摘要:PRAS40是近几年新发现的Akt作用底物，14-3-3结合蛋白。为确定PRAS40与14-3-3蛋白7种亚基间相互作用关系，利用gateway方法构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒pEG-PRAS40及转录激活质粒pJG-PRAS40，将PRAS40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵蛋白质粒及转录激活质粒共转化酵母细胞EGY48，通过氨基酸营养缺陷生长实验及β-半乳糖苷酶显色反应分析两种蛋白相互作用程度。酶切鉴定证实成功地构建了pEG-PRAS40和pJG-PRAS40质粒，酵母双杂交实验结果显示PRAS40可以和14-3-3亚型tau, beta, zeta及epsilon相结合，epsilon较强，beta和zeta次之，tau较弱。此结果将为深入研究PRAS40与14-3-3蛋白生物学功能及发现药物靶标奠定基础。

摘要:为探明怀槐细胞生长、异黄酮染料木素合成与底物消耗间的关系，建立了怀槐细胞悬浮培养的结构化动力学模型。模型预测分析了胞内外的蔗糖代谢、胞内结构组分变化、胞内中间组分的变化、细胞呼吸损失以及胞内外异黄酮染料木素的合成情况。模型各参数灵敏度的分析表明kM_b1、k_b2 和k_p是最为灵敏的参数，其调节10%时，目标函数变化的最大比例分别达12.8%、4.61%和2.54%，其它参数对目标函数变化的影响均小于0.5%。该模型预测值与实验值具有较好的吻合性。

摘要:通过胞质内注射法将牛和山羊胎儿耳朵成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建同种胚胎和异种胚胎。采用mCR2aa和mSOF分别培养， 然后在mSOF中按不同培养时间添加8mg/mL BSA或者10%FBS，培养前3d和培养3d后添加的补充物质及次序为：(1)BSA+FBS;(2)BSA+BSA; (3)FBS+BSA；(4)FBS+FBS。根据培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率及囊胚细胞数筛选出最好的培养方法。结果：(1)mSOF中培养同种胚胎和异种胚胎的卵裂率，8/16-cell发育率以及囊胚发育率均明显高于在mCR2aa中的培养结果（P<0.05 ）。(2)添加BSA+FBS组的mSOF培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率和囊胚细胞数同种依次为79.8%±7.1%、49.7%±3.5%、21.5%±1.8%和115.2±4.3，异种依次为40.1%±6.3%、29.2%±2.0%、13.4%±2.1%和100.1±3.0，均明显高于其他培养组（P<0.05）。结论：山羊-牛异种克隆胚胎可以用优化的牛胚胎培养体系进行培养。同种胚胎和异种胚胎的最佳培养方法均为前3d用mSOF+BSA培养液，3d后用mSOF+FBS培养液。

摘要:以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99-125脂肪酶，研究了不同的活化剂对壳聚糖表面羟基基团的活化程度，及以活化后壳聚糖为载体采用不同固定化方法对假丝酵母脂肪酶固定效果的影响。结果表明1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺可有效的活化壳聚糖表面羟基，活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联后形成的壳聚糖为良好的脂肪酶固定化载体，其固定脂肪酶的水解活力可高达86.8U/g。此外，还对影响固定化进程中的各种因素进行了研究，确定最优条件，比较了固定化前后酶的热稳定性、有机溶剂稳定性及最适反应温度。并考察了该固定化脂肪酶催化合成棕榈酸十六酯的操作稳定性，结果表明，连续反应16批之后棕榈酸十六酯的转化率仍能达到85%以上。

摘要:应用基因组改组技术快速提高扩展青霉碱性脂肪酶的产量。采用经过多代诱变的碱性脂肪酶产生菌扩展青霉(Penicillium expansum)FS8486以及分离自新疆火焰山口土样的溜曲霉（Aspergillus tamarii）FS-132作为出发菌株，经过两轮基因组改组，得到数株优良子代。其中一株酶活较出发菌株FS8486提高317%。对亲本与子代菌株的形态型、RAPD（随机扩增多态性DNA）多态性和脂肪酸组成分析初步确定筛选获得的菌株为亲本的改组子代。首次将基因组改组技术成功应用于真核微生物基因组改造，短期内使目标代谢产物获得提高，这对于在真核微生物育种中进一步推广该技术具有重要意义。

