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摘要:【目的】获得可用于浸矿的菌株, 对其培养条件进行优化。【方法】从成都热电厂采集土样中分离得到一株菌株, 分析该菌株的形态学特征、培养特征及16S rDNA序列, 确定菌株的分类地位。利用Design-Expert软件中的Box-Behnken法设计实验, 通过响应面分析对初始pH值、温度、接种量和装液量4个因素进行优化, 确定其最适培养条件。【结果】获得菌株Z1, 该菌为革兰氏阴性菌, 短杆状, 经16S rDNA 鉴定为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans, 简称At. f)。确定菌株最适培养条件为: pH 1.8、温度30 °C、接种量14%、装液量250 mL摇瓶装60 mL培养液。在此条件下, Z1的亚铁氧化率可达99.7%。【结论】Z1菌株适合于生物浸矿的应用。

摘要:【目的】研究溶藻弧菌的溶血现象, 溶血素基因vah的分布及vah基因、vah启动子区对溶藻弧菌溶血活性的贡献。【方法】对46株分离自华南沿海水生动物体内和海水的溶藻弧菌环境株及溶藻弧菌标准株1.1587进行溶血实验; 比较具有溶血活性的溶藻弧菌野生株ZJ051、vah基因大肠杆菌BL21重组表达株、vah缺失突变株和基因回补株间溶血能力的差异; 检测vah基因在溶藻弧菌中的分布比较溶血株与非溶血株vah基因及上游启动子区的序列差异。【结果】47.8%的溶藻弧菌菌株产生溶血活性, 因此溶血现象普遍存在于溶藻弧菌环境株中; vah基因的表达产物具有溶血活性, vah基因缺失突变株不具有溶血活性, 而vah基因回补株恢复溶血活性。vah基因普遍存在于溶藻弧菌中, 且基因序列非常相似, 氨基酸序列完全相同, 然而不同菌株的启动子区第188?190碱基位点存在差异。【结论】溶藻弧菌vah基因是造成溶藻弧菌溶血的直接原因, 但溶藻弧菌溶血能力的差异并非是由vah基因本身差异决定, 极有可能与启动子区第188?190碱基位点相关。

摘要:【目的】研究天然群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitors, QSI)分子对海洋生态功能菌生物膜形成的影响。【方法】以对污损生物幼虫附着具有诱导作用的海洋细菌为目标菌, 通过在其生物膜的形成过程中添加天然群体感应抑制剂, 研究其对目标菌成膜细菌数和浮游细菌数、生物膜形态以及生物膜表面胞外多糖含量的影响。【结果】呋喃酮和吡啶在50 mg/L时, 对8株目标菌的成膜有显著的抑制作用, 抑制率在80%左右, 吲哚、青霉烷酸和香豆素在较高浓度800 mg/L才有比较好的抑制活性。生长抑制实验结果显示, 同等浓度下, QSI分子对目标菌成膜的抑制活性明显高于其对浮游细菌生长的抑制活性。结果表明, QSI分子主要通过干扰目标菌群体感应系统以抑制生物膜的形成。【结论】研究证实QSI分子在海洋菌生物膜形成过程中具有一定的调控作用。通过添加QSI可能能够间接抑制由生物膜诱导的污损生物附着, 从而以新的角度研制新型抗污损物质。

