人生长激素慢病毒载体的构建及其在鼠骨骼肌成肌细胞中的表达

摘要:

构建能表达人生长激素（hGH）的pLentivirus6/V5_hGH载体，并实现hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达。体外培养SD鼠骨骼肌成肌细胞，并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hGH亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO 载体上，构建重组质粒pLentivirus6/V5-hGH。将pLenti6/V5- hGH及阳性对照质粒pLenti6/V5_EGFP分别用Lipofectamin 2000介导转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。在激光共聚焦扫描显微镜下计数，确定阳性对照质粒的转染数，从而估计该基因的转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源生长激素（GH）的成肌细胞。收集转染及筛选后的细胞培养基，用放射免疫分析法（RIA）检测重组人生长激素（rhGH）的表达水平。聚合酶链式反应法(PCR)及DNA测序显示hGH基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO 载体中；阳性对照质粒转染细胞24 h后，在激光共聚焦显微镜下观察，其转染效率达40%以上。检测收集的上清，与对照组相比,有极显著差异(P<0.01)，观察至第8周，rhGH仍持续稳定表达。通过检测培养的chang-liver肝细胞上清中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的水平，验证了rhGH的生物学活性。实验通过培养高纯度的成肌细胞，构建了能在真核细胞内表达hGH的重组质粒pLenti6/V5- hGH，实现了hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达，并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。

Abstract: