摘要:经过近几十年来广泛而深入的研究，蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。1在已研究过的蛋白质中，大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠，这与折叠能量景观学说是一致的。2正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）折叠中所起的重要作用并非相互排斥，因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需，与控制肽链折叠无直接关系。3根据对BPTI的研究，二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用，既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明，天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成，更具有普遍意义。4在氧化重折叠的早期，二硫键的形成基本上是一个随机过程，随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外，在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述，在折叠的后期，二硫键的形成决定于折叠中间体的构象，类天然、有柔性的结构有利于天然二硫键形成和正确折叠，具有这类结构的分子为有效的折叠中间体，最终都能转变为天然产物；而无效折叠中间体往往具有稳定的结构，使巯基、二硫键内埋妨碍二硫键重排，并因能垒的障碍不利于进一步折叠。因此，降低无效折叠中间体的稳定性使之转变为有效折叠中间体是提高含二硫键蛋白质复性率的一条基本原则，实验证明，碱性pH、低温、降低蛋白质稳定性的试剂、蛋白质二硫键异构酶、改变蛋白质一级结构是实现这一原则的有效手段。此外，这里还就氧化重折叠的基础和应用研究的前景进行了讨论。

摘要:近年来，不断有新的哺乳动物和两栖类动物被成功克隆，但这并不能掩盖克隆效率过低和克隆动物异常的现实，为了解决这一问题，人们对克隆机理进行了大量研究。高度分化的体细胞核在去核的卵质中去分化和再程序化不完全是导致动物克隆失败的主要原因，而去分化和再程序化不完全主要是由于基因组去甲基化不充分和过早再甲基化引起克隆胚中甲基化水平比正常胚中偏高所至，这可引起一些重要基因的异常表达，尤其是印记基因。这些机制的研究对提高克隆效率有着重要意义。

摘要:为了探索同源片段长度与糖多孢红霉菌染色体同源重组率的关系，化学合成或用重叠PCR合成带有突变位点、在突变位点两侧长度为（26bp+27bp）、（500bp+576bp）和（1908bp+1749bp）的同源序列，克隆于糖多孢红霉菌同源重组载体pWHM3后，分别构建了pWHM1113、 pWHM1116和 pWHM1119质粒。以PEG介导转化糖多孢红霉菌A226原生质体，3个质粒分别获得每皿30个、69个和170个转化子，但pWHM1113质粒不能与染色体有效整合，pWHM1116质粒与染色体整合率为转化子的2%，而pWHM1119质粒与染色体整合率达到转化子的19%。 pWHM1116和 pWHM1119质粒均可进行有效的染色体二次重组，将突变位位点引入染色体。因此，同源片段长度为（500bp+576bp）或更长时，可与糖多孢红霉菌染色体进行有效的单重组和双重组。

摘要:在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因，亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中，线性化后转化P. pastorisGS115；转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后，甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现，重组HBscFv可以在α因子的引导下，分泌至培养基中，产量为80mg/L；分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性，活性总量在诱导培养72h后达最高峰，在诱导培养后期，HBscFv活性下降；PAS糖显色结果表明，酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。

摘要:将含新城疫病毒（NDV）F₄₈E₉株融合蛋白（F）基因的真核表达质粒pcDNA3-F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株（ZJ111/pcDAN3-F）口服接种小鼠和雏鸡。结果表明：利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和PCR鉴定法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。ZJ111/pcDAN3-F以每羽10⁸cfu免疫雏鸡，2周后二免，二免后4周攻击致死剂量的强毒株F₄₈E₉，观察其免疫效力。结果表明：重组ZJ111/pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生抗NDV抗体，而且能诱导法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞的增殖反应，对强毒株攻击的保护率为66.7%，高于pcDNA3-F裸质粒DNA疫苗注射免疫组（50%）。上述结果初步提示减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性，为研制低成本、实用化的口服禽类DNA疫苗奠定了基础。

摘要:用单个植入前胚胎mRNA差别显示方法（Single Preimplantation Embryonic mRNA Differential Display Reverse Polymerase Reaction,SPEDDRTPCR），以家兔移核重构发育至2细胞、8细胞时期的胚胎及囊胚作为起始材料。研究家兔移核重构胚再程序化相关基因的表达。获得了25个与再程序化相关的基因片段，完成了对所有片段的克隆、序列分析，其中5个反向Northern证实的片段在从MⅡ到囊胚的发育阶段中呈现特异性表达的特点。这项研究为再程序化相关基因全长的分离以及功能研究奠定了良好的基础。

摘要:采用RT-PCR法得到人OPG的编码区cDNA，克隆至穿梭质粒pShuttle，构建重组有OPG编码区cDNA的腺病毒DNA，经Pac I 酶切线性化，在脂质体介导下转染HEK293细胞，制备重组腺病毒并测定病毒滴度约为5×10⁶～1.5×10⁷ pfu/mL。体外感染小鼠成肌细胞C2C12，Western blot及ELISA检测证实有OPG蛋白的表达，并可在细胞培养上清中持续表达6周。感染OPG重组腺病毒的C2C12细胞生长状态良好、细胞周期无明显变化。将重组腺病毒加入体外培养的小鼠骨髓细胞的培养基中，诱导形成的破骨细胞数量及在象牙片上形成的吸收陷窝的数量显著减少（P<0.01）。 

摘要:从橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1中克隆出木聚糖酶基因xynA,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)上的pellB信号肽编码序列之后，得到2种构建的重组载体，在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达，表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中，转化毕赤酵母得到重组子，在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达，在摇床培养水平上的表达量达到200mg/L，且表达产物具有生物学活性。

摘要:发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601 感染商陆叶片外植体1周后，在其切口处产生毛状根，20d后产生毛状根的外植体比例达70%;毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。毛状根能在无激素的 MS培养基上自主生长，其呼吸速率比对照根提高85.6%。冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明，发根农杆菌RiTDNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol 基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的154倍，但其多糖含量则仅为非转化根的70%。

摘要:将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上，得到重组质粒pHBM220，将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168，该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶，对重组酶进行相关的酶学性质分析表明，三者的最适反应pH值约为5.5，最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL，11.63IU/mL，9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好，而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。

摘要:最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因。经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白（GFPxm）具有476nm的激发峰和496nm的发射峰，但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用。这里进一步报道GFPxm的12种突变型。在大肠杆菌中的表达结果表明，有7种突变型在37℃条件下产生高的荧光强度。在25、32和37℃条件下表达6 h，GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白（EGFP），而GFPxm16和GFPxm163在42℃高温表达时仍能保持高的荧光强度。这7种突变型中的4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达。此外，有6种突变型的荧光光谱红移，目前所达到的最长激发峰为514nm、最长发射峰为525nm。另外有3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰，1种突变型只有单一的紫外激发峰。首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm，它的激发峰为509nm、发射峰为523nm。523nm属于黄绿色，但肉眼看到的蛋白为橙色。OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟，但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低。

摘要:豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价，我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统，将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达，表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化，融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用，可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体，经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示，无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。

摘要:利用多种原核表达系统、真核体外翻译系统和细菌/杆状病毒(Bac to Bac)的昆虫表达系统对一个具有重要生理功能的人的膜蛋白LASS2(Homo sapienslongevity assurance homologue 2 of yeastLAG1)进行表达研究。在原核表达系统中仅能够表达其羧基端胞外区片段却不能表达完整的LASS2蛋白,并制备了该片段的抗体。完整的LASS2蛋白能够在两种真核表达系统中进行表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物分子量为约28kD的LASS蛋白, Western印迹分析也证实了这一结果, 并利用Ni-NTA树脂亲和层析将该蛋白纯化,纯度达到90%以上。

摘要:顺-1,2-二羟基-3，5-环己二烯（简称DHCD）是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E. coli JM109 (pKST11)，采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶（Toluene dioxygenase，TDO）活性的方法，研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明：（1）发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达，不利于细胞生长，在对数生长中期（6或8h），采用0.5mmol/L IPTG即可诱导出TDO的最高表达。（2）发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶(TDO)的活性有抑制作用，而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害，明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法，DHCD的产量仅有75 g/L；批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到226 g/L，是通气供苯法的3倍；而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到368 g/L，是通气供苯法的5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾，获得较好的转化结果。

摘要:结合元素平衡和代谢平衡，建立了重组人血清白蛋白发酵过程表达期的数学模型，按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数，并探讨了导致表达期不同阶段产物形成速率存在差异的可能原因。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程表达期中各宏观反应速率之间的关系，为重组人血清白蛋白的高效表达提供了线索。

摘要:在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌，生产人源抗HBs Fab，为批量生产作准备。在发酵过程中，控制溶氧30%以上，温度37℃，在基础培养基内生长4 h后，补加以甘油为碳源的补料，继续生长到9 h，加入阿拉伯糖，至终浓度为002%,30℃诱导表达5h,收集菌体，纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性，Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后，菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%，含量为80mg/L。以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达生产的人源抗HBs Fab为可溶性具生物学活性的蛋白，与包涵体表达相比避免了变性、复性这一复杂过程，发酵罐表达比率与摇瓶相比没有降低，表达量达80mg/L左右，为大批量生产作了准备。

