摘要:近年来肿瘤多基因治疗倍受关注，然而目前缺少一种有效的构建多顺子的工具。传统的构建多顺反子的工具，如IRES 等，由于存在结构大，上下游基因表达差异显著等缺陷，严重限制了其应用。FMDV 2A，因其具有结构小、剪切效率高等优点为多基因治疗带来了新的希望。主要介绍了FMDV 2A的特性、“剪切”活力及其在构建多顺反子载体中的应用。

摘要:谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)系统在不同微生物细胞抵抗氧胁迫中的生理功能不尽相同。该系统在真核模式微生物酿酒酵母中是必需存在的，在维持胞内氧化还原平衡和抵抗氧胁迫中发挥主要作用。然而，在原核微生物中，该系统只是条件性的，即部分胞内存在谷胱甘肽还原酶和GPx的原核微生物，如流感嗜血杆菌和乳酸乳球菌，可通过从胞外吸收GSH，形成条件性的依赖于GSH的GPx系统，参与抵抗氧胁迫。

摘要:阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的基因载体。简要介绍了阳离子脂质体的结构特点；着重讨论了阳离子脂质体作为基因载体时介导基因转移的机制以及在转染过程中对基因转染效率产生影响的主要因素。

摘要:14-3-3蛋白家族是一组高度保守的可溶性酸性蛋白质，分子量在28～33kD之间，广泛分布于各种真核生物之中。该蛋白能够特异地结合含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的肽段，参与多种信号转导途径。14-3-3蛋白调节着许多重要细胞生命活动，如：新陈代谢、细胞周期、细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录，该蛋白家族异常与疾病的发生密切相关，尤其是14-3-3蛋白在脑脊液中的分布与一些神经系统疾病密切相关。14-3-3蛋白已成为一些疾病的临床诊断指标，其作为疾病治疗的靶点也在研究之中。主要阐述了14-3-3蛋白的结构、功能、及其在疾病治疗中的应用。

摘要:菌株Arthrobacter sp. AG1能以4000 mg/L的阿特拉津（AT）为唯一碳源、氮源和能源生长。通过设计特异引物从AG1中扩增出阿特拉津氯水解酶基因trzN的全序列，该基因与已报道的trzN基因序列相似性为99%。AG1菌株中含有两个大于100kb的质粒，Southern杂交结果显示trzN和atzB基因均位于其中较大的一个质粒pAG1上。将AG1菌株在LB液体培养基中转接三代后，发现34%的细菌细胞丢失了降解活性，但却未发现丢失质粒，PCR扩增结果表明突变子丢失了trzN基因，但atzB和atzC基因未丢失，说明降解活性的缺失是trzN基因片段从质粒上丢失的结果，表明trzN基因在环境中存在水平转移现象，暗示菌株AG1中的阿特拉津降解基因是基因的水平转移重组的结果。

摘要:RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具，为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用，针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个），构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体，转染MARC-145细胞后，通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体，病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量，细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。

摘要:RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具，为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用，针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个），构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体，转染MARC-145细胞后，通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体，病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量，细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。

摘要:用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid，将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中，获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂，长45bp；3′端长18bp，为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列），以pKD3质粒（含cat）为模板，PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat，即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株，在Red重组酶的作用下，线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物，用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后，Western blot分析未检测到orf60基因的表达。

摘要:以牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）基因组DNA为模板，PCR扩增gG基因，克隆到T载体pMD18-T，经限制性酶切分析及序列测定鉴定正确后，进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG。SDS-PAGE和Western blot分析表明，该基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体两种形式表达，重组蛋白质具有免疫学活性。包涵体蛋白经提纯、变性、复性后，作为包被抗原建立了gG-ELISA诊断方法。应用该方法与进口试剂盒（IDEXX）平行检测380份血清样品，两种方法的符合率为92%（351/380）。对6份病毒分离阳性血清的检测均为阳性，对非相关病原的阳性血清及中监所的阴性血清检测均为阴性，表明所建立的IBRV gG抗体的ELISA检测具有良好的灵敏度与特异性。对1248份奶牛血清样本进行了检测，进口牛群的IBRV抗体阳性率平均为21.7%，湖北本地中国黑白花奶牛的抗体阳性率在不同牧场之间变化很大，范围为0.0%～41.5%。

