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微生物学通报

  • 2020年第47卷第1期文章目次
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    • >工业微生物学
    • 基于三步荧光定量PCR技术揭示不同产区白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的分布特征

      2020, 47(1):1-12. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190150

      摘要 (1137) HTML (1424) PDF 1.37 M (1335) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】 Lactobacillus sp.是一株存在于白酒酿造系统中的功能微生物,但是针对Lactobacillus sp.的定量方法及其在中国白酒酿造系统中的分布尚未被研究。【目的】建立一种基于特异性引物的荧光定量PCR定量方法,并应用于实际生产检测,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。【方法】基于16s rRNA基因序列设计特异性引物,并通过PCR验证引物特异性;优化荧光定量PCR反应程序,提高引物扩增效率;定量分析所采集样本中Lactobacillus sp.的含量,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。【结果】设计了一对扩增产物大小为445 bp的特异性引物。通过优化扩增条件,构建含有变性、退火、延伸过程的三步荧光定量PCR方法,该方法扩增线性较强,R2>0.99;灵敏度高,定量限为17.9 copies/μL;重复性好,Ct值的变异系数小于1%。跟踪检测全国10个产区代表产地的白酒酿造系统,其中8个产区均检测到Lactobacillus sp.,在相同产地不同酿造工艺的酿造系统中均检测到Lactobacillus sp.,但是含量上有显著差异。山东潍坊产地的芝麻香型白酒发酵体系含量最高(7.27±0.04 lgcopies/g),跟踪发酵时间样本发现Lactobacillus sp.的生长分为两个阶段:生长期(0?15 d)和稳定期(15?45 d)。【结论】基于特异性引物所建立的三步荧光定量PCR技术可实现对白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的鉴定和定量,通过跟踪检测发现Lactobacillus sp.广泛分布在中国白酒发酵体系中,其中产地决定Lactobacillus sp.的分布,酿造工艺影响含量,在发酵过程中Lactobacillus sp.的含量具有明显的动态变化规律,为进一步研究该菌在发酵过程中的功能提供参考。

    • 解脂耶罗维亚酵母工程菌合成超长链脂肪酸及温度的影响

      2020, 47(1):13-23. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190090

      摘要 (1147) HTML (1832) PDF 1.09 M (1041) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】解脂耶罗维亚酵母属于产油微生物,大量研究表明该酵母能够高产长链脂肪酸和油脂,但是应用该酵母合成超长链脂肪酸仍待研究。【目的】工程化解脂耶罗维亚酵母合成高值超长链脂肪酸,并研究温度对脂肪酸合成的影响。【方法】合成密码子优化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)延长酶基因AtFAE1、非洲芥菜(Brassica tournefortii)延长酶基因BtFAE1和碎米芥属植物Cardamine graeca的延长酶基因CgKCS,分别构建质粒pYLEX1-AtFAE1、pYLEX1-BtFAE1、pYLEX1-CgKCS和pYLEX1-AtFAE1-BtFAE1-CgKCS。以解脂耶罗维亚酵母菌株Po1g为宿主,通过化学法分别转化上述4个质粒,获得工程菌Po1g-AtFAE1、Po1g-BtFAE1、Po1g-CgKCS和Po1g-AtFAE1-BtFAE1- CgKCS,比较评价超长链脂肪酸的合成。在此基础上,过表达内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT1 (diacylglycerol acyltransferase)提高产油量,并研究温度对生物量、产油、脂肪酸组成的影响。【结果】在解脂耶罗维亚酵母中3个延长酶的延长能力明显不同,AtFAE1主要催化C20:1脂肪酸的合成,BtFAE1更有利于芥酸(C22:1)的合成,而CgKCS能够催化合成神经酸(C24:1),但是三者共表达并未提高神经酸产量。在表达CgKCS基因的菌株中过表达DGAT1基因,细胞油脂含量提高50%。温度实验表明,低温有利于解脂耶罗维亚酵母合成不饱和脂肪酸,反之,高温利于其合成饱和脂肪酸。【结论】脂肪酸延长酶基因CgKCS可直接催化C18:1脂肪酸合成C24:1的超长链脂肪酸,并且通过优化培养温度可提高不饱和脂肪酸的合成。本研究为构建超长链脂肪酸细胞工厂以及发酵优化提供理论和技术参考。

    • 铁锰氧化物提高巴斯德梭菌电子输出率

      2020, 47(1):24-34. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190191

      摘要 (928) HTML (928) PDF 795.80 K (961) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】发酵型异化金属还原菌通过发酵获取能量,同时也具有一定的异化还原变价金属氧化物的能力,关于变价金属氧化物对发酵型异化金属还原菌电子输出率的影响还知之甚少。【目的】探究铁锰氧化物(Fe2O3/MnO2)对发酵型异化金属还原菌Clostridium pasteurianum电子输出率的影响。【方法】将不同浓度Fe2O3/MnO2添加到以葡萄糖为底物并接种5% C. pasteurianum的发酵体系中,利用电化学工作站检测C. pasteurianum电化学特性;以菲啰嗪(Ferrozine)显色法和甲醛肟法分别测定发酵体系中Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)含量;气相色谱、高效液相色谱检测发酵底物葡萄糖及代谢产物(乙酸、丁酸、CO2和H2)随发酵时间的变化情况;最后计算发酵过程的电子输出率。【结果】研究表明,接种C. pasteurianum的微生物燃料电池可以检测到电流的产生,最大电流密度为0.93 mA/m2;随着发酵时间的推移,反应体系中Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)的浓度逐渐增高;Fe2O3/MnO2的添加使发酵体系中葡萄糖消耗量提高了9.4%/7.7%,同时,乙酸产量提高了37.5%/25.0%,丁酸产量提高了22.7%/6.8%,氢气产量提高了21.6%/9.8%,而总的电子输出率则提高了24.27%/10.82%;添加铁锰氧化物的实验组pH值与对照组相比无显著差异。【结论】铁锰氧化物的添加可以提高C. pasteurianum的电子输出率,其原因可能是增加了葡萄糖消耗和缓冲pH值。研究结果为揭示变价金属氧化物影响发酵型异化金属还原菌电子输出的规律提供了证据,并进一步拓展了对变价金属氧化物与发酵型异化金属还原菌之间相互作用机制的认识。