摘要:东北红豆杉悬浮培养体系中加入适量浓度的水杨酸，染色结果表明，水杨酸可以增加细胞膜通透性，并可诱导部分细胞发生核凝集或核碎裂。提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，发现染色体DNA发生了部分降解。应用蛋白质双向凝胶电泳技术，研究了水杨酸处理后东北红豆杉细胞发生应激反应过程中蛋白质的表达情况，分析了处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异，发现在水杨酸处理48h后的样品中有7个蛋白质差异点，而且有6个蛋白点仅在对照中检测到。结果表明，外加水杨酸改变了东北红豆杉细胞的基因表达，抑制部分蛋白合成的同时也合成了部分新蛋白质，这些蛋白可能与水杨酸的作用有关。

摘要:生物柴油是用动植物油脂或长链脂肪酸与甲醇等低碳醇合成的脂肪酸甲酯，是一种替代能源。这里探讨了生物法制备生物柴油的过程，采用脂肪酶酯化和酯交换两条工艺路线进行催化合成。深入研究制备过程中，不同脂肪酶、酶的用量和纯度、有机溶剂、低碳醇的抑制作用、吸水剂的作用、反应时间和进程、底物的特异性和底物摩尔比等参数对酯化过程的影响。试验结果表明，采用最佳酯化反应参数和分批加入甲醇并用硅胶作脱水剂的工艺过程，酯化率可以达到92％，经分离纯化后的产品GC分析的纯度可达98％以上，固定化酶的使用半衰期可达到360h。同时对酯交换制备生物柴油过程中，甲醇的用量和甲醇的加入方式对脂肪酶催化过程的影响作了初步研究，优化后的酯交换率可达到83％。

摘要:化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因，克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中，获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整，N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。

摘要:低氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1, HIF1)是由HIF1α和 HIF1β组成的异源二聚体转录因子，在细胞的氧平衡过程中起重要作用。在应答低氧信号时，HIF1α亚基表达水平上调，并通过激活参与细胞能量代谢、红血细胞生成以及血管生成的靶基因表达，达到保护局部缺/贫血细胞免于凋亡或死亡，而后者则是临床上影响大脑和脊椎神经损伤恢复的主要原因。为了达到基因治疗急性神经损伤的目的，我们构建了表达HIF-1α的重组腺病毒载体。实验表明，重组腺病毒可以在大肠杆菌中组装，并在HEK293T细胞中包装。包装后的HIF-1α重组腺病毒载体的病毒感染效率为2×10¹³CFU，外源基因HIF-1α在He1a细胞中的表达6 h后达到峰值。目前正在开展建立在此基础上的急性神经损伤动物模型试验。

摘要:将从黑曲霉菌株Aspergillus niger 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫－杆状病毒表达系统中表达，SDSPAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1.43 g/L血淋巴液和1.90 g/L血淋巴液。酶活性测定结果表明，在蚕体和蛹的表达活性分别为4.67×10⁸u/L血淋巴液和5.99×10⁸u/L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60 ℃，最适pH值为5.5～5.0和2.5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性，可以用于生产饲用植酸酶。

摘要:利用果糖修饰的壳聚糖为材料，液体石蜡作分散介质，戊二醛作交联剂，通过反相悬浮法制备了性能优良的微米级果糖修饰壳聚糖微载体。用其进行原代大鼠肝细胞培养，利用相差显微镜和扫描电镜对细胞形态进行观察，并测定了细胞的代谢活性。结果显示果糖修饰的壳聚糖微载体是一种优良的肝细胞培养支架。

摘要:采用单引物RTPCR扩增的方法,从新疆野生植物盐角草（Salicornia europaea）中克隆获得了1.7kb的cDNA片段，经过测序和序列分析，发现基因片段包含了orf25基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法，结果显示新疆盐角草orf25基因与甜菜线粒体同源性高达98%，与烟草线粒体同源性达到95%，与小麦同源性为92%，与玉米同源性为88%，表明orf25 基因在植物中是高度保守的一种基因， 同时说明野生植物盐角草中也存在与农作物相似的雄性不育相关基因，orf25 基因编码的功能性蛋白可能在影响植物雄性不育改良作物品种方面具有重要的意义。