摘要:对A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的全序列进行优化和人工合成，获得了全长1 287bp，编码429aa的Hc基因。以pTIG-Trx为原核表达载体，实现了Hc在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化，该表达水平可占可溶性全菌总蛋白的36%～53%，经一步亲和层析纯化可获得电泳级纯度的目的蛋白，在常规培养条件下，产量达到30mg/L以上。然后，纯化的重组蛋白Hc免疫小鼠后能够诱导产生高滴度特异性的抗体，也能诱导产生特异性的细胞免疫应答反应。小鼠体内A型肉毒毒素中和试验结果表明免疫组小鼠血清中含高滴度的体内中和抗体。结果表明，利用本实验的原核表达系统不仅能够高水平可溶性地表达A型肉毒毒素受体结合区Hc，而且重组Hc具有良好的免疫原性，可以用于制备治疗性抗毒素和作为亚单位候选疫苗用于预防A型肉毒毒素中毒。

摘要:采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中扩增出IL-18基因并构建真核融合表达载体pPIC9K-IL-18，电激法转化入毕赤酵母GS115，采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株，甲醇诱导表达，应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况，并将表达蛋白用凝胶层析柱纯化后，用MTT法检测其生物学活性。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pIL-18，其表达在72h时达高峰，分泌量可达160mg/L，纯化的重组pIL-18蛋白具有显著的促进淋巴细胞增殖的活性，说明本试验已在毕赤酵母中在国内首次成功表达了具有生物学活性的pIL-18。

摘要:采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中扩增出IL-18基因并构建真核融合表达载体pPIC9K-IL-18，电激法转化入毕赤酵母GS115，采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株，甲醇诱导表达，应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况，并将表达蛋白用凝胶层析柱纯化后，用MTT法检测其生物学活性。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pIL-18，其表达在72h时达高峰，分泌量可达160mg/L，纯化的重组pIL-18蛋白具有显著的促进淋巴细胞增殖的活性，说明本试验已在毕赤酵母中在国内首次成功表达了具有生物学活性的pIL-18。

摘要:为了研究人肠三叶因子（hITF）对肠粘膜的保护作用，利用RT-PCR从肠粘膜中扩增出hITF基因片段，与诱导分泌型毕赤酵母载体pPIC9连接构建了重组质粒pPIC9hITF，重组质粒转化至宿主菌GS115，经过PCR鉴定和转化子发酵筛选，得到一个重组毕赤酵母高产菌株GS115/pPIC9hITF。在5L发酵罐中用基本盐培养基培养重组菌株，添加甲醇诱导表达hITF，离心收集的上清液通过离心交换层析纯化得到hITF。质谱鉴定结果表明纯化的hITF与天然提取产品在N端序列上完全相同。细胞实验和动物实验结果表明重组hITF能够促进细胞迁移，并可以保护肠粘膜免受有害因子的侵袭，保持了较好的生物学活性。

摘要:以八眉猪为研究对象，采用RT-PCR和Western blot方法对猪激素敏感酯酶（HSL）和甘油三酯水解酶（TGH）基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示，HSL基因的mRNA在检测的7种组织中都有表达，其中在脂肪组织表达量较高，中等程度表达于心脏、肝脏、肺、脾和肾脏。TGH基因在7种组织也均有表达，其中肝脏和脂肪组织表达量较高，心脏和肾脏次之，脾脏和肺脏表达量较低。Western blot检测显示，HSL基因在大网膜脂肪和皮下脂肪表达量最高，而在肾脏中没有检测到表达，其他组织中中度表达；TGH基因在大网膜脂肪、皮下脂肪、肝脏、肺脏和脾脏组织中表达，其中在脂肪组织和肝脏组织中表达量最高，而在心脏和肾脏中没有检测到表达。以上结果表明：HSL和TGH基因存在转录后调控，这可能与其在不同组织中的功能差异有关。

