摘要:对近年来新发展的用液相色谱(LC)进行蛋白质复性及同时纯化的方法做了评述，详细介绍了蛋白质在4种液相色谱上的复性及同时纯化的方法、设备和影响因素，并对各自的优缺点进行了比较，为色谱法作为研究蛋白质折叠及用于基因工程生产治疗蛋白质的复性及同时纯化技术的进一步应用提供依据。

摘要:利用染色体步移策略，以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针，从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。对其中1.8kb的PvuII-SacII片段进行了序列分析，结果表明：此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框，起始密码子为447位的ATG，终止密码子为1614位的TGA，推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示，此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明，此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关，命名为sanK。

摘要:利用基因工程技术提高了短杆菌的苯丙氨酸合成途径中关键酶活性，大幅度地增加了生物合成苯丙氨酸的产量。首先采用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌的氟代苯丙氨酸抗性变异菌株基因组中扩增到与苯丙氨酸合成相关的aroG,pheA和tyrB 3个基因。其中aroG编码3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DS)，pheA编码双功能酶蛋白-分枝酸变位酶(CM)和预苯酸脱水酶(PD)，tyrB编码转氨酶(AT)。设计不同的酶切位点，利用质粒pUC118的多克隆位点，将3个基因按不同的顺序组合串联，然后插入穿梭质粒pCZ.10，导入短杆菌中表达。结果表明3个大肠杆菌基因在短杆菌中能够表达。其中以aroG-pheA-tyrB顺序串联而构建的黄色短杆菌工程菌株1311-GAB中的DS酶活力提高4.5倍，CM提高4.2倍，PD提高2.7倍，AT提高3.2倍；它的苯丙氨酸合成量提高2.35倍。

摘要:为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichia pastoris细胞株用于高密度发酵，构建了多种分泌表达载体，在Pichia pastoris中作表达，研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高10%左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵，细胞湿重达460 g/L，发酵液上清的人血清白蛋白含量为1.0 g/L。

摘要:以自体免疫球蛋白作为外源抗原的载体来研制疫苗是一条研制安全、高效疫苗的新途径。将猪IgG H链基因中的CDR3区缺失，剩余的两个片段分别连接到pBluescript Ⅱ SK(+)和pBluescript Ⅱ KS(+)上，其中一片段再与编码FMDV VP1两个拷贝的141～160位氨基酸残基和一个拷贝的200～213位氨基酸残基构成的串联片段20AA～14AA～20AA的核苷酸片段相连。然后将它们切下与质粒表达载体pET28b相连，构建出融合表达质粒p^ET_28b-FH，经限制酶酶解及DNA序列分析证明该融合基因各连接点及读框正确。转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达出一分子量为64kD的蛋白质。经ELISA检验证明，大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有O型FMDV抗原活性。将该融合蛋白肌肉注射免疫豚鼠和猪，攻毒实验表明，疫苗p^ET_28b-FH对豚鼠产生了保护作用，保护率为66%，对猪也有保护作用。

摘要:从力复霉素SV产生菌——地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32的硝酸盐同化基因簇的上游克隆了一个2.6kb的Eco-RI—XhoI DNA片段并测定其序列。序列分析表明，该DNA片段编码两个完整的开放阅读框架(ORF)，ORF2的起始密码子GTG与ORF1的终止密码子TGA在TG处重叠。ORF1编码一个含224个氨基酸的多肽，它同放线菌中典型的应答调节蛋白包括AfsQ1和MtrA有很高的同源性；ORF2编码一个含472个氨基酸的蛋白，它同包括AfsQ2和MtrB在内的组氨酸激酶同源。ORF1和ORF2有可能构成典型的双组份信号传导系统，分别命名为amrC和amkC。在T7启动子的控制下，完整的amrC和去除子N端一个可能的跨膜区的amkC在大肠杆菌中分别得到了高效表达，表达蛋白的分子量分别为30kD和46kD，与推测蛋白的分子量一致。

