不含信号肽序列人尿激酶原全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要:

从pro—uK全长cDNA中切下包括信号肽序列的N端371bp片段，经Fnu4HI不完全酶切将信号肽序列去掉，回收304bp片段，该片段再与人工合成的含HindⅢ、EcoRV内切酶位点和起始密码ATG的寡核苷酸片段连接，转化得一重组质粒，该中间质粒经酶切和序列分析证明构建正确后再与pro—UK cDNA其余片段相连按，得到全长pro一UK cDNA。我们将所得不含信号肽序列的pro—UK cDNA重组到带有PRPL启动子的原核表达载体pHv220中，转化大肠杆菌JM101，42℃诱导6h，菌体超声破碎后其上清及不溶性成份均可测出尿激酶活性。用ELISA法检测尿激酶抗原性表现为强阳性；纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定活性可达500－1000IU／L，经复性活性可达60000lU／L，虽表达产物可被抗尿激酶血清特异中和，经相差显微镜及电镜观察均证明表达蛋白绝大部分以包涵体形式存在。Western blot分析证明表达产物为单链pro-UK，分子量约为47kDa，与国外文献报导一致。

Abstract: