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摘要:【目的】N-乙酰神经氨酸有多种生物学功能, 其在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值。N-乙酰神经氨酸现有的生产方法产量低、成本高, 难以满足医药工业大规模的需求, 因而急需建立一种经济高效的生产方法。【方法】在前期研究中, 构建了一株产N-乙酰神经氨酸的代谢工程菌(Escherichia coli ΔnanTEK/pNA), 本研究通过单因素试验对工程菌生物转化生产N-乙酰神经氨酸的过程进行优化, 包括工程菌细胞培养条件(培养温度和时间)和全细胞生物转化的各种条件(转化温度、时间、表面活性剂等)。【结果】经过条件优化后, 建立了全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程, 使N-乙酰神经氨酸的产量提高到294.39 mmol/L。【结论】该方法具有操作简便、高效和经济的优势, 为N-乙酰神经氨酸的规模化生产奠定了基础。

摘要:【目的】研究樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea) CAU521利用农业废弃物固体发酵产木聚糖酶的发酵条件。【方法】采用单因素试验法优化影响菌株产酶的各个条件, 包括碳源种类、氮源种类、初始pH、初始水分含量、培养温度及发酵时间共6个因素。【结果】获得的最佳产酶条件为: 稻草为发酵碳源、2% (w/W)的酵母提取物为氮源、初始pH 7.0、初始水分含量80%和发酵温度45 °C。在此条件下发酵6 d后木聚糖酶的酶活力达到13 120 U/g干基碳源。【结论】樟绒枝霉固体发酵产木聚糖酶的产酶水平高, 生产成本低, 具有潜在的工业化应用前景。

摘要:【目的】分离鉴定煤矸石中耐Cd2+菌株。【方法】用菌落形态和18S rRNA序列分析鉴定菌株, 研究菌株的重金属耐性和在酸性煤矸石浸出液的生长能力, 分析其抗氧化酶活性对重金属复合污染的响应。【结果】BJKD4菌株为青霉属(Penicillium sp.)菌, 能耐29 mmol/L的Cd2+, 不同重金属对BJKD4的毒性大小依次为: Cu2+>Ni2+>Cd2+>Pb2+或Zn2+>Mn2+。正交试验表明BJKD4菌株能在不同浓度重金属Cd、Zn、Ni和Mn等复合污染条件下生长, SOD活性在重金属复合污染时升高, CAT活性变化依重金属的种类和浓度不同而不同; 此外, BJKD4能在含有煤矸石酸性浸出液的培养基中生长, 并提高其pH。【结论】BJKD4菌株能耐多种重金属, 具有阻止煤矸石山淋溶液酸化的应用潜力。抗氧化酶在减缓重金属诱导的氧化胁迫中起重要作用。

摘要:【目的】从一株白腐菌Trametes sp. SQ01中获得一种新型的锰过氧化物酶, 探讨该酶的底物特异性和对过氧化氢的耐性, 以及其对三苯甲烷类染料的脱色能力。【方法】通过丙酮沉淀和DEAE-cellulose 52柱层析法纯化锰过氧化物酶。利用UV-2010紫外可见分光光度法研究锰过氧化物酶对过氧化氢的耐性, 同时, 用紫外可见分光光度计对三苯甲烷类染料脱色效果进行分析。【结果】通过两步纯化, 获得了均一性的锰过氧化物酶。该酶的最适pH和温度分别是4.5和70 °C, 在pH 3.0?8.0时, 酶活相对稳定。该酶在二价锰离子存在下能够氧化2,6-二甲氧基苯酚、愈创木酚、2,2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)和过氧化氢等化合物, 同时也能作用二价锰离子。在与这些底物反应中, 最适底物为过氧化氢(Km为3.7 μmmol/L)。该酶具有抗过氧化氢漂白能力, 锰过氧化物酶与高浓度的过氧化氢(2.5 mmol/L)作用60 min后仍能保持70%的活性。在所测试的染料中, 锰过氧化物酶对结晶紫的脱色率最高达到65.8%。二价锰离子和过氧化氢对锰过氧化物酶脱色能力的影响进行研究, 与孔雀绿相比, 锰离子和过氧化氢对活性艳蓝脱色的影响很小。【结论】Trametes sp. SQ01锰过氧化物酶对过氧化氢的耐受性, 以及对三苯甲烷类染料的高效脱色能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景。

