摘要:辅酶再生是实现氧化还原酶催化反应的必需步骤 ,是关系到氧化还原酶工业应用的关键。通过介绍酶法再生和电化学方法再生的机理 ,分别总结了有关还原态辅酶和氧化态辅酶再生方法的研究现状 ,包括酶学再生过程中涉及到的酶、自由酶和整体细胞再生及其反应器的设计 ;以及电化学再生中电极修饰及中间体选择等。并提出了辅酶再生研究的潜在发展方向

摘要:农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一 ,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆 ,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低 ,尚需深入研究。农杆菌菌株、大豆基因型、组织培养条件、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式都会影响大豆转化的效率。概述了近年来根癌农杆菌介导的大豆遗传转化的一些重要成果 ,以及转化过程中大豆的易感性与农杆菌的转化能力、乙酰丁香酮促进vir基因活化、转化的受体系统和巯基混合物减轻受体材料的褐化、提高T DNA的转移效率等几个重要因素的研究进展 ,并介绍了转化中常用的几个筛选标记基因 (nptⅡ、hpt、bar基因和突变的ahas基因 )及通过共转化法去除标记基因的方法 ,同时对今后研究的重点进行了讨论.

摘要:温度非对称交互PCR(TAIL PCR)技术已广泛应用于从多种生物体系克隆侧翼于已知序列的DNA片段的分子操作中 ,并极大地促进了反向遗传学研究。但是 ,可能由于不同物种间基因组大小和序列存在显著差异 ,在采用该技术进行转座元件Ds水稻插入突变体鉴定过程中 ,常因TAIL PCR反应的稳定性差而影响突变体筛选效率。有鉴于此 ,根据Ds核苷酸序列设计了分别对应或互补于Ds插入元件两端长度不同的 12个特异引物组成 32个组合 ,在大量预试验基础上与 6个不同简并性 (32～256 )的随机简并引物分别组合进行TAIL PCR反应 ,较系统地研究了引物特性对以水稻基因组DNA为模板的TAIL PCR反应效率的影响。结果发现 ,第一反应采用长序列特异引物(36～ 4 0mer)可显著提高扩增特异性 ,随机简并引物的简并度对反应的影响显著。还选择出两个适于从水稻Ds插入突变体基因组高效扩增出Ds插入侧翼片段的最优特异引物组合和最适简并引物。应用本研究结果可显著地提高TAIL PCR技术筛选水稻插入突变体的效率

摘要:利用PCR技术克隆人乳头瘤病毒HPV-16L1蛋白编码基因 ,将其重组于pUCmT和pBI12 1中 ,构建含HPV 16L1基因的植物双元表达载体pBI L1,L1基因由CaMV 35S启动子控制表达。采用叶盘共培育法经根瘤农杆菌介导转化烟草 (NicotianatobacumL .) ,获得HPV-16L1转基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析 ,HPV 16L1基因整合到烟草基因组中 ;Westernblot和ELISA分析检测显示转基因烟草叶片蛋白可与HPV 16L1单克隆抗体特异性反应 ,且定位于 5 5kD处 ,其最高表达量占烟草叶片总可溶蛋白的0.076 %。小鼠红细胞凝集试验 (HA)及小鼠红细胞凝集抑制试验 (HAI)显示转基因烟草叶片蛋白可引起小鼠红细胞凝集。结果表明已成功地构建了HPV-16L1的植物双元表达载体 ,并证实了利用转基因烟草植物能够表达出HPV-16L1蛋白 ,所表达的L1蛋白具有良好的抗原性并具有介导小鼠红细胞凝集的生物活性.

摘要:LEA蛋白 (late embryogenesis abundantprotein) ,是指胚胎发生后期种子中大量积累的一类蛋白质 ,它广泛存在于高等植物中 ,且受发育阶段、脱落酸 (ABA)和脱水信号的调节 ,其中第 3组LEA蛋白与作物耐逆性密切相关。通过RT PCR从小麦中克隆了一个新的第 3组LEA蛋白基因 ,TaLEA3。该蛋白主要定位于细胞质。TaLEA3的表达受高盐、低温和外源激素ABA的诱导 ,根中表达量一般高于叶中 ,且在不同胁迫下该基因表达模式存在差异。在所检测的一对同核异质小麦品种中 ,该基因的表达与耐旱性呈正相关。TaLEA3在酵母中过量表达 ,改善了酵母在离子和渗透胁迫下的生长状态或提高了存活率.

摘要:植物转基因的表达在一定程度上受其所在宿主基因组整合位置的影响 ,通常称为转基因位置效应。利用农杆菌介导法将抗白叶枯病基因Xa21转入水稻品种明恢 63,获得带有不同转基因拷贝数的转化体。对转化体连续自交 ,并对转基因整合位点进行鉴定和筛选 ,获得了明恢63遗传背景下整合在不同染色体位点的单拷贝Xa21转基因纯合系。这些转基因系除一个单拷贝转基因整合位点外 ,在基因组水平上是等同的 ,构成了近等转基因系。经分子杂交和遗传定位验证 ,共获得明恢63遗传背景下的6个近等转基因系。对这些近等转基因系进行抗白叶枯病分析,显示出几乎相同的高抗水平。这表明整合位点对Xa21的抗性没有影响 ,不存在转基因位置效应.

摘要:Chi4 4是烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)YJ-407产生的一种胞外几丁质酶。通过用真菌几丁质酶保守氨基酸序列与Chi44的N-端序列检索烟曲霉部分基因组序列数据库 ,获得一个编号为contig555的烟曲霉基因组序列 ,可能包含烟曲霉几丁质酶的基因。根据检索结果用RT-PCR方法从烟曲霉YJ-407中克隆到1.4kb的cDNA片段 ,该cDNA的ORF编码一个395个氨基酸的蛋白 ,分子量为43.6kD。对其推导氨基酸序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源 ,而且活性中心与人巨噬细胞几丁质酶高度同源。该cDNA已在E .coli与PichiapastorisGS115中获得表达 ,分别获得 43kD和44kD的重组蛋白 ,两种重组蛋白均有几丁质酶活性。与野生酶相比 ,大肠杆菌表达的43kD重组酶及Pichia酵母表达的44kD重组酶稳定性下降 ,说明Chi44的糖基化修饰可稳定酶蛋白.

摘要:以转高等植物ALD和TPI基因的鱼腥藻 7120为对象 ,研究了ALD和TPI两个酶表达量对细胞光合固碳效率的影响。考察了初始pH、NaHCO₃浓度和CO₂浓度对转基因藻和野生藻生长、光合活性及无机碳亲和力的影响。结果表明 ,转基因藻在较高碳源浓度下 ,其生长速率和光合放氧活性比野生藻有显著的提高 ,并且可以比野生藻耐受更高的pH。在含有2%CO₂的空气中 ,转基因藻对外源无机碳的亲和力比野生藻提高了4.06倍.

摘要:通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.

摘要:白细胞介素 4受体 (IL-4R)特异地存在于多种肿瘤细胞表面 ,这为某些肿瘤的治疗提供了一个靶向标记。在以前的研究中 ,人白细胞介素-4(Hil-4)与白喉毒素 (DT)的融合蛋白 (DT4H)被构建 ,且它对某些肿瘤细胞系的高毒性得到了证明。但是 ,由于毒素部分的强免疫原性 ,它可以诱导人体的免疫反应。该研究中我们构建了白细胞介素 4与绿脓杆菌外毒素 (PE) 253～608aa的融合蛋白 ,并在其N端添加了 6×His标记方便纯化 ,在其C端添加了KDEL提高毒性。为了改善与IL-4R的亲和力我们将IL-4进行了环式重组 ,构建的融合毒素 ,H404K ,经DEAE$CSepharoseFastFlow及Ni-NTA纯化后 ,纯度达 90 %。纯化后的H404K与DT4H相似 ,对U251高度敏感 ,对MCF7及HepG2中度敏感 ,且我们首次证实该毒性不会被兔抗白喉毒素的多克隆抗体所抑制。这些研究表明 ,H404K与DT4H可以以一种互为替代的方式用于某些恶性肿瘤的治疗

摘要:清道夫受体A (SR-A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白 (Mldl)形成泡沫细胞 ,继而形成动脉粥样硬化病灶 ,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用 ,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR A胞外部分 (shSR AII)的Cdna ,将其克隆至毕赤酵母 (Pichiapastoris)分泌表达载体Ppic9k构建重组表达质粒P9k shSR AII。将重组表达质粒线性化后 ,电转化毕赤酵母GS115 ,用原位双膜法筛选获得高表达shSR AII的重组菌株GS115 P9k shSR AII。重组菌株经 1%甲醇诱导 ,SDS PAGE、Westernblot分析表明shSR AII获得了分泌表达。Ligandbindingblot结果表明表达的shSR AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成 ,为以shSR AII为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础.