摘要:通过计算机辅助分析，发现在耐热碱性磷酸酯酶(简称FD-TAP)的N端存在26个氨基酸的信号肽序列。但一般信号肽切点并非是完全专一的，所以利用基因工程手段将FDTAP的N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸，得到了N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸的克隆子pTAPND24、pTAPND25、pTAPND26和pTAPND27。考虑到这样的克隆子其翻译起始区所形成的能量较低结构稳定的二级结构可能阻碍基因的表达，所以在保证氨基酸序列不变的前提下另外设计了4个引物，得到了二级结构能量大大提高的4个克隆子pTAPND24C、pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C。结果表明pTAPND24、pTAPND25和pTAPND27没有表达；pTAPND26和pTAPND24C的表达量较低，pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C的表达量较高。通过测定pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C的表达蛋白TAPND25、TAPND26和TAPND27的比活和热稳定性，发现无论比活和热稳定性TAPND27明显比TAPND25和TAPND26高且比野生型FD-TAP略高。

摘要:鼠单克隆抗体AA98是我室研制的一株新型抗肿瘤血管抗体，体内实验证明它可以抑制血管生成，抑制肿瘤生长。从分泌抗体AA98的杂交瘤细胞中提取总RNA，采用逆转录PCR(RT-PCR)分别扩增重链Fd及轻链κ，并进行序列测定。将Fd和κ链依次与噬菌粒pComb3H连接，构建pComb3H-AA98Fab表达载体。在大肠杆菌中表达了AA98Fab。免疫印迹表明该Fab片段识别分子量为100kD的蛋白，具有原抗体AA98的抗原特异性。AA98Fab是研究抗体AA98作用机理的工具，也为制备重组免疫毒素，尝试肿瘤血管靶向治疗实验打下了基础。

摘要:利用粘粒载体pCOS5构建了国内分离的O139霍乱弧菌的基因组文库，并从文库中筛选获得可以表达O139霍乱弧菌脂多糖的重组克隆株E.coliJM109(pMG310)。重组粘粒pMG310经酶切分析，所克隆的外源DNA片段大小为37kb。实验证明：重组克隆株E.coliJM109(pMG310)所表达的脂多糖具有良好的免疫原性及反应原性。

摘要:以菠菜(Spinacia oleracea L.)为材料，取幼叶分离mRNA，反转录合成cDNA,以cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，获得菠菜磷酸丙糖转移蛋白(Triose phosphate translocator,TPT)cDNA目的片段。对其进行序列分析，结果表明，分离的目的片段核苷酸序列与文献报道相比同源率为99.9%，只有1个碱基发生改变。将得到的菠菜tpt-cDNA与CaMV 35S启动子和NOS 3′终止子融合，分别构建了正义及反义表达载体。通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacumL.),在含有卡那霉素的抗性筛选培养基上再生的植株经PCR及Southern杂交检测，证明tpt基因已整合到烟草基因组上，菠菜丙糖磷酸转移蛋白基因导入烟草后使叶绿体中TPT的含量表现出明显差异，并导致烟草光合作用产物分配的变化，表现在叶绿体中淀粉含量的改变。

摘要:通过克隆人FLT3配体(rhFL)基因，建立其原核高效表达系统，为大规模获得rhFL产品，促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用RT-巢式PCR扩增可溶型FL基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析；将目的基因与pProEXHT载体连接，重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达；亲和层析纯化表达产物，观察其刺激CD34⁺细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长481bp的rhFL基因，测序结果与已知人FL基因序列一致；rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的15%，经亲和纯化纯度达90%以上；rhFL⁺G-CSF⁺EPO刺激CD34^＋细胞增殖约400倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达，初步建立了产物纯化途径，纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干/祖细胞增殖的能力。

摘要:研究了造血干细胞生长因子、白介素-3、白介素-6、粒-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子及红细胞生成素对脐血造血细胞体外培养的影响及其剂量关系，考察了造血细胞因子单独与联合作用对造血细胞体外培养的影响，证实细胞因子组合使用比细胞因子单独使用效果更好，发现SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+G-CSF+EPO组合对总细胞扩增最佳，SCF+IL-3+IL6+GM-CSF组合对CFU-GM扩增最佳。实验发现培养液更换可大大提高脐血造血细胞总数和祖细胞数产出。在每天更换50%培养液下，脐血总细胞数在第三周扩增了27倍，祖细胞数扩增了21倍。