摘要:【目的】研究气单胞菌菌株分类情况, 并分析其致病性。【方法】采集环境样品和鱼类标本, 分离并鉴定气单胞菌菌株, 并运用多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)方法进行分类研究, 利用PCR和测序方法分析毒力基因Aera、Hly、Aha1、GCAT和Nuc的分布。【结果】通过对分离菌株的16S rRNA基因进行分析, 确认属于4种不同气单胞菌的7个分离株。发现所有菌株至少有1种毒力基因阳性, 其中3株具有4种毒力基因。药物敏感实验显示, 6株分离株对3种或3种以上抗菌素具有多重耐药性。最后, 对看家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA进行分析, 与MLST数据库中的等位基因序列比对, 发现7株分离株均为新的不同的序列型(Sequence type, ST)。【结论】气单胞菌具有较高的遗传多样性。

摘要:【目的】分离筛选并鉴定产纤溶酶的菌株。【方法】采用血粉培养基富集, 琼脂糖-纤维蛋白平板筛选, 从自然界中分离筛选出一株产纤溶活性物质的菌株。通过形态学特征、生理生化特征研究, 并结合16S rRNA基因序列分析及分子系统发育树的构建结果, 确定菌株的种类。【结果】从自然界分离筛到一株产纤溶酶的菌株EF608, 经鉴定该菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。SDS-PAGE和纤维蛋白自显影表明该纤溶酶的分子量为37 kD, 最适反应温度和pH分别为35 °C和7.5, EDTA能完全抑制其纤溶活性, 而PMSF对其活性无抑制作用。菌株EF608发酵液不仅可以直接水解纤维蛋白, 而且具有体外溶栓的作用, 对血红细胞没有溶解作用。【结论】筛选到一株具有纤溶活性的粪肠球菌——EF608, 为获取新型纤溶酶提供了一种的新的菌源。

摘要:【目的】研究蛭弧菌类菌株JU-PX1的噬菌特性、形态特征, 并分析16S rDNA序列从而对其进行种属鉴定。【方法】采用双层平板法和三角瓶培养法研究蛭弧菌类菌株JU-PX1的噬菌特性, 通过光镜和电镜观察其形态, 利用16S rDNA序列的蛭弧菌类特异性引物以及细菌通用引物进行PCR扩增。【结果】JU-PX1对10株宿主菌中的6株具有噬菌作用, 特别对大肠杆菌和副溶血弧菌侵噬能力较强。菌体呈弧状或杆状, 单极鞭毛, 大小为(0.2?0.5) μm×(0.8?1.2) μm, 在其增殖阶段也有长约3.2 μm的较长个体。扩增后分别获得了一段长为831 bp和1 515 bp的DNA序列, 进一步通过NCBI BLAST和MEGA?5.10等软件分析并构建了系统发育树。【结论】蛭弧菌类菌株JU-PX1属于噬菌弧菌属(Bacteriovorax), 与海岸噬菌弧菌(Bv. litoralis)亲缘关系最近, 两者的16S rDNA序列相似性为93%。

摘要:【目的】研究羰基还原酶基因的克隆、表达及其在不对称生物催化中的应用。【方法】对羰基还原酶氨基酸序列进行Blast推导出核苷酸序列, 设计引物, 以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus) CGMCC 2.1977全基因组为模板, 通过PCR扩增目的片段, 与载体pET-28a连接, 转化大肠杆菌获得重组菌BL21(DE3)-(pET28a-cMCR)和Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)。【结果】扩增的序列与已报道的mer序列有100%同源性, 全长1 038 bp, 共编码345个氨基酸。目的蛋白在Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)得到了高效表达, 大小为42 kD。该酶最适反应温度为40 °C, 最适反应pH是8, 热稳定性与pH稳定性较差。Ca2+对酶活具有明显的激活作用, 且浓度为0.5 mmol/L时效果最好。重组菌可还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE], 光学纯度为100%, 转化率为81.0%。重组菌在制备度洛西汀关键中间体(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-(2-噻吩)-l-丙胺[(S)-DHTP]中也得到初步应用。【结论】从菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus) CGMCC 2.1977中克隆获得了羰基还原酶基因, 在大肠杆菌中成功表达, 并可应用于不对称还原。

摘要:【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeya sp. DCE-01的果胶裂解酶基因并进行原核表达, 对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物, PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1和pACYCDuet-1载体上, 导入E. coli BL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后, 采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶, 研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel (GenBank登录号: JX964997), 其序列全长1 128 bp, 编码375个氨基酸。pACYCDuet-1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高, 发酵液粗酶活达298.8 IU/mL。其最适反应温度为50 °C, 最适pH为9.0; 保温1 h, 酶活稳定温度≤45 °C, 稳定pH为9.0?10.0。酶催化作用依赖于Ca2+, 其最适作用浓度为2?mmol/L; Zn2+、Ca2+和NH4+促进酶活力, Fe3+和Pb2+严重抑制酶活力; 聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因, 其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。

摘要:【目的】通过优化生防菌CNY-04的培养条件, 提高其对灰霉病菌的抑菌效果。【方法】在单因素试验的基础上, 利用响应面法(Response surface methodology)对灰霉病生防菌CNY-04培养条件进行整体优化, 并测其生长曲线。【结果】生防菌CNY-04最优培养条件为牛肉膏0.5%、蛋白胨2.0%、酵母膏0.1%、葡萄糖0.5%、时间48 h、接种量4%、温度32 °C、pH 8.0、装液量75 mL/250 mL和转速150 r/min, 在此培养条件下生防菌CNY-04的OD600为2.907, 与模型预测值相符, 对灰葡萄孢菌的抑菌圈直径为44.5 mm, 较优化前提高了30.9%。【结论】从整体上确定了生防菌CNY-04的最优培养条件, 为该菌扩大化生产提供理论基础。

摘要:【目的】研究12株杜鹃花类菌根(Ericoid mycorrhiza, ERM)真菌对2 a生桃叶杜鹃无菌实生幼苗促生效应及叶片叶绿素、光合参数和叶绿素荧光参数的影响。【方法】采用温室盆栽试验, ERM真菌菌株由野生桃叶杜鹃根系分离而得。【结果】表明接种苗侵染率较高。接种处理间在幼苗地上部分、地下部分干重与总生物量指标呈极显著差异(P<0.01)。与不接种对照相比, 叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量、叶片净光合速率Pn、叶片气孔导度Gs和叶片蒸腾速率Tr显著提高, 而叶片胞间CO2浓度Ci则降低。接种幼苗叶片中实际量子产量ΦPSⅡ除菌株TY19、TY24和TY34低于对照外, 其余均显著增加; PSⅡ电子传递速率ETR、PSⅡ最大光化学量子产量Fv/Fm、潜在活性Fv/Fo和光化学淬灭qP均显著提高; 非光化学淬灭NPQ除菌株TY29外其它均高于对照, 并与对照差异极显著(P<0.01)。ΦPSⅡ与Pn、Gs的相关性大于Fv/Fm、qP、NPQ; ETR与Fv/Fm、Fv/Fo、NPQ、Pn、Tr的相关性大于qP和Gs; Pn与Gs的相关性大于Tr, 与Ci显著负相关(P<0.01)。【结论】通过接种处理, 提高了叶片光合性能及叶绿素荧光参数, 增强了植株对有效光的利用, 显著增加了幼苗生物量。从综合接种效应来看, TY18、TY29、TY35、TY02、TY07和TY12是培育桃叶杜鹃菌根苗优良备选菌株。

摘要:【目的】在对中国传统优势浓香型白酒产业中重要功能微生物华根霉菌株CCTCCM201021全基因组测序的基础上, 以生物信息学的方法和手段主要针对真菌毒素的合成代谢途径及关键基因进行分析, 考察微生物在食品工业应用中的安全性。【方法】应用Illumina平台Solexa测序技术对华根霉进行基因组测序, 运用SOAPdenovo组装软件进行拼接, 并进行一系列生物信息分析, 考察根霉素、小孢根霉素及典型丝状真菌毒素代谢的主要途径及相关基因, 包括PKS、NRPS与PKS-NRPS混合代谢途径; 萜类化合物代谢和其他代谢途径等, 判断华根霉是否具有产真菌毒素的潜在危害性。【结果】测序结果表明华根霉全基因组大小为45.70 Mb左右, GC含量为36.99%。通过基因预测软件分析得到基因17 676个, 共注释基因13 243个。通过进化树与同源基因比较分析, 与目前基因组测序完成的仅有的3株接合菌基因组相比, 序列相似性普遍偏低, 与华根霉存在较为显著的差异, 但同源基因的相似性在60%左右。代谢分析表明, 华根霉中仅存在较少聚酮合成、萜类化合物合成途径代谢基因, 存在大量异源物质降解途径基因。【结论】华根霉基本不具备产目前已知的真菌毒素的关键基因或合成能力, 可以认为其发酵产品是相对安全的。在酿造过程中, 不仅可作为糖化菌, 在混菌发酵时, 对部分具有抑菌能力的抗生物质具有降解功能, 是发酵工业中应用的相对安全的重要生产菌。

摘要:【目的】建立里氏木霉(Trichoderma reesei)高产突变菌株的快速筛选方法, 选育出高产内切葡聚糖酶的突变株。【方法】对里氏木霉T306菌株的初筛培养基进行优化, 建立快速筛选方法; 通过紫外诱变手段选育内切葡聚糖酶高产突变菌株, 并对突变菌株的产酶培养基进行优化。【结果】在初筛培养基中添加浓度为0.1% (w/v)的乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选。诱变后筛选出菌落形态发生明显变化的内切葡聚糖酶高产突变株0516, 其羧甲基纤维素酶活力(CMC酶)较出发菌株提高了38.9%。其产酶培养基经优化后, 得到最适碳、氮源分别为: 乳糖1.50%、硫酸铵0.14%、尿素0.05%、蛋白胨0.10%, 优化后CMC酶活力达64.2 U/mL, 较优化前提高了2.3倍。【结论】建立了里氏木霉高产突变菌株的快速筛选方法, 通过紫外诱变育种获得了产内切葡聚糖酶能力高且遗传稳定的突变株0516。

摘要:【目的】观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性。【方法】工程菌连续传代50代, 通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查, 全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性。【结果】各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段; 各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20%左右; 透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性; 革兰染色显示为阴性杆菌; 各项生化检测结果与原始菌种无显著差异。【结论】该菌种生物学特性稳定, 可作为生产用菌种。

摘要:【目的】检测铜绿假单胞菌基因pfm对三型分泌系统效应蛋白的影响。【方法】构建pfm基因互补菌株pfmC。提取野生株PAO1、敲除株Δpfm和互补株pfmC的RNA, 利用Real-time PCR从转录水平检测效应蛋白ExoS、ExoT和ExoY转录水平的变化。以ExoS为代表, 检测细胞内和分泌到细胞外效应蛋白的含量。收集铜绿假单胞菌PAO1、Δpfm和pfmC菌体内和分泌到细胞外的总蛋白, 利用ExoS多克隆抗体进行western杂交, 特异检测ExoS的蛋白水平。【结果】与野生型相比, Δpfm中exoS、exoT和exoY转录水平明显降低, 而pfmC中这3个蛋白的转录水平得到回补。Δpfm菌体内和分泌到细胞外的ExoS量均明显低于野生株PAO1, pfmC细胞内和细胞外分泌的ExoS蛋白量均得到恢复。【结论】铜绿假单胞菌基因pfm会影响三型分泌系统效应蛋白的水平。

摘要:DNA条形码(DNA barcoding)技术作为一门新兴的物种鉴定方法以其灵敏、精确、方便和客观的优势, 在动植物和微生物的分类鉴定中已经得到广泛应用。真菌鉴定中常用作标准条形码的是核核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS), 如今也有一些新型条形码被发现和应用到实际操作中, 如微条形码、ND6、EF3。本文对DNA条形码技术的产生和发展做出了总结, 通过研究其在真菌中应用的实际案例分析了DNA条形码技术的优缺点及发展趋势, 并指出DNA条形码技术将以全新的视角来弥补传统分类学的不足, 最终实现生物自身的序列变异信息与现有形态分类学的结合。

摘要:本文介绍近十几年以来大庆油田利用具有产气、降解原油、产生物表面活性剂及堵调性能的菌剂, 通过地下发酵, 开展微生物采油现场试验取得的进展。分析了该项技术适用的油藏条件和应用特点。截止到2012年底, 应用微生物采油技术增产原油达12×104 t。其中微生物单井吞吐518口, 累计增油6.3×104 t, 实施微生物驱和调驱项目10项(45个井组), 累计增油5.7×104 t, 为大庆油田稳产发挥了重要作用。

摘要:高致病性猪链球菌2型的致病机制仍是未解之谜。毒力岛不仅赋予病原菌特殊的致病能力, 而且在细菌的适应性进化过程中扮演重要角色。对猪链球菌2型89K毒力岛功能性基因的深入剖析有助于更全面地掌握病原菌的致病特性。综述了猪链球菌2型89K毒力岛的结构与进化过程, 以及国内外对毒力岛中二元信号转导系统、IV型分泌系统、ABC转运蛋白、毒素-抗毒素系统等重要基因的研究进展, 力图从基因水平为猪链球菌2型的致病机制寻找突破口。

摘要:丝状真菌在工业、农业、医药等领域具有重要经济价值, 一些亦可导致人类及动、植物疾病, 造成经济损失。G蛋白信号途径是真核生物中普遍存在的细胞跨膜信号转导途径。近年来, 丝状真菌中G蛋白信号途径的研究发展很快, 相关报道表明该信号途径参与感应并传递多种胞外信号刺激, 对丝状真菌的生长、分化、繁殖、致病性及真菌毒素等次生代谢产物合成有重要的调控作用。本文就丝状真菌中G蛋白信号途径的基本组成及其生理功能的研究现状进行简要综述。

摘要:介绍“半自助式”教学模式提出的背景、涵义和研究理念, 明晰该模式的实施方案和考核评分体系。以《生物工艺学》课程的教学组织为典型案例, 分四个阶段介绍如何通过实践题目的布置引出课程内容体系, 如何安排基础知识学习, 如何将基础知识应用于具体生物工程产品生产以及如何做生产工艺的工厂设计, 分析成效, 以期为生物工程类课程教学提供一种新型教学模式, 提高学生工程实践能力。

摘要:【目的】建立一种新型的军团菌鉴定方法, 并探讨该法在鉴定环境水源和临床标本军团菌菌株中的应用价值。【方法】根据军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物, 以分离培养得到的可疑军团菌菌株作为模板, 采用PCR法对模板扩增, 并用限制性内切酶对PCR产物进行酶切分析, 建立一种嗜肺军团菌及非嗜肺军团菌的鉴定方法。对16株嗜肺军团菌、22株非嗜肺军团菌及12株其他细菌标准菌株进行检测, 验证该方法的可靠性, 最后用该法检测广州地区分离的169株可疑军团菌菌株并进行基因测序。【结果】该PCR方法检测嗜肺军团菌及非嗜肺军团菌所有标准菌株均为阳性, 非军团菌检测结果均为阴性; 进一步的Hinf?Ⅰ酶切分析可准确的区分嗜肺军团菌标准菌株; 广州地区分离的169株可疑军团菌菌株经该法检测发现160株为军团菌, 其中79株为嗜肺军团菌, 与基因测序检测结果一致。【结论】PCR-酶切技术可快速、特异地检测军团菌及嗜肺军团菌, 适用于环境水源和临床标本可疑军团菌菌株的检测。

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摘要:【目的】对某公司6个以1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-Trichloroethane, 1,1,1-TCA)为主要污染物的地下水样品中的降解微生物Dehalobacter spp. (Dhb)进行相对定量和多样性分析。【方法】采用气相色谱法测定6个样品中1,1,1-TCA、1,1-二氯乙烷(1,1-DCA)和氯乙烷(CA)的浓度; 通过定量PCR法分别测定6个样品中Dhb占总菌的百分比; 以16S rRNA基因通用引物和Dhb特异性引物扩增获得的PCR产物构建了6个样品的Dhb特异性克隆文库, 所得序列与GenBank中的最相似序列构建系统发育树。【结果】6个样品中均有1,1-DCA和(或) CA的检出, 推测此6处地下水中1,1,1-TCA可能存在生物降解。定量PCR结果表明, 6个样品中Dhb丰度差异较大。6个Dhb特异性克隆文库获得41条序列, 序列比对结果表明, 与它们最相似的已知分类地位的序列全部属于Dhb属。这些序列按99%的相似性被划分成7个可操作性分类单元(OTU)。其中24条序列属于OTU1, 该OTU的序列与已知能降解1,1,1-TCA的Dehalobacter sp. str. TCA1的16S rRNA基因序列相似性达98%; 文库中的3个OTU与GenBank中16S rRNA基因序列同源性最高仅为95%?96%。【结论】该污染场地地下水中存在多样性较丰富的降解微生物Dehalobacter属细菌, 它们可能与现场的1,1,1-TCA生物降解有关。

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