摘要:植物基因的表达受启动子的控制，高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面，也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明，GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明，Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明，叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻，在叶和胚乳中活性高于35S启动子，因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。

摘要:利用PCR技术扩增来源于弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)的甘油脱水酶编码基因dhaB以及甘油脱水酶激活因子编码基因dhaG dhaF，将其与1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD串联在温控表达载体pHsh上，构建重组菌E. coli JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析显示，融合表达产物的分子量同核酸序列测定的推导值相符。与未串联甘油脱水酶激活因子编码基因的重组菌E. coli JM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比， 1,3-丙二醇的产量提高了28%。

摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Ⅲ型分泌系统(typeⅢ secretion system，TTSS)是重要的细菌致病因子之一，能够将酶蛋白直接注入到宿主细胞内，导致细胞损害的发生。重点研究了TTSS中的popN基因的功能，通过构建popN^-突变子，发现该突变子在非诱导条件下，能够分泌酶蛋白，显示popN基因编码的蛋白对TTSS蛋白的分泌具有负调控作用。进一步研究发现，popN^-突变子在不同培养基中TTSS的分泌水平存在着显著差异，影响对popN基因的功能的判断。为了解决这一矛盾，从几个方面分析了造成表型差异的可能因素，确定蛋白酶对TTSS分泌蛋白的降解作用，是表型差异存在的主要原因，从而首次系统地阐明popN^--突变子在不同培养基中都具有TTSS组成型表达的表型，对于深入研究TTSS的调控机制具有重要意义。

摘要:LPTS基因是利用定位候选克隆策略克隆的一个新的肝相关候选肿瘤抑制基因。LPTS基因编码一个全长为328氨基酸的蛋白质（LPTS-L），该蛋白具有抑制细胞端粒酶活性的功能。为了进一步研究LPTS-L蛋白的结构与功能，利用DNA重组技术，将LPTS-L的cDNA克隆到表达载体pET-24a中构建重组克隆pET-24-LPTS，并在大肠杆菌BL-21中进行融合表达，获得可溶形式的LPTS-L融合蛋白。采用Ni Sepharose 4B柱亲和层析，可以获得纯度较高的蛋白，但不适合大量制备。通过设计引物去掉了pET-24a载体上的6×His tag将 LPTS-L基因进行了非融合表达，然后采用磷酸纤维素P11阳离子交换层析纯化LPTS-L蛋白，纯度可达到55%。再经Sephadex G-100凝胶过滤，LPTS-L蛋白的纯度可达到80%。Western blot实验显示经纯化后的LPTS-L蛋白可与兔抗GST-LPTS-L的多抗发生特异性结合。采用TRAP法测定蛋白质活性，结果显示纯化得到的LPTS-L蛋白可抑制端粒酶的活性，与采用Ni Sepharose 4B纯化获得的LPTS-L融合蛋白比较，其抑制效率基本一致。因此，所建立的技术可以有效地制备LPTS-L蛋白。

摘要:蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一，因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。 在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上，通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化，得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体，分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32，64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片段的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列注册GenBank，序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达，SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102kD和196.6kD， 与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达，在国内外尚未见报道。在此基础上对pNSR32工程菌进行高密度发酵，建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。

摘要:丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原，然而，该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒，一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C，另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C，分别将重组菌口服接种小鼠，检测小鼠的免疫应答，结果发现：① SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞持续降低，而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞无明显改变；② SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体，加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响，而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③ SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示：携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式（结构以及磷酸化修饰）的HCV核心蛋白，可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题，并具有接种方便，成本低廉等优点，从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。

