摘要:血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3.4.15.1)是一种位于细胞膜上, 依赖锌离子的羧二肽酶, 催化水解十肽血管紧张素I羧基末端两个氨基酸, 生成具有血管收缩作用的八肽血管紧张素II。ACE在血压调节系统renin - angiotensin system (RAS系统)中具有重要作用, 从ACE的结构功能、基因多态性及其抑制剂等方面进行了详细综述。发现体细胞ACE两个活性中心催化血管紧张素I和缓激肽的机制不同, 因此以体细胞ACE单个活性中心为靶点的研究, 将会为研制开发副作用更少, 安全性更高的ACE抑制剂提供新的途径。

摘要:糖尿病是一类严重的代谢疾病, 正危害着世界上越来越多人口的健康。胰岛移植是一种治疗糖尿病的有效方法,却因供体缺乏和移植后免疫排斥问题制约了其广泛应用。干细胞为具有强增殖能力和多向分化潜能的细胞, 是利用细胞替代疗法治疗重大疾病的细胞来源之一, 其中成体干细胞因不存在致瘤性及伦理道德问题而被人们寄予厚望。成体胰腺干细胞在活体损伤及离体培养条件下均能产生胰岛素分泌细胞, 肝干细胞、骨髓干细胞和肠干细胞等在特定离体培养条件下或经过遗传改造后也均可产生胰岛素分泌细胞, 将这些干细胞来源的胰岛素分泌细胞移植到模型糖尿病小鼠中可以治疗糖尿病。因而, 成体干细胞可以为细胞替代疗法治疗糖尿病提供丰富的胰岛供体来源。

摘要:将去除信号肽编码序列的鹅IL-2基因克隆到原核表达载体pET-28a (+), 构建了重组表达质粒pET-28a (+)-goIL-2, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了重组鹅IL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示, 表达蛋白的分子量约为15.0 kD, 能被抗鹅IL-2单克隆抗体特异识别。可溶性分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在, 部分以可溶形式存在, 非变性电泳可见可溶性蛋白存在单体和多聚体组分。镍柱亲和层析法纯化的rgoIL-2蛋白过滤后, 利用?KTA FPLC(快速蛋白分离纯化系统)进行逐级分离, 非变性电泳可见单一的鹅IL-2可溶性蛋白单体。体外生物学活性分析显示鹅IL-2可溶性蛋白单体能刺激鹅淋巴细胞增殖。这为进一步研究鹅IL-2的生物学功能及其临床应用奠定基础。

摘要:将克隆并确定序列的水稻(Oryza sativa L．Cpslo17)几丁质酶基因Oschi的cDNA序列(此序列已在GenBank中注册, 登录号为EU045451)插入原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切、序列鉴定分析后, 用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3); 经IPTG诱导获得表达, 并对Oschi蛋白表达条件进行了优化; 在大肠杆菌中表达的几丁质酶经纯化后在一定的浓度、一定的反应时间内能高效地分解几丁质。

摘要:构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。

摘要:以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。

摘要:草酸是多种真菌的致病因子。在含1.2 mmol/L 草酸和10 mmol/L 雌二醇的MS缺钙培养基上, 从大约含6000个独立株系的拟南芥化学诱导突变体库中筛选草酸不敏感的突变体。初筛获得的可能的草酸不敏感突变体单株收种后, 进一步复筛获得5株较抗草酸的突变体D33、D74、D154、D282和D630。对它们的TAIL-PCR的第三步产物回收、测序、比对的结果表明：D33的T-DNA插入位点位于At2g39720 (Zinc finger ) and At2g39730 (Rubisco activase) 之间, D74、D154、D282和D630都插在At5g10450 (14-3-3 protein GF14 lambda) 的第一个内含子上。突变体后继的遗传分析与分子分析正在进行中。

摘要:旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。

摘要:通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。

摘要:利用双启动子构建含人补体调节蛋白DAF和MCP cDNA的双顺反子重组表达载体pcDNA3-DAFMCP-DP, 以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞, 用G418筛选获得NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP转化细胞。PCR实验结果显示人补体调节蛋白基因DAF和MCP整合在转化的异源细胞的染色体上。RT-PCR和Western blot印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子DAF和MCP在细胞系中皆获得同步表达。检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP结果表明人DAF和MCP基因仍稳定整合在细胞基因组中, 并未随着传代而丢失, 为稳定的转双基因细胞系。补体依赖的细胞毒反应表明, pcDNA3-DAFMCP-DP转染细胞系由于DAF和MCP的共表达获得较DAF或MCP单一表达时更强的保护能力, 能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生, 保护宿主细胞免受人补体的攻击。以上结果表明, DAF和MCP双基因重组表达载体实现了人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达, 为获得表达多种人补体调节蛋白的理想供体提供了有效策略。而且共表达的DAF和MCP具有协同效应, 能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤, 在克服超急性排斥反应的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。