摘要:【目的】研究海水养殖池塘中投放以芽孢杆菌和假单胞菌为主的一种自主研发的微生态制剂对池塘养殖生物、微生物菌相、浮游生物的影响, 以期为建立微生物生态调控技术体系提供参考。【方法】实验期间, 每隔15 d于试验池塘中泼洒微生态制剂一次, 每月末取样测量水体和底泥中异养菌和弧菌密度、浮游生物种类和密度, 实验结束时测量养殖生物的生长率和成活率。【结果】该微生态制剂能够显著提高南美白对虾和三疣梭子蟹的存活率和生长速度, 试验组南美白对虾的存活率和体重增长率较对照组分别提高了11.3%和1 400%, 试验组三疣梭子蟹的存活率和体重增长率较对照组分别提高了1.2%和37.5%; 微生态制剂能够显著提高海水池塘的异养菌总数, 从而抑制致病性弧菌的数量, 试验组池水和底泥的异养菌平均密度在整个养殖期较对照组提高了58.5%和51.3%, 而试验组水体中致病菌——弧菌的数量在整个养殖期较对照组降低了39.7%; 微生态制剂使绿藻门和硅藻门的藻类密度明显增加, 对蓝藻和甲藻的生长有抑制作用。【结论】该微生态制剂能够有效地改善养殖池塘中生物群落结构, 提高某些养殖品种的生长速度。

摘要:【目的】评价白腐真菌Bjerkandera adusta XX-2处理孔雀石绿染料废水的能力, 为其在染料废水中的应用提供参考依据。【方法】采用批次实验在开放条件下研究通气、pH、温度、染料初始浓度、培养时间、碳源、氮源、金属离子、盐度等因子对该菌降解孔雀石绿的影响。同时利用植物萌发、微生物抑菌和水生动物致死实验对降解产物进行毒性测试。【结果】B. adusta XX-2菌株在开放的非灭菌条件下也能高效降解孔雀石绿。例如, 在初始浓度为120 mg/L且以孔雀石绿为唯一营养源的条件下降解率也能达到60%。静置培养和摇动培养呈现出几乎相同的降解率, 这可以为技术应用节约动力成本。最适降解pH与温度分别为7.0和25 °C。在上述参数体系的优化基础上, 分别进行了碳源、氮源与金属离子的添加优化实验, 结果显示低浓度的碳源(如柠檬酸钠)、氮源(如氯化铵)和金属离子(如Zn2+)均可大大提高B. adusta XX-2对孔雀石绿的脱色效率。同时B. adusta XX-2的降解也能在很高的盐浓度下进行。毒性测试表明降解后的染料对植物、微生物、水生生物的毒性大大减少。【结论】B. adusta XX-2菌株在处理染料废水方面具有很大的应用潜力。

摘要:【目的】丰加霉素(Toyocamycin)是核苷类抗生素家族的重要成员, 其在农业植物病害防治领域具有巨大的应用价值。为改善丰加霉素生产菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)发酵过程溶氧限制, 旨在实现vgb在S. diastatochromogenes 1628中的表达以促进丰加霉素的生物合成。【方法】首先以gfp为报告基因检测红霉素抗性基因启动子Perm*在S. diastatochromogenes 1628中的转录活性, 再利用PermE*实现vgb的异源表达。【结果】在荧光显微镜下, 重组菌1628-GFP菌丝可发出稳定明亮的绿色荧光, 表明启动子PermE*在菌株1628中可有效启动外源基因的表达; 通过一氧化碳结合差光谱分析显示VHb具有生物学活性; 摇瓶实验表明: 与原始菌株相比, 重组菌可促进丰加霉素产量的提高, 在中度和高度限氧条件下促进效果尤为明显, 提高幅度分别为48.9%和104.5%。PCR和发酵效价检测显示重组菌具有良好的遗传稳定性。【结论】成功实现了vgb在S. diastatochromogenes 1628中的表达, 有效提高了其丰加霉素的合成水平, 为丰加霉素的工业化生产提供了基础条件。

摘要:【目的】为明确根癌拮抗放线菌G-19的抑菌活性物质。【方法】采用Sephadex LH-20柱层析、高效液相色谱及中压制备色谱等技术, 对桃根癌拮抗放线菌G-19发酵液中的抑菌活性成分进行分离纯化, 并通过LC-MS、NMR对其结构进行鉴定。【结果】分离得到化合物G-19-I的结构为邻苯二甲酸二丁酯(DBP), 化合物G-19-II的结构为2-(4-羟基苯基)-3,4-二氢-2H-苯并吡喃-3,4,5,7-四醇, 俗称无色天竺葵素。【结论】阐明了放线菌G-19抑菌活性成分的物质基础。

摘要:【目的】筛选一株低温产纤维素酶菌株并进行鉴定, 初步探索其酶学性质, 为微生物肥料生产筛选菌种资源。【方法】常温条件下, 采用CMC-刚果红染色法初筛纤维素降解菌株。采用低温条件诱导的方法, 筛选耐低温且产纤维素酶能力最强的菌株, 经形态学、生理生化特征试验、ITS序列等方面分析系统分类地位。单因素试验确定温度、pH及金属离子对纤维素酶活力的影响。【结果】从秸秆还田土壤中分离出一株在13 °C低温环境下高效分解纤维素的真菌M11, 鉴定M11为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。发酵试验表明: 以玉米秸秆粉为唯一碳氮源, 13 °C、200 r/min摇床发酵培养9 d时, 纤维素酶活力最高为33.08 U/mL。对其酶学性质初步研究表明: 该酶最适pH为5.0, 最适反应温度为20 °C, 在5 °C?20 °C间酶活力仍能保持在90%以上。【结论】Penicillium oxalicum M11是一株高效的纤维素降解菌株, 在低温条件下可分泌纤维素酶且活性显著, 具有潜在的开发价值。

摘要:【目的】研究筛选得到的低温乳酸菌复合菌系(LAC-1)的最佳培养条件及应用于玉米干秸杆微贮的效果。【方法】通过连续限制性培养的方法, 以pH为指标进行低温乳酸菌复合系的筛选; 利用单因素试验、Box-Benhnken试验设计和响应面的分析方法对低温乳酸菌复合系的培养条件进行优化。【结果】筛选获得培养液pH下降迅速、变化稳定及接种干玉米秸杆后可降低发酵体系pH、提高发酵饲料感官品质的低温乳酸菌复合菌系LAC-1。培养时间对LAC-1的pH降低速度影响最大, 温度次之, 接种量影响最小; 响应面分析LAC-1最佳的培养条件为培养温度9.5 °C、接种量3.3%和培养时间139 h。经过优化, LAC-1培养过程中pH下降到4.0的时间比优化前缩短48 h, 乳酸菌数提高了20.5%。LAC-1接种于干玉米秸秆发酵5 d时, 秸秆发酵体系pH降至4.1; 与对照相比, 秸秆发酵饲料可散发出甜酸香味, 外观质地松散、色泽鲜亮, 可溶性碳水化合物含量降低了?46.3%, 霉菌、恶臭醋酸杆菌和酵母菌数量显著降低, 乳酸菌数量提高了?33.3%。【结论】接种LAC-1可促进干玉米秸秆低温微贮进程, 提高饲料品质。

摘要:【目的】研究丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)真菌对红花根围微生物多样性特征的影响。【方法】对红花接种Glomus mosseae、G. intraradices和混合菌(G. mosseae、G. intraradices、G. cladoideum、G. microagregatum、G. caledonium、G. etunicatum) 3种AM真菌, 采用传统的平板稀释涂布法对红花根围细菌、真菌、放线菌进行分离、培养、计数和鉴定, 并结合单链构象多态性(Single stand conformational polymorphism, SSCP)分析技术对红花根围微生物多样性进行分析。【结果】3处理与对照组红花根围微生物总量表现为G. mosseae>G. intraradices>混合菌>对照, 且接种处理红花根围微生物总量显著高于对照。对照组红花各生长期微生物总量均为0?5 cm>5 cm?10 cm>10 cm?20 cm, 接种处理红花生长至种子成熟期时不同土层微生物数量发生变化, 微生物总量为5 cm?10 cm>0?5 cm> 10 cm?20 cm。聚类分析发现微生物出现接种红花类群与不接种红花类群两大分类类群。【结论】AM真菌从时间和空间上影响了红花根围微生物的多样性特征, 对红花农业生产和分析生态系统中微生物之间的相互作用具有重要的理论和实践价值。

摘要:【目的】调查鸡源沙门氏菌对氯霉素类药物的耐药特征和相关耐药基因的流行情况。【方法】从山东省部分地区鸡孵化场、养殖场、屠宰场分离样品进行沙门氏菌鉴定和药物敏感性试验; 设计引物, 对氯霉素类药物的耐药基因进行PCR扩增和序列分析。【结果】试验分离到印第安纳沙门氏菌, 分离率为23.28%。孵化场、养殖场、屠宰场印第安纳沙门氏菌对氯霉素耐药率分别为50.00%、83.33%和93.30%, 对氟苯尼考耐药率为83.33%、100%和100%, 对甲砜霉素耐药率为63%、65%和77%。在80株氯霉素类耐药菌株中, 54株检测到catA1基因, 74株检测到floR基因, 5株检测到cmlA基因。【结论】不同来源印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药率存在差异, catA1和floR基因广泛存在于耐药菌株中。

摘要:【目的】探究红树林土壤中聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)基因的多样性和新颖性。【方法】用Ⅰ型和Ⅱ型PKS基因酮基合成酶(Ketosynthase, KS)域的简并引物对海南清澜港红树林海莲、黄槿、银叶、老鼠簕4种红树根际土壤样品中DNA进行PCR扩增, 之后利用PCR-限制性酶切片段多样性(PCR-RFLP)和测序分析法对Ⅰ型和Ⅱ型PKS基因的多样性进行探讨。【结果】对得到的72条Ⅰ型PKS基因的酮基合成酶 (Ketosynthase, KS)域DNA序列进行PCR-RFLP分析, 共得到51个可操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTUs), 其中37个OTUs为单克隆产生, 没有明显的优势OTU。选取了26个代表不同OTU的克隆进行测序分析, 这些序列与GenBank中已知序列的最大相似率均未超过85%。KS域氨基酸序列的系统发育分析显示, 所得KS域来源广泛, 包括蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和一些未可培养细菌; 对55条PKSⅡ基因KS域DNA序列的PCR-RFLP分析后共得到25个OTUs, 有两个明显的优势OTUs, 代表的克隆子数所占比例超过10%。【结论】PCR-RFLP分析表明红树林根际土壤中存在着丰富多样的Ⅰ型和Ⅱ型PKS基因, 且前者多样性更高; 低的序列相似度表明所获得的PKSⅠ基因KS域序列独特; 系统发育分析表明得到的PKSⅠ基因来源广泛。

摘要:【目的】在链霉菌PCR-targeting系统中, 安普霉素是使用最普遍的选择标记。然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后, 在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体, 如pSET152。这常给研究带来不便, 特别是当研究对象基因如一些调控基因, 其生理功能对剂量敏感时更是如此。基于此, 拟以pSET152为基础构建一个不以安普霉素为抗性标记的通用整合型载体。【方法】利用融合PCR和λ Red重组等方法构建载体。【结果】来自pHZ1358上的硫链丝菌素抗性基因tsr和来自pCR2.1的氨苄抗性基因bla以“tsr在前bla在后”的次序融合。融合后的抗性片段替换pSET152上的安普霉素抗性基因aac(3)-IV, 从而获得新载体pGIM6626。利用该载体将删除的榴菌素最小聚酮合酶基因重新导入到Streptomyces vietnamensis突变株中, 该突变株恢复了产榴菌素的能力, 证实了该载体的有效性。【结论】构建了一个新的pSET152衍生载体pGIM6626。该载体包含氨苄和硫链丝菌素抗性基因, 分别在大肠杆菌和链霉菌中作为选择标记。pGIM6626与pSET152用途相似, 但前者由于与PCR-targeting系统不存在选择标记的冲突而与该系统更兼容。

摘要:消毒剂通过抑制膜的主动运输、抑制微生物的代谢、扰乱微生物的DNA复制、使微生物细胞裂解而导致胞内成分渗漏以及使胞内物质凝结等方面发挥灭菌作用。消毒剂在杀灭细菌和控制细菌污染方面具有重要作用, 但细菌对消毒剂也会产生抗性。细菌对消毒剂的抗性机制主要通过形成生物被膜, 阻挡或外排机制减少消毒剂分子进入细胞, 使消毒剂分子失活, 以及其他表型性耐药等4个途径来实现, 其中通过形成生物被膜阻止消毒剂分子进入细菌细胞或在进入细胞前使消毒剂失去效用, 在细菌对消毒剂的抗性机制中具有重要作用。以实际污染的主要菌株为对象, 研究它们对常用消毒剂的抗性机制, 对控制细菌污染具有极大的应用价值和现实意义。

摘要:浓香型白酒主要香气物为己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类, 白酒微生物发酵过程中酯类合成主要是酸与醇在酯化酶的作用下产生, 因此产香功能菌包括香气及其前体物产生菌和酯化酶产生菌。本文综述了浓香型白酒糟醅及窖泥主要产香功能菌的来源、组成、鉴定方法、功能特性、相互关系及其在浓香型白酒生产过程中的应用等方面的研究进展, 旨为浓香型白酒重要微生物的研究提供思路, 为其发酵过程控制提供理论依据。

摘要:微生物学是农业院校面向植物生产类和资源环境类专业的一门重要专业基础课程, 课程组在教学实践中结合课程特点, 通过树立现代教育观念、优化课程教学体系、创新教学模式、建设课程质量保证体系等改革探索, 全面推进素质教育在课程教学中的实践, 切实培养学生的学习能力、实践能力和创新能力。

摘要:【目的】摸索葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)限制性内切酶介导整合(Restriction enzyme mediated integration, REMI)的转化方法, 并构建CSS-01s (L. theobromae)的REMI转化子库。【方法】利用REMI转化方法, 将线性化的含有潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase gene, Hyg)的pUCATPH质粒转化CSS-01s菌株的原生质体; 测定其对潮霉素B的敏感浓度, 摸索不同酶解液和酶解时间对原生质体制备的影响, 统计不同限制性内切酶酶量对转化效率的影响, 以摸索出的最优条件构建CSS-01s菌株的REMI转化子库, 采用Southern blot的方法验证转化子。【结果】首次建立了一套L.?theobromae的REMI转化方法, 经转化得到包含6 000余个转化子的L. theobromae CSS-01s转化子库, 随机挑选的5个转化子经Southern blot分析, 质粒均插入到了Hind Ⅲ相应的酶切位点处。【结论】浓度为2%崩溃酶+2%蜗牛酶酶混合液、酶解4 h为原生质体获得的最优条件, 每管转化体系中加入30 U Hind Ⅲ时转化效率最高, 该方法可以用来获得大量不同表型的REMI转化子。

摘要:【目的】建立基于分子马达技术的简便快速的分子分型方法, 对携带和非携带毒力基因的副溶血性弧菌进行快速分类。【方法】以F0F1-ATPase为核心构建分子马达, 以副溶血性弧菌毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶基因设计4个探针。通过生物素-亲和素系统将探针与分子马达连接构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器, 对10株副溶血性弧菌分离株进行分类, 并与PCR-电泳-凝胶成像结果进行比较; 同时对生物传感器的检测灵敏度和特异性进行研究。【结果】10株试验菌株中10株tdh阳性, 0株trh阳性, 而10株菌都携带tlh和toxR, 与PCR-电泳-凝胶成像结果一致; 分子马达生物传感器的最低检测限为1 pg/反应体系, 且能够对副溶血性弧菌特异性识别, PCR-电泳-凝胶成像方法的最低检测限为10 pg/PCR反应体系。【结论】建立了基于分子马达的分子分型方法, 能够对副溶血性弧菌的致病性进行快速诊断, 检测灵敏度比PCR-电泳-凝胶成像方法高了10倍, 而且特异性非常高。该方法简便、快速、省时、省力, 适用于地方疾控部门和口岸检疫部门的基层实验室开展副溶血性弧菌监测和流行病学溯源工作。

摘要:【目的】建立布鲁氏菌的16S rDNA序列分析方法, 评价该方法鉴定布鲁氏菌的特异性和实用性。【方法】用PCR扩增布鲁氏菌的16S rDNA片段, 将扩增的产物纯化后测序, 从GenBank下载与布鲁氏菌易发生血清学交叉反应的细菌的16S rDNA序列。使用DNAMAN软件进16S rDNA序列相似性分析。【结果】在布鲁氏菌中16S rDNA核苷酸序列相似性达到了99.74%, 而与其他有血清型交叉反应的菌株相比较, 16S rDNA序列间有显著差异。【结论】16S rDNA序列分析是一种快速、简便、特异的鉴定布鲁氏菌的方法之一。

摘要:【目的】通过将表面活性剂脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate, SD)与叠氮溴乙锭(Ethidium bromide monoazide, EMA)-PCR反应体系相结合, 建立SD-EMA-PCR鉴别副溶血性弧菌死活细胞的检测方法。【方法】依次对加入检测体系中的脱氧胆酸钠最适浓度、EMA区分死活细胞DNA的浓度范围、EMA激活光解最佳曝光时间进行优化; 确定SD-EMA-PCR方法检测副溶血性弧菌死活细胞混合体系中活细胞的最低检出限。【结果】当脱氧胆酸钠浓度≤0.5 g/L, EMA的浓度为3.2?34.0 mg/L, 曝光时间为25 min时, SD-EMA-PCR检测体系仅对死细胞DNA扩增产生抑制作用。SD-EMA-PCR检测活菌细胞的最低检出限为10 CFU/mL。【结论】死活细胞混合体系的SD-EMA-PCR检测证明该方法能够明显降低EMA-PCR漏检的死菌对检测结果造成的影响, 为完善食源性致病菌检测中死活菌细胞鉴别方法提供了一种有效途径。

摘要:【目的】更好地发掘内生菌资源, 建立有效的植物内生放线菌分离方法。【方法】比较不同消毒剂和消毒程序、样品预处理、选择性分离培养基等分离内生放线菌的效果, 通过形态及16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定。【结果】用5%的次氯酸钠处理样品4?7 min消毒效果最好; 100 °C处理样品15 min能较好地减少真菌和细菌的干扰。丙酸钠、琥珀酸钠等培养基分离放线菌出菌率较高且类群多样性丰富。【结论】植物样品表面消毒干燥后, 100 °C处理15 min, 用无菌搅拌杯打碎, 直接撒植物于分离培养基中的分离方法效果较好。

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摘要:【目的】研究禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)江苏、安徽分离株的优势血清型, 并分析其生物学特性。【方法】对分离自病禽的细菌进行鉴定, 采用玻片凝集法测定禽致病性大肠杆菌的血清型, PCR方法检测14种毒力基因的分布, 采用美国临床和实验室标准化研究所的方法进行药物敏感性检测, 改良结晶紫半定量法检测分离细菌的生物被膜形成能力。【结果】共分离到禽致病性大肠杆菌56株, 血清型检测结果表明, O78血清型占64.29%, 为主要血清型。毒力基因检测显示,? fimC、pfs、ompA和luxS的阳性率超过90%。药物敏感性检测显示, 58.93%的菌株对8种以上的药物耐受。生物被膜检测显示, 有16株细菌生物被膜形成能力为中等以上, 其中68.75%的菌株耐8种以上的药物。【结论】O78为主要流行的血清型。fimC、pfs、ompA和luxS基因为APEC保守基因。多重耐药性仍很普遍, 细菌生物被膜与耐药性具有相关性。

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