    • >海洋微生物学
    • 一种富集高温栅藻Desmodesmus sp. F51的新型生物絮凝剂

      2020, 47(1):35-42. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190462

      摘要 (876) HTML (921) PDF 1.23 M (1157) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】海科贝特氏菌(Cobetia marina)可产生大量具有絮凝活性的胞外产物,可视为一种新型的生物絮凝剂。高温栅藻(Desmodesmus sp. F51)是一种具有较高叶黄素含量的微藻,被认为是一种新兴的叶黄素来源,但利用该生物絮凝剂高效富集高温栅藻的相关研究迄今尚未见报道。【目的】以高温栅藻为对象,研究该新型生物絮凝剂的絮凝效率,并对絮凝机理进行初步探讨。【方法】探索在不同生长阶段微藻培养液添加生物絮凝剂、添加量、絮凝时间、pH对絮凝效率的影响,分析生物絮凝剂的功能基团,并测定在不同pH条件下添加生物絮凝剂前后高温栅藻的Zeta电位变化,以及在显微镜下分析藻细胞在添加生物絮凝剂前后的形态。【结果】在高温栅藻生长至稳定期(pH 8.0)添加2 mL生物絮凝剂,絮凝15 min絮凝效果最佳,达82.1%。傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)显示了多糖及酰胺结构的特征吸收峰,由此推测生物絮凝剂主要是多糖的混合物,含有少量蛋白质。根据Bradford法测定絮凝剂中蛋白含量约为0.4% (质量比),通过苯酚-硫酸法测定总糖质量分数约为34.5% (质量比),与FTIR分析结果基本相符。生物絮凝剂在pH 4.0?11.0保持60%以上的絮凝效率,说明无论是酸性或是碱性条件下絮凝效率都较高,结合Zeta电位的分析表明,推测生物絮凝剂对高温栅藻的絮凝机理中占主导地位的可能是吸附架桥作用。【结论】该研究对微藻生物絮凝具有重要的理论和实践意义。

    • >环境微生物学
    • 一株新型苯胺蓝降解菌MP-13的代谢特征

      2020, 47(1):43-53. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190414

      摘要 (888) HTML (1306) PDF 1.12 M (1106) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】三苯甲烷类染料的广泛使用对我国生态环境构成了极大危害,亟待开发一种经济、高效和环境友好型的染料废水处理技术。目前,利用微生物处理染料废水被认为是一种环境友好型的方法。【目的】通过解析菌株MP-13对苯胺蓝的降解特性,为该菌株在染料废水治理中的应用提供核心理论与技术依据。【方法】从食木白蚁肠道中筛选一株苯胺蓝脱色菌,对其进行16S rRNA基因序列分析鉴定,确定其基本生物学特征,然后通过FTIR、GC/MS等分析手段解析该菌对苯胺蓝的降解特征。【结果】菌株MP-13经鉴定为土白蚁特拉布尔希氏菌(Trabulsiella odontotermitis),该菌对苯胺蓝降解的最适温度、pH和转速分别为35 °C、8.0和180 r/min,苯胺蓝浓度为200 mg/L时最大脱色率可达97.3%,且对苯胺蓝的耐受浓度可达1 500 mg/L。此外,FTIR和GC/MS的结果表明苯胺蓝被降解为小分子芳香族化合物。【结论】Trabulsiella odontotermitis MP-13对苯胺蓝有较强降解能力和较高耐受性,可作为染料废水生物修复的潜在菌株资源。

    • 基于转录组分析铜绿假单胞菌DN1降解荧蒽特性

      2020, 47(1):54-65. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190463

      摘要 (1055) HTML (1803) PDF 2.43 M (1073) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】铜绿假单胞菌DN1是一株从石油污染土壤中分离筛选到的具有广谱降解功能的菌株。【目的】深入了解荧蒽胁迫条件下铜绿假单胞菌DN1降解污染物过程中重要的降解相关基因信息。【方法】通过高通量测序技术对铜绿假单胞菌DN1进行转录组测序,对其所有的转录本进行KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)分类和Pathway注释、GO (gene ontology)分类和富集分析。【结果】转录组测序显示:与对照组相比,荧蒽诱导组检测到6 189个基因,其中1 919个基因上调表达,1 603个基因下调表达。KEGG注释分析显示差异上调表达基因匹配到了112个KEGG 代谢途径,注释到“代谢途径”的1 408个基因(约占总差异基因的73.4%)中有317个基因参与了碳氢化合物代谢及含有苯环结构的异源生物质的生物降解,占“代谢途径”的16.53%,暗示了菌株DN1降解荧蒽可能与这些途径有密切关系。另外,主要代谢途径中的差异表达基因主要集中在ABC转运系统、氨基酸生物合成、双组分系统及碳代谢,这些途径大多数参与了底物的识别转运、信号转导及基因表达调控。【结论】进一步拓展了铜绿假单胞菌DN1在荧蒽胁迫条件下的代谢途径和逆境反应,也为微生物修复环境污染物研究夯实了理论基础。