摘要:DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系, 为了提高目的基因的表达量, 本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰, 对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子, 同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN, 剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中, 将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、 pVC-HN, 用这些质粒转染293T细胞, 48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示, 与未经修饰的HN基因相比, 修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高, 并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。

摘要:以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。

摘要:利用RT-PCR、RACE技术克隆了甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)乙酰胆碱酯酶基因(Dd-ace-2) cDNA (GenBank 登录号EF583058), 用DNAMAN5.0、MEGA3.0进行了序列分析。克隆的Dd-ace-2 基因cDNA全长2425 bp, 包含一个2205 bp的开放阅读框, 编码734个氨基酸。Dd-ace-2基因推导的氨基酸序列与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)和动物寄生线虫胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)ace-2的氨基酸序列同源性分别达48.0%、42.7%和42.1%。在推导的734个氨基酸残基的前体蛋白中, 前面的701个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列, 其预测的分子量为79240.38 D。在一级结构中, 形成催化活性中心的3个氨基酸残基(Ser291, Glu442和His574)、胆碱结合位点Trp(177), 以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守; 在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基, 其中10个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示, 甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与其它线虫乙酰胆碱酯酶ACE-2同属一个支系。

摘要:GABARAP(GABAA-receptor-associated protein)是最新发现的与GABAA受体g2亚基胞内区有相互作用的蛋白, 目前的研究结果表明它可能是通过与微管相互作用辅助GABAA受体向细胞膜上运输并使受体在膜上聚集。本文中用PCR方法扩增出编码人GABARAP(hGABARAP)的cDNA片段, 然后分别克隆到真核表达载体pcDNA6/HA和谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX4T2中。将后者导入大肠杆菌BL21中, 经过IPTG诱导后用谷胱甘肽偶联的Sep- harose-4B柱子纯化出融合蛋白GST-hGABARAP。以此蛋白作为抗原免疫家兔制备抗GABARAP的抗血清, 并用GST- hGABARAP耦联的NHS-activated Sepharose 4柱子纯化抗体。纯化的抗体可以用于真核细胞中过量表达hGABARAP的Western和免疫染色检测。结果表明, 过量表达的hGABARAP在真核细胞核和细胞质中都有表达, 部分集中于核周 区域。

摘要:为将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8有效导入肌成纤维细胞C2C12中, 以pAV-hU6 + 27载体为基础构建逆转录病毒载体pXSN-hU6-siGDF-8, 并使之与pVSV-G质粒共转染GP-293细胞, 用包装出的病毒粒子感染宿主细胞C2C12, G418筛选稳定整合逆转录病毒的抗性细胞库。2周后, Western Blotting和Real-Time PCR分析结果显示, 细胞内源性的GDF-8基因的表达得到了有效的抑制; MTT法和细胞流式仪分析表明, G418抗性细胞得到了更有效的增殖, 并且G0/G1期细胞数量减少了13.7%, S期细胞数量增加了14.9%。因此, 逆转录病毒载体的RNA干扰系统可以稳定抑制 GDF-8基因表达, 它将成为治疗肌肉萎缩疾病的一个强有力的工具。

摘要:为实现基因治疗过程中的有效药物筛选及体内检测, 首次利用核糖体内部进入位点(IRES)构建了同时携带O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(MGMT)的突变型P140K基因和荧光素酶(Luciferase)基因的慢病毒载体pBobi-MIL。RT-PCR、免疫荧光、药物筛选克隆形成及化学发光检测等实验结果表明感染重组慢病毒L-MIL的细胞能同时表达MGMT及Luciferase。构建成功的新型慢病毒载体为今后的基因治疗奠定了基础, 也为慢病毒滴度的确定提供了一种新的可能。