摘要:利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶（PEL）基因进行体外定点突变，构建了K55R与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pAO815-ep8-K55R。将该质粒电转化引入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，进行异源表达。实验结果表明：该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达，得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS。其表达量为508u/mL,分别约为野生型脂肪酶PEL-GS（627u/mL）的81％，随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS（924u/mL）的55%；其比活力为2309.1u/mg,与随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS和野生型脂肪酶PEL-GS的相仿。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的最适作用温度为37℃,与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS一致；其T_m值为41.0℃，比野生型脂肪酶PEL-GS提高了2.3℃，比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS提高了0.8℃。表明叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的热稳定性有了进一步的提高。

摘要:内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeonensis）SS02，是一株能强烈抑制玉米纹枯菌（Rhizoctonia cerealis）、白色念珠菌 (Candidal vaginitis)等病害真菌的拮抗菌株。SS02菌株培养液经硫酸铵分级盐析，Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白，命名为SD22。蛋白电泳分析结果表明，此蛋白分子量为56000，等电点为6.4。此蛋白对热和紫外线稳定，对蛋白酶部分敏感。纯化后的SD22对玉米纹枯菌(Rhizoctonia cerealis)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、苹果轮纹病菌（Physalospora piricala）、绿色木霉(Trichodema viride)、绿色粘帚霉（Gliocladium viride）、弯孢霉菌(Curvularia leaf spot)、镰刀霉菌(Fusarium sp.)、赤霉菌(Fusarium head blight)、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌(Candidal vaginitis）、冬瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum Schl.emend.Snyder & Hanse）等菌有很强的抑制作用。

摘要:以葡萄糖为底物,以经加热预处理并活化过的厌氧污泥为种泥，研究了初始pH值对产氢产乙酸/耗氢产乙酸两段耦合工艺厌氧发酵定向生产乙酸的影响。实验考察了7个初始pH值（5、6、7、8、9、10、11）条件下的底物降解、产物产生和发酵过程pH值的变化。结果表明:产氢产乙酸段初始pH值的变化不仅影响本阶段产酸，而且影响耗氢产乙酸段产酸。初始pH=5时主要进行乙醇型发酵；pH=6和7时主要进行丁酸型发酵；pH=8时混合酸型发酵类型逐渐占优势，pH=8～11时均以乙酸为主要产物,耦合系统生产乙酸最优初始pH值为10。在初始pH=8～11范围内，产氢产乙酸段初期的乙醇浓度一般较高，但到后期因乙醇被微生物进一步代谢转化成乙酸而使其含量下降。

摘要:以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质，合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原（CHO-HBsAg）的不同间臂（3C、8C和10C）和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性，从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原（CHO-HBsAg）的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果，分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下，CHO-HBsAg的收率可以接近100%，纯化倍数达到60。

摘要:整合了乙肝表面抗原嵌合基因SS1和SS2的毕赤酵母工程菌株GS115-SS1S2经高密度发酵培养，甲醇诱导，抗原表达量达到300～600mg/L发酵液。SS1S2抗原经细胞破碎、硅胶吸附、疏水层析和凝胶过滤纯化，纯度达99%以上，每升培养物可收获纯化抗原82mg。纯化的SS1S2抗原经Al(OH)₃吸附，在NIH小鼠中进行免疫效果评价。三组NIH雌性小鼠，分别腹腔接种2.5μg、0.625μg和0.156μg SS1S2疫苗或商品化的单S疫苗。部分小鼠在30天时采血，测定各疫苗组的ED₅₀值。在SS1S2疫苗组，前S1、前S2和S抗原的ED₅₀值分别为0.46、0.29和0.84μg，而S疫苗组S抗原的ED₅₀为0.99μg。另一部分小鼠分别在7天和14天时采血，考察抗体阳转率与时间的关系。SS1S2疫苗前S1、前S2抗体阳转率在7d和14d时比S抗体的阳转率为高，提示前S抗体出现的时间较早。上述结果显示SS1S2疫苗比单S疫苗具有更好的免疫原性。