摘要:从GenBank中查找出人APRIL蛋白 (编号:075888)序列 ,取其部分胞外 (sAPRIL)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因 ,经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为sAPRIL。克隆载体经酶切后构建了表达载体 ,并在大肠杆菌中表达 ,纯化蛋白后进行细胞学实验表明sAPRIL有明显刺激肿瘤细胞增殖的作用 ,为深入研究sAPRIL的功能奠定了基础

摘要:化学合成人纤溶蛋白酶原K5 (pK5 )的编码基因并克隆到毕赤氏酵母表达系统的分泌型载体pPIC9K上 ,将重组质粒经BglⅡ单酶切后电转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选出对G4 18有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导后 ,用 15 %SDS PAGE检测发酵上清液 ,表明有重组蛋白pK5的高表达。经CM-Sepherose离子交换柱和Superdex 75分子筛层析两步分离纯化 ,获得了纯度达到 98%的rpK5。用MTT方法检测的结果表明 ,纯化的rpK5可显著地抑制人血管内皮细胞的生长

摘要:抗HBsAgFab抗体被认为在预防和治疗HBV引起的肝病中具有重要的作用。为了建立稳定的、适于生产应用的重组人源性抗HBsAgFab抗体的纯化工艺 ,本实验对不同纯化方法进行了比较研究。比较了抗Fab抗体亲和层析、ScFv单克隆抗体亲和层析和离子交换层析等 3套纯化工艺在酵母发酵生产的重组人源性抗HBsAgFab抗体纯化中的效率。结果显示 ,抗Fab抗体亲和层析柱纯化酵母表达的重组Fab ,纯度为 96.8% ,但回收率偏低 ,只有30%～40%。ScFv单克隆抗体亲和层析纯化的重组Fab ,纯度为97.5% ,回收率达75%～85%。该工艺能很好的适应较小规模的生产应用。离子交换层析纯化的重组Fab ,纯度为 97% ,回收率为 75%～85%。该工艺能很好的适应较大规模的生产应用。以上结果表明 ,应用ScFv单克隆抗体亲和层析和离子交换层析纯化技术均能很好的纯化出重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,这两种纯化工艺不仅大大节约纯化成本 ,且纯化效率和回收率有很大提高。为重组Fab抗体的工业化生产应用奠定了基础.

摘要:带有GFP基因的ESD3细胞系是一个良好的可以用于研究体内和体外细胞分化和组织产生的模型。用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细胞系中 ,在荧光显微镜下以 488nm激发光检查阳性克隆 ,并进行初步扩增。经G4 18筛选后 ,机械挑取EGFP强阳性表达的克隆 ,并在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上 ,在无选择性压力的条件下 ,进一步扩大培养 ,获得纯化的转染细胞系。20代以后 ,转染细胞仍然表达绿色荧光蛋白。PCR检测表明 8代和 18代转染细胞均携带有GFP标志基因。对稳定表达EGFP的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚体和畸胎瘤形成的检测 ,证明这些细胞具有干细胞的特征。经拟胚体 ,可进一步分化成具有搏动能力的心肌细胞 ,分化百分率为 30 %～ 4 0 % ,较未转染细胞 60 %～ 70 %的分化率低 ,造成低分化率机制还不清楚。这些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光 ,免疫组化染色显示具心肌细胞特异的cTnT分子标志。该EGFP标记的干细胞系带有可进行原位、实时检测的绿色荧光 ,可应用于细胞移植和体内分化的研究.

摘要:研究大鼠L PGDS在毕氏酵母中的表达 ,探讨L PGDS在大鼠精子中的分布。以大鼠睾丸mRNA为模板 ,经逆转录获得L PGDS全长和成熟基因片段。将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115 ,筛选mut⁺表型 ,经甲醇诱导实现L PGDS的分泌表达。用SDS-PAGE分析L-PGDS的分子量 ,用PAS反应鉴定糖链 ,用免疫组织化学法研究L PGDS的分布 ,用Westernblot分析重组L-PGDS与精浆中L-PGDS。筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS-PAGE分析表明 ,产物分子量约为27kD ;L-PGDS主要分布在精子的头部以及尾部的上段

摘要:鼠源单克隆抗体MA18/7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18/7的小分子抗体 ,将MA18/7的重链可变区基因(V_H)和轻链可变区(V_L)基因分别克隆到原核表达载体pTO-T7进行原核表达。结果V_H和V_L均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度>90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,V_H 或V_L 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18/7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成.

摘要:高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 1000多个转化子依次在含不同G₄₁₈浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 24～ 28h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7.5 ,菌体密度OD₆₀₀ =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 160mg/L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 ,为大批量制备奠定了基础.

摘要:对一株啤酒酵母青②进行紫外线诱变 ,在蛋氨酸浓度为 15g L的耐性平板上筛选获得一株A₂₇菌株。为使A₂₇菌株的蛋氨酸耐性特征稳定遗传 ,在 11℃、稀释率为0.035h^-1 的条件下对A₂₇菌株进行高浓度蛋氨酸 (20g/L)连续驯养 ,然后分离得到一株M^I₄菌。在锥形瓶中连续发酵5代后 ,与A₂₇菌株相比 ,M^I₄ 菌株发酵液中GSH浓度高44% ,TBA值低 24% ,主酵液RSV值高 77% ,且遗传稳定性明显提高 :连续传代 5次后 ,M^I₄ 菌株胞内GSH含量基本不变 ,而A₂₇菌则下降了22%。在相同的糖化和发酵工艺条件下 ,对优选株M^I₄和出发株啤酒酵母青②进行 1m3发酵罐中试。与出发株青②相比 ,两者的总高级醇与酯量几乎不变 ,常规指标没有显著差别 ,品尝风味也基本一致。但M^I₄菌株发酵液中GSH浓度提高了 30% ,TBA值降低了19% ,成品啤酒的RSV值则提高了92% ,表明优选株M^I₄是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母 ,能够提高啤酒的风味稳定性.

摘要:对假丝酵母99-125脂肪酶的发酵工艺条件进行了一系列研究。选择了合适的培养基成分并进行优化 ,获得了最优的摇瓶培养基配方 (% ,W/V) :豆油 4.0 ,全脂豆粉 4.0 ,K₂HPO₄0.1,KH₂PO₄ 0.1。产酶水平能达到 5000IU/mL。在 30L发酵罐上进行初步放大实验 ,其产酶水平能达到 8100IU/mL。在1m³发酵罐上进行中试放大 ,产酶水平可达到 8000IU/mL。

摘要:实验将自絮凝颗粒酵母培养于同时添加脂肪酸 (0.6mmol/L)和酒精 (6 %～ 9% ,V/V)条件下以考察其细胞膜磷脂脂肪酸组成的变化。与单独添加棕榈酸相比 ,同时添加酒精引起细胞膜磷脂棕榈酸含量明显增加 ,伴随 9十四碳烯酸、棕榈油酸和油酸含量明显减少 ;与单独添加亚油酸相比 ,同时添加酒精未引起细胞膜磷脂亚油酸含量明显变化 ,但引起油酸含量明显增加 ,伴随 9 十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少 ;与单独添加亚麻酸相比 ,同时添加酒精引起细胞膜磷脂亚麻酸含量减少 ,伴随油酸含量显著增加 ,同时 9 十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少。存活率实验证实 ,上述变化是菌体对酒精刺激的适应性响应 ,因为 ,与培养于仅添加脂肪酸条件下的菌体相比 ,培养于同时添加酒精条件下的菌体耐酒精能力明显提高。研究表明 ,棕榈酸和油酸都可通过加强细胞膜渗透屏障而提高菌体的耐酒精能力 ,这是饱和脂肪酸 (SFA)与不饱和脂肪酸 (UFA)可提高同一菌株耐酒精能力的新的实验现象 ,揭示UFA与SFA在影响酵母菌耐酒精能力的机制上存在共同的作用方式

摘要:近年来研究发现人胰岛素原C肽 (简称C肽 )有多种生物活性 ,在治疗糖尿病的并发症中有潜在的应用价值。在前期研究中 ,完成了多拷贝串联C肽基因的构建和融合表达 ,在原核中获得了高表达。用发酵的方法大规模表达融合蛋白C肽 (FCP) ,由Ni-NTA柱亲和纯化获得的蛋白经胰蛋白酶和羧肽酶B的酶解及RP HPLC分离获得了纯度超过 95 %的C肽单体。细胞活性研究显示它对U2 5 1、2 93细胞的生长具有一定的促进作用

