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摘要:【目的】克隆灰葡萄孢分生孢子产生相关基因, 并研究其功能, 为进一步研究灰葡萄孢分生孢子产生机理和灰葡萄孢侵染及致病机理奠定基础。【方法】通过筛选灰葡萄孢ATMT突变体库, 获得一株不能产生分生孢子的突变菌株BCt78, 采用PCR和Southern Blotting技术, 对突变菌株BCt78进行分子鉴定。利用TAIL-PCR技术获得T-DNA插入位点的侧翼序列; 将所获得侧翼序列与灰葡萄孢基因组数据库中的已知基因序列进行BLAST分析, 推测出T-DNA的插入位点; 通过PCR进一步验证T-DNA的插入位点, 利用RT-PCR技术确定突变基因; 最后对突变菌株的菌落形态、生长速度、胞壁降解酶活力、粗毒素的生物活性、对番茄叶片的致病能力及部分致病相关基因的表达情况进行研究。【结果】TAIL-PCR结果证实T-DNA插入到灰葡萄孢BC1G_12707.1基因的ATG起始密码子区; RT-PCR结果证实突变基因为BC1G_12707.1, 该基因DNA全长为135 bp, 编码一个44个氨基酸的假定蛋白(hypothetical protein)。突变菌株在PDA培养基上菌落呈灰白色, 生长速度减慢, 不能产生分生孢子及菌核; 对番茄叶片的致病性增强, 且胞壁降解酶(PG、PMG和Cx)活力增强; 突变菌株中参与细胞壁降解的角质酶基因cutA和多聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg1, 信号转导途径基因(PKA1、PKA2、Bac、Bmp3), 产毒素基因BcBOT2 (sesquiterpene synthase), 漆酶基因Lac1, 跨膜蛋白基因Btp1表达都增强。【结论】BC1G_12707.1基因在灰葡萄孢分生孢子产生、菌核形成及致病力等方面起重要作用。

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摘要:【目的】研究烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因的异源表达及重组酶性质。【方法】以烟曲霉CICIM F0044总RNA为模板, 反转录合成cDNA; 再以cDNA为模板, 通过PCR扩增去除自身信号肽的脯氨酰内肽酶基因, 构建表达载体pPIC9K-PEP; 电转化酵母宿主菌Pichia pastoris GS115, 获得重组菌PEP-09; 纯化并分析重组酶性质。【结果】重组菌摇瓶发酵酶活力最高可达647.3 U/L。表达产物纯化后的分子量为63 kD左右。重组酶最适反应温度为65 °C, 有较好的温度稳定性, 在55 °C保温8 h能保留90%以上的酶活力。该酶最适pH为5.5, 在pH 3.0?9.0范围内有很好稳定性, 在pH 6.0?8.0的缓冲液中37 °C保温10 d酶活没有明显变化。【结论】烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达, 重组酶活性稳定, 有一定的应用潜力。

摘要:【目的】制备出含Cu2+的琼脂糖-IDA螯合载体及对其固定糖化酶工艺条件进行优化。【方法】利用金属螯合配体(IDA-Cu2+)与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理制备载体, 采用紫外分光光度法测定不同影响因素下固定化糖化酶的酶活。【结果】Cu2+的加入量和固定化过程的酸度比给酶量对固定化糖化酶的活性影响还要大, 在给酶量80?mg/g载体、1.0×10?2 mol Cu2+/g载体、pH 4.6和固定化4 h的固定化条件下, 固定化酶活为252.1 U/g, 重复使用5次后酶活为首次固定化酶活的65.1%。【结论】该Cu2+-IDA-金属螯合琼脂糖可用于淀粉水解糖化酶的优良固定化载体材料。

摘要:【目的】通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达。【方法】利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法, 在7 L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异。【结果】在相同条件下, BH128发酵产酶能力高于H238, 最高酶活可达到2 338.7 U/mL, 最大比生长速率达到0.02 h?1, 最大产物比形成速率达到944.5?U/(gDCW·h), 最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW·h), 分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍, 且发酵周期缩短了20 h。【结论】毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI, 提高了米根霉脂肪酶的产量, 而且缩短了发酵周期, 为工业化生产奠定了基础。

摘要:【目的】人类腺病毒(40/41)与人类急性胃肠炎显著相关, 被用作娱乐水体中人类病毒污染的指示生物。粪大肠菌群(FC)作为传统的细菌指示生物, 用来估计水环境中病原微生物的潜在风险。了解水传播的病原微生物的时空分布对公众健康和疾病的预防具有十分重要的意义。【方法】于2008年5月到10月, 在中国10个典型海水浴场共采集30个表层海水样品, 分别用定量PCR和细胞培养的方法分析人类腺病毒和FC。【结果】腺病毒的含量为1.7×106?1.1×108基因拷贝/L, 其阳性检出率为30%, 而普通PCR的阳性检出率为26.7%。其中7个海水浴场的FC超出了景观娱乐水质标准(2 000 CFU/L)。时间分布趋势表明, 人类腺病毒从8月份到10月份的污染较其他月份严重(p<0.05)。在该实验条件下, 不论是在同一浴场的不同站位还是在不同浴场, 腺病毒的空间分布差异都不明显(p>0.05)。同样, FC在不同浴场的时空分布也无明显差异(p>0.05), 但是其分布与离岸距离的远近显著相关(p<0.05)。此外, 在我们所研究的浴场, 细菌和病毒这两种指示生物之间并没有相关性。【结论】为避免在游泳季节胃肠道疾病的大规模爆发, 必须加强卫生设施建设和肠道细菌、病毒两种指示生物的监测。

摘要:【目的】针对水体沉积物中日益严重的多溴联苯醚污染问题, 以电子垃圾污染河床沉积物为种源富集驯化获得的菌群Cf3, 研究该菌群对十溴联苯醚的降解特性以及其菌群结构组成。【方法】通过GC-MS分析十溴联苯醚降解后低溴代产物组成, 并测定其降解率; 通过DGGE技术分析了该BDE-209降解菌群的结构组成。【结果】菌群Cf3具有较强降解BDE-209的能力, 经过120 d的培养, 初始量为2.6 μmol的BDE-209降解率达到80.03%, OD600从0.01增长到0.21, pH由初始的6.93增加到反应结束时的8.50。菌群Cf3经过单菌落分离, 共获得10株可培养细菌, 通过16S rRNA基因序列比对发现, 其中6株与柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)具有较高同源性, 其余4株与产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)较相似。进一步采用DGGE分析菌群Cf3的结构组成时发现, 除了分离得到的2个菌属外, 该菌群中还含有拟杆菌属(Wolinella spp.)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus spp.), 以及随着降解时间延长而消失的脱硫弧菌属(Desulfovibrio spp.)和醋杆菌属(Acetobacterium spp.)。【结论】获得了具有较强多溴联苯醚降解能力的菌群, 并分析了其降解特性和群落组成, 为进一步开展溴代阻燃剂等持久性有机污染物的生物修复提供宝贵的菌种资源和科学数据。

摘要:【目的】分离获得产漆酶的细菌菌株, 研究漆酶的酶学性质并应用于染料脱色。【方法】利用含铜的富集培养基筛选产漆酶细菌; 通过形态特征、生理生化试验及16S rDNA序列分析等方法进行鉴定; 以丁香醛连氮为底物测定漆酶的酶学性质; 通过测定染料在最大吸收波长下吸光值的变化评价漆酶对染料的脱色效果。【结果】从森林土壤中筛选到一株漆酶高产菌株LS05, 初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens); 菌株LS05的芽孢漆酶以丁香醛连氮为底物的最适pH为6.6, 最适温度为70 °C; 该酶具有较好的稳定性, 经70 °C处理10 h或在pH 9.0条件下放置10 d后可保留活性。对抑制剂SDS和EDTA具有一定的抗性, 在碱性条件下可有效脱色不同的工业染料, RB亮蓝、活性黑和靛红1 h内的脱色率达93%以上。【结论】Bacillus amyloliquefaciens LS05的芽孢漆酶在高温和碱性条件下稳定性强, 相对于真菌漆酶具有更好的工业应用特性, 可有效用于工业染料废水的处理。

摘要:【目的】调查秦巴山地区微生物物种的多样性, 建立用于活性产物筛选的微生物代谢产物库和菌种资源库, 通过数据库平台进行资源共享。【方法】采用不同的分离方法, 分离存在于不同生境的微生物类群, 通过形态、生理生化及分子生物手段鉴定菌种, 发酵并通过甲醇提取代谢产物。【结果】从本地区土壤样本中分离获得一株产水溶性紫罗兰蓝色素的放线菌Str-4331, 在高氏培养基上其气生菌丝为白色, 产生水溶性紫罗兰色素, 镜检观察孢子丝螺旋形, 孢子椭圆形至长圆形, 通过形态、生理生化特征初步确定为链霉菌。利用ClustalX对其16S rRNA进行序列比对, 用Neighbor-Joining (NJ)构建系统发育树, 并用Bootstraping法对其评价。实验结果表明, 该菌基因序列与砖红链霉菌(Streptomyces lateritius) LMG 19372基因序列有99%的最高相似性。抑菌试验表明, 活性产物具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性。色素在水溶液中颜色随着pH的变化而变化。质谱分析显示3个主要化合物, 分子量分别为557.68、588.43、485.18 kD, 其中分子量为557.68 kD化合物与榴菌素B分子量一致。【结论】根据菌株的16S rRNA序列分析结果, 结合菌株的培养特性和生理生化特性, 将菌株Str-4331归属为砖红链霉菌(S. lateritius)。该菌种首次在本地区分离到, 具有进一步研究开发的价值。

摘要:【目的】从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene, asy), 并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达, 为深入研究该酶的性质及应用提供基础。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术, 克隆得到asy基因全长cDNA序列, 将其克隆到表达载体pET32a中, 通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量; 进一步在E. coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR16Δcrtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链), 用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化, 鉴定可溶性表达的Asy酶活性。【结果】法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No. DQ002007.1)一致性达到97%, 该序列总长1 971 bp, 最大开放阅读框为1 614 bp, 编码538个氨基酸, 在E. coli BL21(DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD; 条件优化后转化asy基因的重组菌在26 °C、0.5?mmol/L IPTG的条件下诱导时, 可溶性融合蛋白比例达85%。与pACCAR16Δcrtx单质粒转化相比, 共转化pACCAR16Δcrtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化, 其中α-胡萝卜素的含量明显减少, 伴随出现了3种新的色素, 根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质。【结论】从法夫酵母中克隆得到asy基因, 通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E. coli BL21(DE3)中的可溶性表达量, 经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性。

摘要:【目的】检测源自黑茶的散囊菌属分离菌株中的NRPS基因, 推测它们相应的次级代谢产物合成能力, 并考察了基于NRPS基因分布特征进行散囊菌属真菌遗传多样性分析的可能性。【方法】运用IQS法提取来自湖南、四川和湖北等地黑茶样品的14株散囊菌(Eurotium spp.)菌株的总DNA, 利用特异性引物对菌株中11种NRPS基因片段进行PCR检测和序列分析, 并结合UPGMA法分析了NRPS基因的分布。【结果】各菌株分别含有4?10个NRPS基因片段。NRPS7、CPS1基因在所有菌株中都可以检测到, 而NRPS2、NRPS6基因则仅在个别菌株中检测到; 其它NRPS基因的分布则呈现出多样性。来自同一块砖茶的菌株Fw-30813-7、Fw-30813-4、Fw-30813-1和Fw-30925-5之间, NRPS1、NRPS2、NRPS3、NRPS4和NRPS8五个基因的分布存在差异, 显示出黑茶内散囊菌的遗传多样性。来自湖南白沙溪茶厂的茯砖样品的菌株Fa-20719-3不含有NRPS5和NRPS8基因; 而从湖南益阳茶厂茯砖茶7个分离菌株中均含有这两种基因。不同地点加工出来的黑茶样品中的散囊菌菌株之间存在一些明显的遗传差异。【结论】首次从我国黑茶中的散囊菌属分离菌株中检测到NRPS基因, 并推测了NRPS产物的多样性, 展示了其多样化分布特征, 提示NRPS基因的分析有可能成为衡量散囊菌遗传多样性的另一个尺度。

摘要:【目的】明确湛江地区红树林滩涂海洋真菌的种类及其分布, 为海洋真菌的开发利用研究奠定基础。【方法】运用稀释平板法从湛江市高桥及特呈岛红树林滩涂不同的潮位带(低、中、高)和不同树种(白骨壤、桐花树、木榄、红海榄)采集淤泥样品550份, 采用真菌形态学和ITS序列分析技术进行多样性研究。【结果】 分离获得海洋真菌274株, 共鉴定出19属39种真菌, 以曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium和木霉属Trichoderma真菌分离频率高, 为湛江红树林滩涂优势真菌种类, 尤其在中潮位带真菌种类最多。此外, 分离获得真菌Talaromyces helicus, 为中国新记录种。【结论】湛江红树林滩涂海洋真菌的种类十分丰富, 具有潜在的开发和利用前景。

摘要:【目的】通过对分离自云南德宏州的含羞草β-根瘤菌进行遗传与表型多样性研究, 揭示我国含羞草β-根瘤菌的物种多样性。【方法】应用16S rDNA PCR-RFLP、全细胞蛋白SDS-PAGE电泳及16S rDNA全序列分析对分离得到的60株含羞草根瘤菌进行多样性研究。【结果】16S rDNA PCR-RFLP及全细胞蛋白SDS-PAGE图谱分析将供试菌株分为2个遗传型群和2个表型群, 分别与贪铜菌属(Cupriavidus)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)参比菌株聚群。经16S rDNA全序列分析, 供试菌株被归到台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)、含羞草伯克霍尔德菌(Burkholderia mimosarum)及结瘤伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum)等3个种群。【结论】云南德宏州的含羞草β-根瘤菌主要为贪铜菌及伯克霍尔德菌类群, 其中贪铜菌占绝对优势, 且存在遗传和表型的丰富多样性, 该研究揭示了含羞草β-根瘤菌的物种多样性并丰富了我国β-根瘤菌菌种资源。

摘要:经真空冷冻干燥得到的乳酸菌发酵剂存活率和后期的低温贮藏稳定性与诸多因素相关。本文综述了制备乳酸菌发酵剂过程中高密度发酵和真空冷冻干燥工艺的不同对乳酸菌抗冷冻性的影响, 其中高密度发酵过程中的培养基组分、培养温度、发酵恒定pH、中和剂的选择、菌体收获时期和发酵结束后处理以及真空冷冻干燥过程中保护剂的添加、预冷冻处理等是影响乳酸菌抗冷冻性的重要因素。通过对这些相关因素的综述分析, 为提高乳酸菌发酵剂的冻干存活率和后期的低温贮藏稳定性提供新的思路, 且应用抗冷冻性强、活力高的乳酸菌发酵剂对有效提高乳制品的质量和企业的经济效益意义重大。

摘要:假单胞菌分布广泛, 种类繁多, 能够产生多种结构的铁载体及具有特定颜色的色素化合物, 这使假单胞菌在生物病害防治、医学研究等领域应用潜力巨大。假单胞菌铁载体具有菌种和菌株特异性, 可在一定程度上作为其分类依据。假单胞菌色素具有色调、结构、功能多样性, 与其铁载体在功能上具有一定重叠性。假单胞菌铁载体及色素分离纯化方法相对比较简单, 但它们的生物合成及转运代谢机制非常复杂。

摘要:微生物形态实验是微生物学实验的重要组成部分, 为生物类专业学生了解微观世界的窗口。结合微生物形态实验教学的实际情况, 将显微数码互动系统引入到微生物形态实验教学, 实践证明改革不仅有效提升了实验教学质量, 培养了学生的实践动手能力和创新能力, 同时还有助于建立更为完善的实验考核方法。

摘要:介绍食品微生物学优质课程建设的经验和体会。为提升食品微生物学教学效果和教学质量, 从抓好网络教学资源和教材等教学基本建设, 优化课堂教学体系、改进课堂教学方法、强化实践教学和完善课程考核方式等方面进行了探索和实践, 取得较为显著的成效。

摘要:针对高职招生文理兼收和学生学习基础实际, 在细胞生物学与医学遗传学课程教学中, 通过案例引导丰富感性认识, 创设问题情境培养主动学习能力, 运用网络优势培养获取信息和解读问题能力, 设计趣味性开放实验提高实践能力, 促进知识理解和技能提高, 提高教学实效。