摘要:以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO₄制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物，研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比，配合物在1100cm^－1处出现了一新的红外吸收峰，说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用；配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比，在290℃和375℃的吸热峰消失了，确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用；配合物核磁核磁共振图中3.5～3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失，表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的羟基氧；从配合物的原子力显微形貌相图可见数个L-羟脯氨酸围绕Zn(Ⅱ)形成的配合结构。透析实验结果证实L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)配合的比例为4∶1（mol/mol）。上述测定和表征表明所形成配合物的分子式为Zn(Hyp)₄·H₂O。（Hyp）₄-Zn(Ⅱ)配合物抑制Zn(Ⅱ)产生的羟基自由基，抑制百分比为75.5%，其总抗氧化能力为80.167u/mL，抗超氧阴离子活力为53.19u/mL。

摘要:探索一种新的快捷有效DNA免疫制备单克隆抗体的方法，辅助实现构建高通量无蛋白纯化体系单克隆抗体制备和筛选。分别通过“重叠PCR”和“无模板PCR”在pVAX1真核载体中分别引入IL-2信号肽、IgG kappa链信号肽构建分泌型真核表达载体，将代表抗原基因的profilin 1基因克隆到经改造带有信号肽基因的表达载体上，构建重组质粒pVAX-IL2-prof1和pVAX-Igκ-prof1，单次脾内注射重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合、ELISA筛选，获得两株抗profilin 1的单克隆抗体。单抗亚型分别为IgM和IgG3。单次脾内质粒DNA免疫便捷有效，是制备单克隆抗体的有效方法。

摘要:克隆测序短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）木聚糖酶基因，在同源建模所得三维结构的基础上寻找底物结合可能的活性口袋，用计算机模拟其与底物木聚糖的对接，预测酶与催化反应过程的关键氨基酸残基。所得的信息对木聚糖酶的定向改造有重要意义。

摘要:原核表达的IBDV Gx-VP5蛋白经纯化后免疫8周龄的BALB/c雌性小鼠，三次基础免疫后，融合前加强免疫，取脾细胞在PEG（MW1500）的作用下与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，经过三次亚克隆筛选，获得稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞，分别命名为4B4、6D12、3E8，以三株杂交瘤细胞制备的腹水ELISA效价分别为5×10⁴、3.5×10⁴、3×10⁴，特异性实验表明三株单抗能与IBDV Gt株反应。以单抗介导的间接免疫荧光检测表达Gt-VP5的Vero E6细胞，可以见到特异的荧光，能做为特异性的检测VP5蛋白的工具，为今后IBDV VP5蛋白的研究打下基础。

摘要:DNA重组酶FLP存在于酵母2μ质粒上，能识别34bp的FRT位点，并根据2个FRT位点的相对方向完成位点间DNA序列的交换、重组、删除与逆转，在现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发中具有广泛应用。构建了在原核大肠杆菌中高效表达FLP重组酶的表达载体pQE32-flpe并建立起相应的原核高效表达体系，在原核细菌大肠杆菌M15菌株中实现FLP酶蛋白的高效表达，同时建立了相应的纯化方法。纯化时先用硫酸铵沉淀法富集FLP酶蛋白，经透析脱盐后再用镍离子鳌合微柱（0.5～1.0mL）亲合层析梯度洗脱的方法获得纯化的FLP酶蛋白。通过构建含有2个方向相同的FRT序列位点的质粒pUC18-FRT-gfp-FRT和含有1个FRT位点的表达载体pET30a-FRT，并分别以其为底物来检测FLP重组酶的删除、交换与重组功能的活性。结果表明，该方法不仅能有效表达FLP酶蛋白，并能行之有效地纯化FLP酶蛋白，以及检测纯化的FLP酶蛋白对DNA序列的删除、重组与交换功能。该方法简单易行并能获得有活性的FLP酶蛋白，为深入研究其机理以及研发相应的DNA重组技术提供重要参考。