摘要:微生物发酵是一个涉及不同尺度的互相关联的复杂生物系统的过程 ,将重组毕赤酵母表达工程植酸酶过渡相的在线和离线参数进行了相关分析研究。通过对发酵过程的在线细胞代谢生理参数 (OUR)和环境参数 (DO)的变化进行相关分析表明 :甘油和葡萄糖碳源对AOX合成的阻遏强度不同 ,葡萄糖的阻遏性明显强于甘油 ,相对于醇氧化酶启动子 ,葡萄糖为强阻遏性底物。根据甲醇代谢途径关键酶酶活性变化 ,推测出各代谢途径流量分布的变化 ,即甲醇诱导后糖酵解途径和三羧酸循环途径代谢流比例下降 ,而磷酸戊糖途径中代谢流通量上升 ,甲醇完全氧化代谢流成为主要代谢流 ,与过渡相在线参数pH、OUR(CER)和RQ等相关分析的甲醇代谢途径的变化结果一致。此外 ,建立了生产过程在线控制与分析的标准 :当OUR和CER逐渐增大 ,则可判断甲醇已被利用和启动子已被甲醇成功诱导 ,即工程植酸酶开始启动表达.

摘要:人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI_1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI_1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI_1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI_1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI_1-161 表达为TFPI1_1-161 (2 4kD)和TFPI_1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI_1-161(2.4kD)和1.8gTFPI_1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测，重组FTPI_1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI_1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。

摘要:将层析技术与冷乙醇工艺相结合用于人血清白蛋白的纯化 ,对各过程所采用的层析介质及层析条件进行了探索 ,得到了一条从人血浆中制备血清白蛋白的新路线 :将一步冷乙醇沉淀后的血浆上清进行脱盐除乙醇 ,用阳离子交换介质CMSepharoseFF以透过式层析的模式吸附非白蛋白组分 ,最后选用ButylSepharoseFF一步疏水层析后所得样品经SDS-PAGE银染显示一条单带 ,分析其纯度大于 99% ,计算工艺收率为 81.2%。与传统冷乙醇工艺相比较 ,该工艺最终样品纯度更高 ,且层析可以在常温下操作 ,易实现自动化控制.

摘要:猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体Psfv1cs中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS-Cap分别转染BHK-21细胞和293T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2 ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 ,该重组质粒能诱导小鼠产生特异性抗体.

摘要:戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率，即比酶活看，pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。

摘要:为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础.

摘要:在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提 ,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上 ,构建了含有ILTVgB基因和新城疫病毒 (NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F ,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维 (CEF)细胞后 ,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒 (rFPV-gB-F) ,并进行了 6轮蚀斑纯化。Western blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTVgB基因和NDVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。

摘要:从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。

摘要:本研究采用 30L自动控制发酵罐研究了重组杀菌肽 X工程菌的基本发酵条件。经 12h发酵培养 ,发酵培养基中氨苄青霉素浓度为 0和 100μg/mL时 ,包涵体得率基本一致 ,干重分别为1.24和1.20g L ;控制溶氧为 20%～30%和溶氧自然变化 (转速分别为 250和150r/min)的条件下 ,包涵体得率有较大差异 ,干重分别为0.05、0.71和1.24g L。在较优化的发酵条件下 ,目的融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 45%～50%。

摘要:层析是蛋白质纯化的关键技术之一 ,作为层析技术的核心———层析介质一直以来是层析技术研究的一个热点。近年来 ,越来越多的新型层析介质被开发出来 ,如粒度均匀的交联多糖、人工合成的大孔聚合物、触角型吸附剂、软胶包裹在硬胶表面等介质。主要介绍应用较为广泛的IEC和HIC介质的组成、特性及其在蛋白质纯化中的应用 ,还研究了与HIC技术相关的两种新技术 :亲硫层析和疏水电荷诱导层析 (HCIC) ,重点介绍了HCIC的介质及其应用 ,同时也讨论了在蛋白质纯化中应用的三相纯化策略 (富集、中间纯化和精制 )。结合我国的实际情况 ,就当前蛋白质纯化的离子交换和疏水层析介质面临的挑战和未来的发展进行讨论并提出了建议