局最优解的特点, 在处理分批发酵动力学问题上具有不可比拟的优势, 发酵动力学模型的建立为发酵过程优化及放大奠定了基础。

摘要:在基因治疗中, 实现目的基因的调控表达是非常重要的。然而, 传统基因载体的无调控地持续或不适当的表达会影响治疗效果, 甚至可能带来致命的副作用。在本研究中, 我们构建了一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体, 并在体外评估了其调控表达作用。利用分子生物学技术, 将DsRed基因和启动子, 以及RU486系统构建成单一的质粒载体PDC-RURED, 为减少RU486调控元件和基因表达元件之间的相互干扰, 在两者之间加入1.6 kb的绝缘子。经PCR检测和限制性酶切分析及序列测定均证实了载体的正确性。在转染HEK293细胞后, 运用荧光显微镜和流式细胞技术证实了该载体的调控能力。没有RU486时, 几乎没有红色荧光蛋白的表达, 而加入诱导剂RU486后, 最高可以实现红色荧光蛋白的40余倍的表达。实验结果表明构建的可经RU486诱导的新型真核表达载体可以实现对目的基因的表达时间和表达水平的调控, 为进一步的基因调控研究和和基因治疗提供了良好的工具。

摘要:分离出菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(SoBADH)构建成由CaMV35S驱动的双元植物表达载体pBSB, 农杆菌菌株LBA4404携带该载体转化棉花, 获得转基因棉花植株。65株转基因植株经过PCR筛选、Southern blotting分析证明有45株为成功的转化株, 外源基因已经被整合到棉花的染色体组中, 并以单拷贝插入居多。对部分株系的SoBADH基因的表达进行分析表明均有较高的mRNA和蛋白的表达。经测定这些株系中的甜菜碱脱氢酶活性显著提高, 达到0.66~1.70 nmol/min/mg水平。同时这些转基因株系在盐胁迫下比对照长势强, 株高和地上部分的鲜重显著高于非转基因对照; 在低温胁迫下, 这些转基因株系表现出显著的抗冻性能。结果表明菠菜甜菜碱醛脱氢酶能够在异源植物棉花中过量表达, 并具有较高的酶活性, 转基因棉花可作为抗逆育种的种质材料。

摘要:为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。

摘要:从小麦野生近缘属——粗山羊草中挖掘小麦条锈病抗病基因, 拓展小麦抗病性的遗传基础。利用抗小麦条锈病与感小麦条锈病的粗山羊草间杂交, 从粗山羊草[Aegilops tauschii (Coss.) Schmal] Y206中鉴定出1个显性抗小麦条锈病基因, 暂定名为YrY206。应用分离群体分组法(Bulked segregant analysis, BSA)筛选到Wmc11a、Xgwm71c、Xgwm161和Xgwm183标记, 与该基因之间的遗传距离分别为4.0、3.3、1.5和9.3 cM。根据连锁标记所在小麦微卫星图谱的位置, YrY206被定位在3DS染色体上。分析基因所在染色体的位置、抗病性特征, 认为YrY206是一个新的抗小麦条锈病基因。

摘要:利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因, 连接至克隆载体pGEM-T中, 转化大肠杆菌DH5a, 通过测序对其进行序列分析后, 进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN, 通过电击法转化毕赤酵母GS115, 转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定, 获得了重组毕赤酵母菌株; 经甲醇诱导人脂联素基因表达, Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因, 在30oC, 1%甲醇诱导48 h, 人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。

摘要:通过PCR技术扩增大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶b亚基(L-tartrate dehydratase beta subunit, TtdB)野生型与Cys/Ser突变型目的基因, 构建带6×His标签的诱导型表达载体pTrcHisC-TtdB。重组蛋白以包含体形式存在, 应用TALON固定化金属亲和树脂(Immobilized metal affinity chromatography, IMAC)以变性的方法纯化, 通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性, 复性率可达70%。将复性后的两种蛋白通过热诱导去折叠和氧化重折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验。SDS-PAGE分析表明: 野生型TtdB在其变性的临界温度反应时, 出现交联二聚体和多聚体; 在氧化重折叠后SDS-PAGE前加入100 mmol/L DTT时, 交联强度明显减弱。这种DTT打不开的交联即为异肽键交联; 若在其氧化重折叠反应液中加入DTT则没有任何交联。突变型TtdB在与野生型TtdB相同的热诱导去折叠条件下, 完全没有二聚体和多聚体的形成。

摘要:猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体, 为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18, 本研究采用超声破碎菌体, 0.2%、2% DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9% SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后, 利用透析与凝胶过滤层析技术相结合对rCE18进行复性和纯化。同时, 采用GST-FF亲和柱层析及SDS-PAGE胶回收蛋白两种方法纯化rCE18, 比较三者的纯化效果。并通过间接ELISA检测复性蛋白的生物学活性。结果表明: 经透析与凝胶层析复性纯化后的rCE18蛋白的纯度可达到60%以上, 活性回收率为41.3%, 间接ELISA证实, 复性后的rCE18蛋白能特异性识别猪囊虫阳性血清, 检测敏感性高达97.2%, 与全囊虫抗原检测的符合率为100%。本试验初步建立了猪囊尾蚴rCE18包涵体纯化及复性的有效方法, 为猪囊尾蚴rCE18蛋白的诊断应用奠定了基础。

摘要:选择临床上常用的用于自身免疫性疾病抗体检测所对应的12种抗原, 运用NBT/BCIP显色反应策略, 研制一种可同时检测12种常用自身抗体的蛋白芯片检测系统。应用NBT/BCIP终点检测体系对每一种抗原的点样液、点样浓度、血清稀释度进行优化, 制备出可同时检测12种自身抗体的蛋白芯片, 并通过对678例病人血清和120例非病人血清的检测进行敏感度和特异度评价。优化的点样液为0.1%TBST, 血清稀释度为1:4, 12种抗原的最佳点样浓度分别为: ANA 520 mg/mL, Ro-60/SSa 465 mg/mL, La/SSb 530 mg/mL, Jo-1 530 mg/mL, Scl-70 525 mg/mL, Sm 520 mg/mL, Ro-52/SSa 615 mg/mL, RF 340 mg/mL, CCP 465 mg/mL, u1RNP 410 mg/mL, CENP-B 490 mg/mL, dsDNA 580 mg/mL; 通过对678份阳性血清和120份阴性血清的检测, 该蛋白芯片技术对12种自身抗体检测的敏感度在80%~96.3%之间, 特异度在86.7%~100%之间, 与传统的检测技术有较高的符合率。我们研究的自身抗体检测蛋白芯片技术体系具有快速、方便、高通量、廉价等优势, 易于商业化, 适合不同条件的临床需要。