摘要:为提高药蒲公英的耐盐性, 用20~30 d大小的药蒲公英叶片诱导愈伤, 获得的愈伤以NaCl作为选择因子, 用直接筛选的方法, 每3周进行一次继代培养, 经3个月继代筛选获得了耐1.5% NaCl的药蒲公英愈伤组织, 将耐1.5% NaCl的药蒲公英愈伤组织接种在分化培养基上分化出芽, 之后将再生芽转接到生根培养基中进行生根培养, 经4个月得到了12株耐1.5% NaCl的药蒲公英再生植株。与野生型相比, 耐盐植株叶片宽大、叶柄粗短、叶表面覆盖白色细毛, 根粗壮较短, 花茎中部具2 cm左右的苞叶。RAPD(Random amplified polymorphic DNA , 随机扩增的多态性DNA)和SDS-PAGE检测表明, 耐盐植株与对照植株在DNA及蛋白水平上均存在明显差异。1.5% NaCl处理后, 与普通再生植株相比, 耐盐株系的抗氧化酶活性明显提高, 脯氨酸含量上升幅度更为显著, 而丙二醛(MDA)含量降低, 其主要药用成分黄酮的含量显著增加。这些结果说明耐盐植株的抗氧化防御能力明显增强。以上结果表明耐1.5% NaCl的药蒲公英再生植株为耐1.5% NaCl药蒲公英变异体, 这些耐盐变异体有望成为抗盐耐海水蔬菜家族的新成员。同时, 这些耐盐变异体植株比普通植株具有更高的医用商业价值。耐1.5% NaCl的药蒲公英再生变异体遗传稳定性的研究正在进行中。

摘要:以胶原膜(含87.5 mg I型胶原蛋白)为载体, 复合3.5 mg rhBMP-2(人基因重组骨形成蛋白-2), 制备胶原蛋白/BMP复合材料。复合材料首先在兔背阔肌中埋置, 预构新生骨组织, 并采用ALP染色、Von Kossa染色和HE染色等观察复合材料的成骨过程和组织形态。然后将形成的新骨组织游离移植修复自体下颌骨体部洞穿性缺损; 并设以胶原为载体的rhBMP-2复合骨修复材料直接修复为对照组, 骨缺损不修复组为空白组。采用X线、抗压强度、硬组织切片、四环素荧光染色、骨形态计量检查, 观察复合材料修复骨缺损的质量和效果。结果表明, 胶原蛋白/BMP复合材料在兔背阔肌中4～6周成骨, 胶原材料于3～5周降解; 成骨过程为是以软骨成骨为主的方式, 新骨形态为编织骨, 可见明显的微血管分布; 游离移植修复自体下颌骨缺损, 6周缺损区为骨性愈合, 与对照组在抗压强度(P = 0.041)、新骨量(P = 0.034)均有显著性差异。胶原蛋白/BMP复合材料在骨骼肌中形成的新生骨组织可作为供骨修复一定范围的骨缺损。

摘要:MHC四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一。为研究H-2Db基因型(如C57BL/6)小鼠的特异性CD8+ T细胞免疫应答, 需要建立H-2Db四聚体制备技术平台。首先以RT-PCR方法克隆H-2Db重链基因的cDNA, 进而构建H-2Db胞外域与生物素化酶BirA底物肽(BSP)融合蛋白的表达载体, 并在大肠杆菌中获得表达。在LCMV GP33-41抗原肽(KAVYNFATC, KAV)和人β2-微球蛋白存在时, 通过稀释法复性获得H-2Db/KAV单体。该单体经生物素化并纯化后与PE-链亲和素按4: 1的比例混合, 即形成四聚体。通过流式细胞术检测经KAV肽免疫的C57BL/6小鼠体内的LCMV特异性CD8+ T细胞的频率, 结果表明在外周血、引流淋巴结和脾脏中均可检测到一定频率的LCMV特异性CD8+ T细胞, 其中以对外周血标本染色的效果最佳。成功建立了小鼠H-2Db四聚体制备技术平台, 为监测及分析基于H-2Db基因型小鼠的实验性免疫治疗创造了条件。

摘要:利用遗传学的原理, 通过杂交和回交的方法, 建立家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型, 利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术, 从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV抵抗性。其结果是获得家蚕高抗NB, 高感306, 近等基因系BC8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱, 分别获得180、190、187个蛋白点, 其中80%的蛋白点集中在等电点5~9范围之内。从三块凝胶上共获得明显差异蛋白点12个, 由质谱鉴定出5种蛋白, 其中氨基酰化酶(Aminoacylase)仅出现在抗性品系NB、近等基因系图谱中, 感性品系没有出现, 初步推测是家蚕抗BmNPV特有蛋白, 这是首次报道结果。