摘要:通过PCR从鲁西黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因，并插入到pET32a+中, 构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α，进行测序和诱导表达。测序结果表明，鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析，表达出40kD的融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化，纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×10⁵u/mg。重组牛IFN-α（rBoIFN-α）对牛轮状病毒(BRV) 有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×10⁵u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2，并实现了高效表达，获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物，为重组牛干扰素的开发奠定了基础。

摘要:以苦瓜籽为材料，研究了聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白的方法及影响因素。等电点沉淀试验表明，柠檬酸、盐酸分别调节苦瓜种仁粗提液pH至6.0、4.0时，各有14.62%和32.49%的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸的等电点沉淀作用呈现阶段性特点，pH 6.0和4.0时分别有26.17%和38.72%的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸、盐酸和柠檬酸处理的1mL苦瓜种仁粗提液（pH 4.0），1%PAA选择性沉淀碱性蛋白（等电点pI为8.65～9.30）的最佳用量分别为100μL、120μL和100μL。醋酸调节苦瓜种仁粗提液pH分别至5.0、4.0和3.0，等电点沉淀后的上清液用PAA沉淀碱性蛋白，当PAA（1%）用量为160μL/mL提取液时，pH5.0和3.0样液分别有33.77%和43.56%蛋白质被沉淀；当PAA用量为120μL/mL提取液时，pH 4.0样液中30.83%蛋白质被沉淀。PAA-蛋白质复合物溶解于碱性溶液（pH＞9.0），当溶液NaCl浓度为3.0%时，溶液蛋白质浓度最高。PAA选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经Sephadex G-75柱层析分离，分别在175min和300min出现主峰Ⅰ和Ⅱ。SDS-PAGE和IEF分析表明主峰Ⅰ的分子量约为30kD，pI值约为9.5，主峰Ⅱ的分子量约为10kD，pI值约为9.3。

摘要:同甲壳素和壳聚糖这种生物大分子相比，壳寡糖具有许多独特的功能性质，如水溶性、保湿性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性等。以数均分子量为5000的壳寡糖作为研究模型，根据凝胶电泳和紫外光谱分析，提出纳米级壳寡糖与pEGFPC-1质粒能通过静电结合或物理包裹形成复合物从而对DNA进行保护，同时证明形成壳寡糖/DNA复合物后，壳寡糖能够极大地提高DNA的贮存稳定性和结构稳定性；而DNase I酶解实验也显示纳米级壳寡糖在合适比例下DNA有良好的保护作用，使其不被DNase I降解，证明了纳米级壳寡糖应用于基因治疗载体的可行性与安全性。

摘要:面包酵母是一类用来提高面包质量的重要添加剂。目前，不同国家主要采用分批培养、补料分批培养或连续培养的方式来生产面包酵母。酿酒酵母是用来发酵面团中淀粉的理想微生物，除了提升食品香味，增加口感之外，这一发酵过程可以产生多种维生素和蛋白质。用于生产酵母生物量的主要成分包括各种碳源，如甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜等。由于甜菜糖蜜可用于高产率地生产乙醇，加之其带来的生物环境污染和废水处理问题，因此需要考虑用其他糖类来生产面包酵母。其中一个代替性糖源是枣。由于各种原因，伊朗每年都浪费大量的枣。研究了用枣作为培养基碳源的可行性。将废枣榨成汁，然后研究了酵母的产量和生长速率。结果发现，在pH3.4，温度30℃，通风量1.4vvm，发酵罐搅拌速度500r/min时，酵母对底物的产率接近50%。

摘要:雄性生殖干细胞（male germ stem cells, mGSCs）来源于原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)，且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞，2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs，经流式细胞仪检测，CD9阳性细胞的比例达到 95.8%。原代与支持细胞共培养，出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株，且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析，结果显示：SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性；短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞；定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament，NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明：20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干（embryonic stem, ES）细胞。

摘要:为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果，我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k₂tPA)、扩增基因（dhfr）、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因（neo），且neo基因的表达经过系统的弱化，确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr^－细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆，并对阳性克隆进行系统分析，筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆，此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点（Hot spot）区域，从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统（FLP-FRT）将外源基因定点整合到Hot spot区域，以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k₂tPA的高表达，表达量达到17.1μg/10⁶cell·24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认，建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。