摘要:Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列（IGS），可特异性地定点剪接目的基因RNA，从而在RNA水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料，克隆了其26S rRNA内含子核酶基因，体外转录证实该I型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能，构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白（GFP）的截短突变体重组质粒XYQ5/XYQ10pEGFP-C-2，并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用PCR和分子克隆技术，构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptrans-rib-CMV2，该核酶载体以克隆的26S RNA内含子为核心，选择EGFP编码区194位TG为剪接位点，以188-193位设计IGS序列，核酶3′端携带195-890bp的EGFP基因序列，连接于pRC-CMV2真核表达载体中。体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ5/10-pGEM和ptrans-rib-CMV2，以混合转录产物为模板进行RT-PCR，电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFP mRNA，从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒XYQ5/XYQ10- pEGFP-C2与核酶质粒ptrans-rib-CMV2共转染Hela细胞，用荧光显微镜观察转染结果，发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光；RT-PCR检测出野生型EGFP mRNA，证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能，但其反式剪接效率低。