    • 耐盐菌Staphylococcus sp. YZ-1和Bacillus cereus CC-1的Cr(VI)脱毒特性与机理

      2020, 47(1):66-75. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190358

      摘要 (720) HTML (1248) PDF 733.30 K (1061) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】高盐含铬废水的去除过程中,Cr(VI)还原菌是研究者关注的重点,但目前对耐盐菌株的Cr(VI)脱毒特性及机理的分析仍较少。【目的】比较两株耐盐菌株的Cr(VI)移除特性,并区分Cr(VI)耐受机制的差异;通过基因组测序分析,从基因层面推测铬耐受相关基因;构建铬还原菌的混菌体系,考察两者对去除污染物的协同作用。【方法】从青海茶卡盐湖分离耐盐菌Staphylococcus sp. YZ-1,与Bacillus cereus CC-1进行基础特性和Cr(VI)去除性能的比较,并通过全基因组序列的分析验证特性测试的结果。【结果】两株菌都具有铬移除特性,但CC-1的铬移除效率更高,在初始Cr(VI)浓度为0.1 mmol/L情况下,CC-1能在12 h内移除95.3%的Cr(VI),而YZ-1只能移除40.1%。在进一步实验中发现YZ-1只能对Cr(VI)进行还原,将其转化为可溶的有机态Cr(III),而CC-1能同时对Cr(VI)进行还原和吸附。全基因组分析发现YZ-1具有编码外排泵蛋白的基因和编码NAD(P)H氧化还原酶的基因,而CC-1具有编码铬转运蛋白ChrA和细胞色素C氧化还原酶的基因。两株菌的混菌体系在处理含Cr(VI)、Te(IV)的废水时,菌群能将还原产物聚集成团并沉淀到底部。【结论】菌株YZ-1和CC-1均为耐盐铬还原菌,但YZ-1中的铬还原酶为诱导型酶,CC-1则为组成型酶。基因组数据分析鉴别出两者可能同时存在多种铬耐受机制相关编码基因。混合菌群可以结合YZ-1的自絮凝特性和两者均有的Te(IV)/Cr(VI)还原活性,具有潜在的实用价值。

    • 植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆

      2020, 47(1):76-87. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190592

      摘要 (1531) HTML (1295) PDF 1.76 M (1139) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。【目的】挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。【方法】利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。【结果】从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。从B. subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B. pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B. subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。【结论】芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。

    • >基础微生物学
    • 敲除组蛋白去乙酰化酶基因hdac对里氏木霉纤维素酶表达的调控作用

      2020, 47(1):88-96. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190260

      摘要 (1170) HTML (1305) PDF 1.57 M (1366) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】里氏木霉(Trichoderma reesei)是木霉属中产纤维素酶最具代表性的真菌之一,表观遗传调控是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,组蛋白去乙酰化是其中一种。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责脱乙酰化,敲除去乙酰化酶基因可引起菌株孢子、菌丝及纤维素酶活性等的一系列改变。【目的】通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase,hdac)建立了里氏木霉hdac缺失突变株(T. reesei Δhdac),以研究对纤维素酶基因表达的调控作用。【方法】利用Split-Maker技术构建了组蛋白去乙酰化酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T. reesei QM9414。经PCR及Southern blotting验证正确后,对突变体T. reesei Δhdac连续7 d检测滤纸酶活(filter paper activity,AFP)、羧甲基纤维素钠酶活(carboxymethyl cellulase activity,CMCA),利用RT-qPCR检测纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达。【结果】突变体T. reesei Δhdac两种酶活力均显著高于出发菌株,分别高出8.00、30.00 IU/mL。突变体T. reesei Δhdac纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平分别为出发菌株T. reesei QM9414的6.50、6.01和4.51倍。【结论】里氏木霉中纤维素酶的基因表达明显受到组蛋白去乙酰化酶基因(hdac)的调控,这为研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶的影响提供了新的证据。

    • >农业微生物学
    • 施用Streptomyces alfalfae XY25T对根肿病土壤性质及微生物群落的影响

      2020, 47(1):97-108. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190244

      摘要 (1155) HTML (766) PDF 664.31 K (1046) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】根肿病是一种世界性土传病害,鄂西高山不少田块大白菜发病率高达60%,严重制约了当地蔬菜产业的发展。【目的】揭示Streptomyces alfalfae XY25T防治过程中土壤理化性质的变化规律及其对根际土壤微生物群落的影响。【方法】大白菜幼苗移栽至病区土壤盆栽中,处理组施用S. alfalfae XY25T,并设置对照组。移栽后第7、14、21、28、35天采集土壤样本,测定根际土壤酶活力和土壤肥力;第35天提取土壤DNA,采用高通量测序技术,结合生物信息学分析,解析大白菜根际土壤细菌和真菌群落结构组成及多样性。【结果】施用S. alfalfae XY25T提高了土壤pH值、有机质、碱解氮、速效钾和速效磷的含量,比例分别为10.0%、13.7%、12.0%、41.1%和8.71%;增加了蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶活力,比例分别是333%、204%、36.1%和142%;提高了Ascomycota、Zygomycota及Actinobacteria菌门的相对丰度,比例分别为54.1%、22.8%和10.7%;降低了Acidobacteria的相对丰度,比例是7.59%;提高了Penicillium、Mortierella、Mucor和Streptomyces等菌属的相对丰度,比例分别为25.5%、14.6%、8.20%和7.24%。【结论】施用S. alfalfae XY25T改善了土壤理化性质,改变了根际土壤微生物群落结构和多样性。

    • 基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

      2020, 47(1):109-117. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190263

      摘要 (1006) HTML (1933) PDF 1.13 M (1078) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。【目的】建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。【方法】通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。【结果】体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。【结论】建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。

    • 橡胶褐根病拮抗放线菌17-7的筛选、鉴定及发酵条件优化

      2020, 47(1):118-129. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190160

      摘要 (896) HTML (1557) PDF 1.99 M (1096) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】由有害木层孔菌(Phellinus noxius Corner)侵染引起的橡胶树褐根病是严重危害橡胶树的一类病害,给橡胶产业造成巨大的经济损失。【目的】从橡胶树根际土壤中筛选对橡胶树褐根病菌具有高拮抗活性的放线菌菌株,为该病害生防药剂的研发提供基础。【方法】采用稀释涂布法分离放线菌,平板对峙法、抑制菌丝生长速率法筛选拮抗菌株,通过培养特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析确定其分类地位;利用单因子试验和正交试验相结合确定其最优发酵配方及培养条件。【结果】筛选到一株对橡胶褐根病具有较强抑制作用的放线菌菌株17-7,其对橡胶树上的5种病原菌均有较好的抑制作用。菌株17-7与桑树链霉菌(Streptomyces samsunensi)亲缘关系较近,且形态特征、培养特征和生理生化特征基本相符。该菌株最优发酵配方和培养条件分别为:葡萄糖20.0 g/L、大豆粉25.0 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L,培养基装瓶量为150 mL/500 mL,起始pH 8.0,摇瓶培养转速为140 r/min,接种量为10%,培养温度为28 °C,培养时间为5 d。【结论】菌株17-7被鉴定为桑树链霉菌(Streptomyces samsunensi),其对橡胶褐根病具有较强的拮抗作用。

    • 东北旱田土壤中Anabaena伴生细菌的分离与鉴定

      2020, 47(1):130-139. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190209

      摘要 (858) HTML (822) PDF 2.83 M (1261) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】鱼腥藻(Anabaena)在农田土壤中广泛分布,具有固碳和固氮功能。明确伴生细菌与蓝细菌的关系,对提高农田土壤中Anabaena的功能具有重要意义。【目的】从东北不同旱田土壤中分离Anabaena sp. PCC7120的伴生细菌,初步鉴定伴生细菌的分类归属,推测伴生细菌的功能,为明确旱田土壤蓝细菌与伴生细菌的关系提供数据支撑。【方法】采用平板分离、PCR-DGGE、克隆测序技术测定并分析不同旱田土壤中伴生细菌的16S rRNA基因序列,确定伴生细菌的分类地位。【结果】PCR-DGGE图谱显示东北旱田14个土样中分离获得Anabaena sp. PCC7120伴生细菌数量和种类不同;PCR-克隆测序获得伴生细菌的16S rRNA基因序列37条,可鉴定到种水平的菌株36条,主要归为鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、贪噬菌属(Variovorax)、黄杆菌属(Flavobacterium)和红球菌属(Rhodococcus)等,推测这些伴生细菌具有适应寡营养、富集微量元素、清除毒素等功效。【结论】东北旱田不同土壤中Anabaena sp. PCC7120伴生细菌种类和数量各异,这些伴生细菌主要隶属于Sphingopyxis、Variovorax、Flavobacterium和Rhodococcus等属。

    • 微生物菌剂施用对设施茄子根际土壤养分和细菌群落多样性的影响

      2020, 47(1):140-150. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190275

      摘要 (1449) HTML (1421) PDF 911.88 K (1407) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】设施茄子连作种植和化学肥料过量施用造成土壤养分失衡、微生物多样性降低、土传病害严重等土壤质量问题,微生物制剂是改善土壤环境质量的一项重要措施。【目的】确定微生物菌剂施用对设施茄子根际土壤养分及细菌群落多样性的影响。【方法】在河北省农林科学院鹿泉大河实验园区,以含有哈茨木霉和巨大芽孢杆菌的微生物菌剂为供试菌剂,采用传统的化学分析方法测定微生物菌剂处理和对照茄子开花期、拉秧期土壤的养分含量;采用稀释涂平板方法测定土壤可培养微生物的数量;采用高通量测序技术测定土壤细菌16S rRNA基因V3?V4区,分析处理和对照土壤的微生物多样性和群落分布规律。【结果】与对照相比,微生物菌剂处理提高了茄子开花期和拉秧期的根际土壤养分含量,拉秧期微生物菌剂处理根际土壤中全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量分别较对照增加13.85%、21.07%、31.51%和55.94%;施用微生物菌剂能够改变土壤可培养微生物的数量和构成,微生物菌剂处理土壤中细菌、真菌、放线菌的数量均显著增加,其中细菌、放线菌在微生物总量中所占比例增加,而真菌的占比则有所降低。微生物菌剂处理能够提高土壤微生物的Shannon指数、降低Simpson指数,ACE指数和Chao1指数差异不显著,表明微生物菌剂能够增加土壤的微生物群落多样性,对微生物群落丰富度影响不明显。从目水平上分析菌剂处理和对照的微生物组成,发现微生物菌剂处理增加了土壤中黄单胞菌目(Xanthomonadales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、纤维黏网菌目(Cytophagales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)等优势菌目的占比,降低了伯克氏菌目(Burholderiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)等病原菌的占比。微生物菌剂的施入能够促进茄子营养生长,增加茄子的产量,增幅为18.52%。【结论】微生物菌剂作为一种新型环保肥料,具有改善土壤营养状况、增加土壤可培养微生物数量、提高土壤微生物多样性的作用,该结果为微生物菌剂的合理施用提供了科学依据。

    • >食品微生物学
    • 青稞酒发酵过程中的风味功能微生物及其风味代谢特征解析

      2020, 47(1):151-161. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190240

      摘要 (1298) HTML (2489) PDF 705.27 K (1102) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】青稞酒是一个多菌种固态发酵的产物,解析发酵过程中重要的功能微生物及其代谢特征对调控青稞酒发酵具有重要作用。【目的】揭示青稞酒发酵过程中的风味功能微生物并解析其风味代谢特征。【方法】基于高通量测序技术揭示青稞酒发酵过程中的微生物群落多样性和组成;采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术跟踪酒醅的风味信息;通过微生物属与风味物质的关联分析揭示青稞酒发酵过程中风味功能微生物菌群,并采用蒙特卡洛检验分析进一步揭示发酵过程理化因子对风味功能微生物菌群的影响;于实验室环境下重构6株微生物发酵体系,以揭示其风味代谢特征。【结果】青稞酒发酵过程中9个真菌属和8个细菌属(相对丰度>1%)占据优势,其中Aspergillus、Komagataella、Lactobacillus、Pichia、Saccharomyces和Weissella是青稞酒发酵过程主要风味功能微生物;发酵过程中还原糖(r2=0.946 9,P=0.013 2)和酸度(r2=0.847 6,P=0.048 6)是驱动风味功能微生物菌群演替的关键因子;6株菌的组合发酵实验揭示了体外系统与原位系统具有相同的微生物演替现象与相似的风味轮廓。【结论】研究揭示了青稞酒发酵过程关键的风味功能微生物以及驱动该菌群演替的重要环境因子,并通过组合发酵实验验证了这些微生物的风味代谢特征,为青稞酒发酵过程的风味调控提供了新的视角。

    • >兽医微生物学
    • 猪源肠外致病性大肠埃希氏菌的生物膜形成能力及耐药性

      2020, 47(1):162-171. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190355

      摘要 (982) HTML (1819) PDF 2.00 M (1212) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】猪源肠外致病性大肠埃希氏菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEc)是一种严重危害养猪业的病原菌,有关其生物膜形成能力与耐药性的研究报道很少。【目的】探讨从病猪肺脏中分离鉴定的3株ExPEc的生物膜形成能力及耐药性,为从抗生物膜形成角度防治猪肠外大肠埃希氏菌病提供参考。【方法】采用96孔板结晶紫染色法结合正交实验优化猪源ExPEc分离株的生物膜形成最佳条件与成膜能力;通过扫描电镜观察各菌株生物膜的形态结构;利用PCR方法检测其携带的生物膜形成相关基因;采用微量肉汤稀释法测定抗生素对生物膜态与浮游态下猪源ExPEc分离株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。【结果】3株猪源ExPEc的最佳成膜条件并不一致,但在各自最佳条件下均能形成很强的生物被膜且同时携带10个生物膜形成相关基因(pgaA,pgaB,pgaC,pgaD,luxS,fimA,hipA,iha,flhC,flhD)。扫描电镜观察显示,菌株SE-1聚集后可形成片状生物膜,菌株SE-2和SE-3聚集后可形成多层结构的生物膜,且聚集体间有明显空隙。部分受试抗菌药物对生物膜态SE-1、SE-2和SE-3菌株的MIC值较对应浮游菌提高了2?32倍,药物敏感性由原来的敏感转为中敏或耐药。【结论】实验结果为从抗生物膜形成角度防治猪肠外大肠埃希氏菌病奠定了基础。

    • >水生微生物学
    • 光强及氮浓度对丝状绿藻双星藻生长及生化组成的影响

      2020, 47(1):172-181. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190171

      摘要 (1001) HTML (1177) PDF 1.53 M (1025) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】环境因子和营养因子对微藻的生长和生化组成都有显著的影响,其中光强和氮浓度是最重要的两个条件。【目的】研究不同光强和初始氮浓度对丝状绿藻-双星藻(Zygnema sp.)生长及生化组成的影响。【方法】采用改良的BBM培养基,设置了两组光强[100 μmol/(m2·s)和300 μmol/(m2·s)]和6种初始氮浓度(3、6、9、12、15和18 mmol/L)在柱状光生物反应器中对双星藻进行培养。【结果】在高光强条件下[300 μmol/(m2·s)],12 mmol/L初始氮浓度最有利于双星藻生物质的积累,其最高生物量可以达到6.60 g/L,而初始低氮浓度(3 mmol/L)则促进了油脂和脂肪酸的积累,油脂最高含量占干重的32.13%,且脂肪酸组成主要包括棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3),其中油酸含量最高达到总脂肪酸含量的55.01%;在低光强条件下[100 μmol/(m2·s)],初始氮浓度为18 mmol/L时,总蛋白质和总碳水化合物的含量达到最高,分别占干重的16.35%和37.70%,而总脂含量仅占干重10.16%。【结论】光强和初始氮浓度对双星藻生长具有较大影响,通过调节光强和初始氮浓度可有效提高双星藻目标代谢产物的积累。

    • 草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒NS66抗体制备及应用

      2020, 47(1):182-189. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190479

      摘要 (824) HTML (1034) PDF 1.19 M (1095) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV genotype Ⅲ) 104株可导致典型性草鱼出血病,对其编码片段的分析有望为临床免疫学检测提供依据。【目的】研究GCRV104株s6基因节段编码蛋白NS66的可能功能,制备良好的GCRV104株NS66蛋白多克隆抗体并分析其特异性。【方法】PCR方法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆至表达载体pGEX-4T-3,转化到大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE鉴定分析后,通过纯化获得目的蛋白。然后用纯化的pGEX-4T-3-NS66重组蛋白免疫小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,Western blot测定抗体效价,Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体特异性。【结果】SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约66 kD,大小与预期相符,主要存在于包涵体中;Western blotting测得制备的多克隆抗体效价大于1?50 000,Western blotting和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。【结论】GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了复制和组装过程,形成病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫诊断方法及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期基础。

    • >微生物工程与药物研究
    • 阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

      2020, 47(1):190-199. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190236

      摘要 (902) HTML (1311) PDF 2.06 M (1064) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成“a”系列或“b”系列的阿维菌素。【目的】探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。【方法】通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。【结果】AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min–1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min–1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min–1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。【结论】研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。

    • >药物微生物学
    • 高产洛蒙真菌素洛蒙德链霉菌高通量筛选方法的建立与复合育种

      2020, 47(1):200-209. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190297

      摘要 (907) HTML (2691) PDF 594.92 K (1154) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】洛蒙德链霉菌S015能生物合成具有广谱抗菌活性的吩嗪类化合物洛蒙真菌素。【目的】因S015菌株的洛蒙真菌素产量较低,将S015菌株经复合诱变育种和基因工程改造,提高洛蒙真菌素产量。【方法】建立洛蒙真菌素产生菌的高通量筛选方法,对出发菌株S015进行常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术和紫外复合诱变,筛选得到高产菌株;并在高产菌株上敲除洛蒙真菌素的前体分支酸竞争途径中的关键基因trpE1、trpE2,再过表达全局调控基因afsR。【结果】利用洛蒙真菌素在紫外波长375 nm处的特征吸收峰,以及洛蒙真菌素浓度和375 nm处吸光度值的正相关关系,建立了基于24孔深孔板发酵和酶标仪快速检测的高通量筛选方法。经过6轮ARTP和紫外复合诱变及高通量筛选,从4 320株突变株中筛选得到遗传稳定的高产菌株M6,其洛蒙真菌素的产量为61.33 mg/L,是S015菌株的7.35倍;M6菌株的分支途径基因trpE1、trpE2双敲株的洛蒙真菌素产量为81.89 mg/L,是S015菌株的9.82倍;在该基因工程菌株中过表达全局调控基因afsR,产量为109.53 mg/L,是S015菌株的13.13倍。【结论】建立的高通量筛选方法可以有效筛选高产洛蒙真菌素的突变株,并且操作简单快速。通过ARTP和紫外复合诱变,结合高产株M6的基因工程改造,能进一步提升洛蒙真菌素的产量。

    • 一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体分离鉴定和生物学特性研究及全基因组分析

      2020, 47(1):210-221. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190585

      摘要 (1227) HTML (1572) PDF 1.16 M (1078) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】噬菌体具有特定的杀菌能力,对生态和细菌的进化具有重要影响。近年来由于多重耐药细菌的全球出现,噬菌体疗法逐渐引起了人们的关注。【目的】对一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体vB_KpnP_IME308进行生物学特性研究、测序和比较基因组学的分析。【方法】以一株从临床分离到的肺炎克雷伯菌为宿主菌分离噬菌体,应用双层平板法进行噬菌体最佳感染复数(optimal multiplicity of infection)、一步生长曲线(one-step growth curve)、温度以及pH敏感性实验测定,纯化噬菌体并通过透射电镜观察噬菌体形态;应用标准的苯酚-氯仿提取方案提取噬菌体全基因组,使用Illumina Miseq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析。【结果】分离到一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnP_IME308;其最佳感染复数为0.001,一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为80 min,平均裂解量330 PFU/cell;噬菌体vB_KpnP_IME308在4?50 °C和pH 5.0?10.0范围内稳定;电镜观察该噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组测序结果表明,噬菌体基因组全长为43 091 bp,(G+C)mol%含量为53.9%,(A+T)mol%含量为46.1%。BLASTn比对结果表明,该噬菌体与目前已知噬菌体基因组仅84%区域有相似性。噬菌体进化树结果表明该噬菌体属于Autographivirinae亚科的Drulisvirus属的成员。【结论】从医院污水中分离鉴定了一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,表征并分析了噬菌体全基因组序列,这些结果均表明该噬菌体具有开发为抗肺炎克雷伯菌制剂的潜力,为噬菌体治疗多重耐药细菌感染奠定了基础。

    • >专论与综述
    • 卫生填埋场微生物气溶胶的逸散及潜在风险

      2020, 47(1):222-233. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190527

      摘要 (819) HTML (1161) PDF 587.79 K (1094) 评论 (0) 收藏

      摘要:随着对微生物气溶胶认识的提高,其产生、来源、扩散及风险研究获得了越来越多的关注。卫生填埋场是微生物气溶胶的重要产生源之一。本文阐述了卫生填埋场气溶胶颗粒中微生物的浓度水平、粒径分布、种群结构,解析了微生物气溶胶的逸散特征及影响因素,介绍了微生物气溶胶对人体健康的潜在风险及评价方法,并展望了未来卫生填埋场逸散微生物的研究趋势及方向,为卫生填埋场微生物气溶胶的控制与削减提供了科学依据和参考。

    • 破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究进展

      2020, 47(1):234-243. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190474

      摘要 (825) HTML (1262) PDF 377.37 K (1455) 评论 (0) 收藏

      摘要:破囊壶菌因具有高产脂肪酸的特性而受到广泛关注,然而传统的培养方式需要的原料成本很高,很大程度上阻碍了破囊壶菌的工业化进程,因此,寻找可被破囊壶菌高效利用、来源广泛并且廉价易得的生产原料成为该领域的研究重点。本文以破囊壶菌及其生产脂肪酸为切入点,综述了近年来破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究现状,总结并提出了其发展前景,以期对今后的研究有所启发。

    • 抵抗女性生殖道沙眼衣原体感染的免疫新策略

      2020, 47(1):244-252. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190183

      摘要 (1046) HTML (1536) PDF 560.89 K (916) 评论 (0) 收藏

      摘要:沙眼衣原体是引起沙眼和泌尿生殖道感染的主要病原体。据世界卫生组织2015年统计,全球每年约有1.3亿沙眼衣原体感染新发病例。研究表明CD4+Th1型细胞免疫应答在抵抗沙眼衣原体感染中发挥着重要作用。因此,研究者依照抗沙眼衣原体感染的免疫应答特点,构建出许多候选疫苗,但都没有成功地应用于临床。近年研究发现,生殖道黏膜组织不仅存在体液免疫和细胞免疫,还驻留着一些引人注目的免疫细胞,提示增强黏膜免疫可作为预防沙眼衣原体感染的潜在途径,是抵抗生殖道沙眼衣原体感染的免疫新策略。本文全面概述了黏膜免疫与女性生殖道沙眼衣原体感染的研究进展,并为今后研制沙眼衣原体疫苗提供一些建议。

    • 肠道微生物蛋白糖基化修饰的研究进展

      2020, 47(1):253-262. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190309

      摘要 (1135) HTML (3783) PDF 686.70 K (1159) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠道微生物在维持人体健康和诱导疾病的发展中扮演着重要角色,其蛋白糖基化修饰深刻影响着宿主的各项生命活动。本文从糖组学的角度出发,讨论并分析了肠道微生物的组成、作用,以及肠道微生物群中代表性细菌的糖基化模式及其密切相关的生理功能,发现及归纳了糖基化对肠道微生物功能和活动的调节方式,为相关疾病的研究及诊治提供了一个新的思路。

    • 肠小体在猪肠道冠状病毒感染中的研究进展

      2020, 47(1):263-271. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190343

      摘要 (988) HTML (1588) PDF 2.65 M (972) 评论 (0) 收藏

      摘要:猪肠道冠状病毒是引起仔猪腹泻的重要致病因素,主要感染小肠绒毛上皮细胞,给养猪业造成了巨大的经济损失。由于缺乏能模拟胃肠道高度复杂生理特性的体外研究模型,猪肠道冠状病毒感染与宿主肠上皮之间相互作用的研究也受到了极大的限制。随着干细胞技术的快速发展,一种能模拟肠道复杂的细胞类型及空间结构的体外模型——肠小体引起了人们的广泛关注。与传统的细胞系相比,肠小体不仅能模拟肠的结构和功能,同时还保留宿主的遗传特性,有望成为研究宿主-肠道病原相互作用的一种理想模型。本文就猪肠道冠状病毒以及肠小体在肠道病原研究中的应用进行综述,以期为猪肠道冠状病毒的基础研究提供新的思路与见解。

    • 新生隐球菌细胞通讯研究进展

      2020, 47(1):272-281. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190598

      摘要 (688) HTML (1347) PDF 590.37 K (927) 评论 (0) 收藏

      摘要:细胞通讯系统调控多细胞生物的细胞增殖与分化等多种基础生物学过程,也是调控单细胞生物群体或社会性行为的重要策略。新生隐球菌是一种重要的环境来源病原真菌,主要感染免疫缺陷人群,具有很高的致死率。作为环境致病真菌,新生隐球菌进化出丰富的环境适应性策略。新生隐球菌细胞呈现出高度的异质性和社会性,不同形态的细胞承载着不同生物学功能和病原学特征。越来越多的研究表明,通过细胞通讯系统调控其群体或社会性行为,既是新生隐球菌适应多变的外界环境和宿主环境的关键策略,也与其致病能力密切相关。本文介绍新生隐球菌中细胞通讯系统的研究进展及其在有性生殖、细胞形态转换、适应环境及宿主压力等社会性行为中的调控作用。

    • 二硝基苯胺类除草剂微生物降解研究进展

      2020, 47(1):282-294. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190213

      摘要 (853) HTML (1745) PDF 496.21 K (1000) 评论 (0) 收藏

      摘要:二硝基苯胺类除草剂是一类广谱、高效且广泛使用的除草剂,微生物的降解代谢作用是其在环境中消解的最主要因素。分离筛选除草剂的高效降解菌株、分析其降解途径并阐明其微生物降解机制,可为除草剂残留污染的微生物降解修复提供理论依据和优良的降解菌株、降解基因和酶资源。本文简述了二硝基苯胺类除草剂的微生物降解菌株、降解代谢途径和降解基因/酶的研究进展,为进一步研究该类除草剂的微生物降解及其污染生物修复提供理论依据和资源。