摘要:采用赖氨酸缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) L1原生质与肌醇缺陷型粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)PM\|5原生质体融合选育了葡萄酒发酵性能良好且具有降解苹果酸能力的酵母菌株。对融合子菌落形态、遗传稳定性、降解苹果酸能力和葡萄酒发酵性能进行了研究。结果表明：用促融合剂［30%聚乙二醇(MW6000)、0.02mol/L CaCl₂和17g/100mL蔗糖］处理两亲本进行属间融合，获得19株融合子，融合率为4.7×10^-6～3.1×10^-7。融合子具有降解苹果酸能力和葡萄酒发酵性能好的双亲优良特性，证实了其杂种特征。

摘要:恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1是当今疟疾疫苗主要的候选抗原。由于天然MSP1基因AT含量异常高(为74%)，使得克隆全长天然基因无法实现。本文已全合成了msp1基因(4940bp)，解决了该天然基因在异源系统中不稳定的问题。为制备大量msp1重组蛋白进行疫苗有效性试验，本研究建立了msp1基因在毕赤酵母中的表达，将合成的msp1基因克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5，构建了重组质粒pPIC3.5/msp1，用电击转化毕赤酵母得到重组转化子，经PCR证实msp1基因已整合于毕赤酵母染色体中。含有重组表达质粒的毕赤酵母菌经甲醇诱导后表达出全长msp1重组蛋白。表达产物能与识别MSP1分子二硫键依赖构象表位的特异性单抗发生很强的反应，表明msp1重组蛋白至少在该表位构象上与天然蛋白一致。从毕赤酵母中分离得到大量msp1为开展该蛋白的结构与功能，特别是测定其疟疾保护性免疫提供可能。

摘要:用TRIZOL试剂盒分别提取日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫总RNA，Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA，反转录合成第一链cDNA，完成第二链cDNA合成后，凝胶电泳回收500bp以上的片段并过柱纯化后，与载体λZipLox连接。体外包装后分别得到雌、雄成虫cDNA噬菌体表达文库。经测定雌、雄文库容量分别为3.74×10⁶、3.28×10⁶，重组比率均在96%以上，插入片段长度多在1kb左右。通过PCR技术，我们从文库中钓取到EGP、23kD膜蛋白、Actin和GCP的cDNA，其中GCP基因为低丰度表达基因。各项指标表明，我们成功构建了高质量的cDNA文库，可作为研究雌雄成虫基因差异及筛选保护性抗原基因的重要资源。

摘要:将胸腺素α1基因4串体克隆于pThioHisA融合表达载体(pThioHisA-Tα1④)，转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下，融合蛋白得到了高效表达。SDS-PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的40%，且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解，经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体，HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达98%。利用3H-TdR进行生物活性测定，证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下，刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力，与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。

摘要:根据反应机理和产物的化学结构，建立了嗜热脂肪芽孢来源的β-半乳糖苷酶催化乳糖水解和转半乳糖苷反应偶合的动力学模型，模型中包含了低聚三糖和低聚四糖的生成。通过优化计算，估算反应动力学参数，结果表明该模型能较好地与实验结果相吻合。

摘要:应用代谢流量平衡模型定量分析了杂交瘤细胞的代谢流量分布。结果表明，在连续培养的杂交瘤细胞中，当葡萄糖和谷氨酰胺的流加浓度分别为13.8和2.6 mmol·L^-1时，86.2%的葡萄糖通过糖酵解生成乳酸，7.5%的生成脂类，进入TCA循环的仅占0.83%；谷氨酰胺中的氮有3%用于核酸的合成，54.5%生成氨，另有38.2%生成非必需氨基酸，碳骨架61.6%生成非必需氨基酸，34.1%进入TCA循环。

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