摘要:通过高精度的双向电泳技术对家蚕末龄幼虫的脂肪体组织进行了研究，采用基质辅助质量飞行时间质谱对其中一些表达量较高的蛋白点进行了鉴定，并利用GPMAW软件结合家蚕基因组预测的蛋白质数据库构建了本地的肽质量指纹图谱数据库，对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。研究发现，经过双向凝胶电泳及其图象分析技术，银染可以分离出722个清晰蛋白点，这些蛋白质主要集中在分子量15～90 kD区域，等电点pH 4～8之间。MALDI-TOF-MS鉴定的41个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰，其中34个蛋白点得到了成功鉴定，其中包括了大量参与代谢的酶类、不同分子量的热激蛋白、重要的血液蛋白30K，Actin3等，这一结果对人们进一步认识家蚕脂肪体提供了有利的帮助。

摘要:来自米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酸酯裂解酶(pectin lyase)一直被用于传统发酵食品的生产，但自然条件下A. oryzae和A. niger的果胶酸酯裂解酶产量较低。通过RT-PCR 的方法，获得不含信号肽的A. oryzae Pel 1 cDNA，将Pel1 cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pel1质粒。pET-28a (+)-pel1转化Turner (DE3) placⅠ细胞，得到转化子pET-28a (+)-pel1-Turner (DE3) placⅠ，表达与6个组氨酸融合的Pel1。进一步对Pel1在E. coli系统中表达的条件进行了研究，在37℃，220 r/min条件下，培养pET-28a (+)-pel1-Turner (DE3) placⅠ细胞，当OD₆₀₀至0.8左右时，用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactop-yranoside (IPTG)进行诱导表达，在15℃和170r/min条件下，继续培养60h后，表达效果最好，产酶可达到400u/mL，是A. oryzae自然条件下产酶量的4000倍，也高于已报道的真菌果胶酸酯裂解酶在真菌体系中重组表达的效果。

摘要:利用氧化还原电极，研究了在厌氧条件下将氧化还原电位值（ORP）控制在不同水平（-50mV、-100mV、-150mV、-230mV）对乙醇发酵过程的影响。试验结果表明，不同的ORP值水平对乙醇得率，甘油形成、有机酸分泌、生物量和菌体死亡率的影响有明显的差异。当ORP为-50mV时的生物量是ORP为-100mV时的1.26倍、ORP为-150mV时的1.86倍、ORP为-230mV时的2.59倍，甘油浓度分别是后三者的1.2倍、1.1倍、1.7倍，而乙醇浓度却分别只有后三者的0.87倍、0.49倍、0.51倍。综合考虑生物量、乙醇浓度、甘油产量、残糖的测定结果，表明将ORP控制在-150mV时对乙醇发酵极为有利。说明可以用ORP电极来精确控制厌氧发酵条件，从而为酵母细胞合理分配代谢流以实现乙醇生产最优化的宏观控制提供了一种有效的手段。

摘要:硅藻itzschia laevis是EPA很好的替代来源。除了对硅藻进行高密度培养外，EPA的产量还能利用除草剂来提高。本文研究了除草剂精喹禾灵对硅藻的生长和产EPA的影响。DMSO作为除草剂的溶剂，会对硅藻的生长造成抑制，DMSO在培养基中的添加量最好不要超过0.2%。除草剂能对硅藻的细胞形态造成损害，随着除草剂浓度的增加，硅藻的产量减低了，但脂质和EPA的含量提高了。当除草剂浓度为0.1mmol/L时，EPA的含量从3.00%增加到3.58%，提高了19.3%，EPA占总脂肪酸的含量也由25.15%提高到了32.88%。实验表明，除草剂精喹禾灵能促进硅藻EPA的积累，因而在筛选过量产生EPA微藻方面有重要用途。

摘要:在维生素C的发酵生产过程中，普通生酮基古龙酸菌S₂（Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶，将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，Q Sepharose High Performance柱层析等过程，从普通生酮基古龙酸菌S₂发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶，并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时，普通生酮基古龙酸菌S₂基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后，与黏粒载体pKC505连接，用包装蛋白进行包装，转染大肠杆菌DH5ɑ，构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）从12 000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719^#。通过检测该基因工程菌的活性，表明K719^#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能，从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达，这为简化VC的生产工艺奠定了基础。