摘要:采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。

摘要:血小板表面的整合蛋白aⅡbb3对血栓的形成具有很重要的调控作用, aⅡbb3与纤维蛋白原上的RGD特征序列结合, 促进血小板凝集进而形成血栓。这样可以在理论上设计一个环形RGD小分子(RGD-c)与aⅡbb3蛋白结合, 阻断其与纤维蛋白原的结合位点, 进而阻断血栓形成。以糖蛋白avb3(pdb 代码 1jv2)作为模板, 利用modeller8v2软件进行同源模拟得到aⅡbb3三维模型。而小分子则以RGD序列为主, 两边各加一个氨基酸X、Y, X和Y之间用一个二硫键相连, 通过改变X和Y, 重复优化过程则可得到不同的小分子模型, 将其与aⅡbb3进行分子对接, 可以找出比较理想的XY组合, 对治疗血栓的药物设计具有重要的理论指导作用

摘要:文献报道采用氨基酸组成分布提取特征值能有效提高预测分类精度, 本文采用该方法提取特征值, 使用一种新的组合分类器——随机森林, 从蛋白质一级结构对嗜热和嗜冷蛋白进行分类。通过10倍交叉验证和独立样本测试两种方法检测, 结果表明：当分段数量为1时, 其精度最优, 分别为92.9％和90.2％, 暗示使用基于氨基酸组成分布提取特征值在该算法中并不能有效提高识别精度, 这与报道结果不符, 而该提取方法在SVM中却能适当提高识别精度; 当引入6个新变量后, 其精度分别提高到93.2%和92.2%, ROC曲线下面积分别为0.9771和0.9696, 优于其它组合分类器。

摘要:利用激光聚焦反射式颗粒测量系统, 通过调节不同的搅拌速率, 得到了分批补料培养条件下粒度分布不同的四个絮凝酵母SPSC01颗粒群体, 进而对絮凝颗粒群体分布对乙醇耐受性进行了系统研究。经过6 h、20%乙醇的冲击, 颗粒粒度为100、200、300和400 mm的自絮凝酵母SPSC01的存活率分别为3.5%、26.7%、48.8%和37.6%。这表明不同粒度分布的絮凝颗粒群体乙醇耐受性具有明显差别, 在一定粒度范围内乙醇耐受性达到最高, 乙醇耐受性最高的酵母群体的乙醇得率系数85.5%, 比乙醇耐性最低的颗粒群体提高了7.2%。粒度为100、200和300 mm的自絮凝酵母颗粒群体总麦角固醇、游离麦角固醇及海藻糖含量与粒度大小成正相关, 但在粒度为400 mm的絮凝颗粒群体中总麦角固醇、游离麦角固醇及海藻糖含量呈下降趋势, 与其乙醇耐性低于300 mm絮凝颗粒的结果相一致。对细胞膜透性的研究表明, 颗粒粒度为300 mm的絮凝酵母颗粒细胞膜通透性(P′)最低, 分别仅为颗粒粒度为100 mm和200 mm颗粒群体的43%和52%, 表明粒度分布不同的絮凝颗粒群体乙醇耐性的差别与细胞膜透性密切相关。

摘要:由于存在基因工程微生物(GEMs)不受控制地在环境中释放的风险, 利用GEMs的生物降解能力治理环境污染的方法受到了限制。在大肠杆菌JM109中构建了一个受环境污染物调控的细菌遏制系统, 该系统是由杀伤元件和调控元件组成的双质粒体系, 使细菌的存活受环境中水杨酸盐浓度的调控。当培养基含水杨酸盐时, 阻遏蛋白LacI合成, 阻止自杀基因gef表达, 细菌快速繁殖; 当水杨酸盐不存在时, 自杀基因gef的表达导致细胞杀伤, 菌体大量死亡。该遏制系统可作为模型用于具有生物修复功能的基因工程菌的构建。

摘要:采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因, 将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV, 然后用重组质粒pSNAV-Ig-BDNF转染包装细胞, 筛选出永久细胞株后, 用携带腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞, 成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病毒。经PCR鉴定该病毒含有目的基因片段, 被该病毒感染的细胞裂解液经Western blotting 证实有BDNF表达, 其培养液经ELISA检测证实含有高水平的BDNF蛋白。该病毒与小量的非复制型腺病毒Ad-null联合应用时, 其BDNF蛋白的表达水平显著提高。可弥补腺相关病毒起效慢、对细胞转导效率低的弱点, 为今后应用AAV作基因治疗提供了实验证据。

摘要:探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响, 为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区, 用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列, 获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体, 分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体, 通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明: 受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A 替换3′-调控区的pOV3K; 无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K, 重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用, 应当包括在鸡输卵管表达载体中。