    • 源于微生物的海鞘天然产物

      2020, 47(1):295-304. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190436

      摘要 (882) HTML (2368) PDF 2.14 M (1130) 评论 (0) 收藏

      摘要:海洋动物是具有生物活性海洋天然产物的重要来源。海鞘中含有丰富的微生物类群,如细菌、放线菌、真菌和蓝细菌。越来越多的直接或间接证据表明,一些从海鞘中分离的天然产物并不是海鞘本身产生的,而是由其共生微生物产生的。本文对近些年来的海鞘天然产物的微生物来源的研究方法进行综述,包括可培养细菌的分离、不可培养细菌的粗提物检测、宏基因组学、全基因组测序等直接方法,以及化合物结构比对的间接方法。通过对海鞘-微生物共生体中天然产物生物合成来源的研究,不仅可以从根本上解决动物药源的问题,而且可为研究海鞘与微生物共生关系提供有力证据。

    • >高校教改纵横
    • 识“微”见远,立德树人——微生物学核心课程建设

      2020, 47(1):305-310. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190437

      摘要 (848) HTML (979) PDF 392.35 K (1192) 评论 (0) 收藏

      摘要:微生物学作为生物学专业的基础课,在构建学生知识体系、课堂价值观引领方面具有重要作用。为实现“金课”建设目标,微生物学理论课在建设过程中,秉承着夯实基础、注重前沿的理念,在课程内容设计上注重不同课程的衔接和过渡,在教学方法上通过开展特色专题讲座、建设精品教材、应用“对分易”平台、举办“我是主讲人”等活动,以识“微”见远的理念,提升教学质量,延伸教学效果。与此同时,深刻认识到对人才培养而言,既要育智,更要育人。因此在教学中注重结合专业内容,激发学生的社会责任感和使命感;以榜样力量给予学生学习的目标与指引,立德树人,进而实现课程全方位育人的目标。

    • >生物实验室
    • 三种猕猴桃根腐病致病菌多重实时定量PCR检测技术的建立及应用

      2020, 47(1):311-321. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190410

      摘要 (845) HTML (1131) PDF 774.57 K (1065) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】近年来,随着猕猴桃种植面积的不断扩大,病害的频繁发生已逐渐影响猕猴桃的产量和品质。恶疫霉(Phytophthora cactorum)、樟疫霉(P. cinnamomi)和雪松疫霉(P. lateralis)是一类可以引起猕猴桃根腐病的致病疫霉菌。【目的】建立并优化可以同时检测3种致病疫霉的多重实时定量检测技术,并调查猕猴桃主要产区的致病菌分布情况。【方法】基于Ypt1 (ras-related protein gene)基因设计恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉的特异性TaqMan探针和引物,建立并优化多重实时荧光定量PCR检测体系。利用近缘种检验检测体系特异性并进行灵敏度测试,应用该检测体系分析猕猴桃主要产区根际土壤中3种致病疫霉的Ypt1基因含量。【结果】供测试的11个恶疫霉近缘种、11个樟疫霉近缘种、13个雪松疫霉近缘种及非目标菌种DNA样品中均无荧光信号,反应结果为阴性,而在恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉DNA样品中分别检测出HEX、FAM和ROX荧光信号,反应结果为阳性。三种疫霉的检测灵敏度均达到100 fg。此外,通过对猕猴桃主产区陕西省周至县和眉县果园共166份土壤样品的检测发现,恶疫霉的分布最广泛且Ypt1基因含量最高,樟疫霉和雪松疫霉则相对较少。【结论】建立的猕猴桃根腐病致病疫霉多重实时定量检测体系特异性强、灵敏度高,适合于恶疫霉、樟疫霉和雪松疫霉的检测及定量分析。该技术可为猕猴桃疫霉病害的早期诊断、监测及预防提供指导。

    • 一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

      2020, 47(1):322-329. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190141

      摘要 (1126) HTML (1693) PDF 641.55 K (973) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。【目的】制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。【方法】构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。【结果】通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。【结论】构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。

    • 检测牛冠状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

      2020, 47(1):330-338. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190422

      摘要 (987) HTML (1690) PDF 1.05 M (1010) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛死亡的主要病原之一,有效的检测手段是防治该病的前提。目前BCoV ELISA检测方法存在敏感性低、不稳定等缺陷。【目的】对原有BCoV ELISA方法进行改进,建立间接ELISA检测方法。【方法】应用我国BCoV流行毒株CD株n基因为模板,预测N蛋白抗原表位,通过原核表达制备可溶性的重组N蛋白作为抗原,建立间接ELISA方法,应用该方法对黑龙江省2010?2017年的BCoV感染进行血清流行病学调查。【结果】该ELISA方法最佳工作条件为:用50 mmol/L pH 9.6碳酸盐作为包被液,抗原包被浓度2.5 μg/mL;用PBST作为样本稀释液,稀释浓度1:50,37 °C孵育1.5 h;HRP-羊抗牛IgG稀释浓度1:7 500,37 °C孵育1.0 h;用1%明胶37 °C封闭30 min。阴阳性临界值为0.225。该方法与BRV、BRSV、BVDV、IBRV、BPIV3和E. coli阳性血清均无交叉反应。批内和批间变异系数均小于10%,与病毒中和试验的符合率高达93.5%。对黑龙江省部分地区共603份奶牛血清样品检测结果显示,BCoV抗体阳性率为98.84%。【结论】建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、稳定性好,为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础。

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