二氢杨梅素(dihydromyricetin, DMY)是一类存在于藤茶中的主要黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎等功能,其药用价值受到广泛关注,但其在生物体内的生物活性及肠道中的分解代谢机制尚不清楚。
探究二氢杨梅素对抗生素应激下小鼠的血清抗氧化性和肠道微生物多样性的影响。
将小鼠分为对照组、抗生素组、抗生素+二氢杨梅素组,检测各组小鼠血清中的抗氧化指标,利用高通量测序分析组间肠道微生物多样性的差异,通过实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)验证特定菌群组间的相对丰度差异。
二氢杨梅素显著提高了抗生素应激小鼠血清中过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutataione peroxidase, GSH-PX)活性(
二氢杨梅素能够改变肠道菌群结构,一些益生菌大量参与到其代谢过程,产生有益代谢产物,提高机体的抗氧化能力并维持肠道健康,改善抗生素对小鼠肠道产生的负面影响。该结果为二氢杨梅素的功能和分解代谢机制研究提供理论基础。
Dihydromyricetin (DMY) is a major flavonoid compound in Vine tea (
To explore the effects of dihydromyricetin on serum antioxidant capacity and intestinal microbial diversity of mice under antibiotic stress.
The experimental mice were divided into a control group, an antibiotic group, and an antibiotic+dihydromyricetin group. The antioxidant indexes in the serum of mice in each group were detected. The differences of intestinal microbial diversity between groups were analyzed by high-throughput sequencing. The relative abundance differences between specific bacterial groups were verified by real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).
Dihydromyricetin significantly increased the activities of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and glutathione (GSH) in the serum of antibiotic stressed mice (
Dihydromyricetin can change the structure of intestinal flora. Some probiotics are heavily involved in its metabolic process and produce beneficial metabolites to improve the antioxidant capacity of the body and maintain intestinal health. Negative effects of antibiotics on the intestinal tract of mice are thus reduced. These findings provide a theoretical basis for the study of the function and catabolic mechanism of dihydromyricetin.
多酚是一种广泛存在于茶叶、水果和蔬菜等植物性食物中且具有大量酚羟基结构的植物次生代谢物[
人体或动物机体抗氧化性简称抗氧化自由基。科学研究表明,癌症、衰老等病态都与过量的氧化自由基产生有关[
肠道的另一个重要功能在于机体对外界摄取营养物质的消化吸收,但介于肠道对黄酮类物质的不完全吸收和快速排泄导致在血清中很难检测到黄酮类物质的存在,从而很难证明黄酮类物质作为微生态制剂的药用价值。近年来,有关研究证明肠道微生物在对类黄酮物质的降解中发挥了重要作用[
本试验以抗生素应激小鼠为模型[
土霉素、红霉素、头孢羟氨苄,Macklin公司;二氢杨梅素,上海源叶生物科技有限公司;血清总蛋白试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)试剂盒、总抗氧化活性(total antioxidant capacity, T-AOC)试剂盒、总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase, T-NOS)试剂盒和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)试剂盒,南京建成生物工程研究所;柱式粪便DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit),Qiagen公司;实时荧光定量PCR试剂盒,TaKaRa生物技术有限公司;DNA引物,苏州金唯智生物科技有限公司;其他试剂为国产分析纯。30只昆明(KM)雄性小鼠,体重(20±2) g,由广东省动物实验中心提供(伦理批件号:长江大学医学部伦理委员会,2022120043)。
优普系列超纯水器,四川优普超纯科技有限公司;电子分析天平,梅特勒托利多科技有限公司;高速台式冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;实时荧光定量PCR仪,伯乐公司。
试验于2021年9月在湖北省长江大学生命科学学院进行。30只[(20±2) g]体质与健康情况相近的KM雄性小鼠,于温度(24±1) ℃、湿度45%−55%的条件下适应性饲养1周后,将小鼠随机分为对照组(N)、抗生素组(A)、抗生素+黄酮组(AF),每组10只,标记后称重并记录初始体重,试验期间间隔4 d记录1次小鼠的体重变化,每日上午9点以灌胃方式给药。首先AF组每天给予二氢杨梅素500 mg/kg灌胃,N、A两组每天给予正常去离子水500 mg/kg灌胃,持续3周。第4周开始,除了按上述剂量每天用二氢杨梅素给AF组灌胃外,还需每天额外给予A、AF组头孢羟氨苄100 mg/kg、土霉素300 mg/kg、红霉素300 mg/kg的混合抗生素灌胃构建抗生素应激小鼠模型,N组每天给予正常去离子水500 mg/kg灌胃作为对照,直至试验周期结束,共5周。
试验结束后摘除小鼠眼球,从左右眼眶处采取小鼠原血,加入1.5 mL离心管中,4 ℃、3 500 r/min离心10 min,取上清,分离血清编号备用。采用颈椎脱臼处死小鼠,解剖取盲肠内容物,立即放置于冰上的5 mL离心管中,液氮速冻或−80 ℃冰箱储藏。
按照各试剂盒测定小鼠血清总蛋白、MDA含量,T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-Px、T-NOS和iNOS活性,并按照各试剂盒公式计算指标值。
取每组4只小鼠的盲肠内容物交派森诺生物科技有限公司进行肠道菌群测序及分析。流程如下:提取样本细菌总DNA,用barcode特异性引物扩增16S rRNA基因的V3–V4区构建测序文库,引物为341F(5′-CCTACGGGNGGCWG CAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)。利用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序,每组做4次重复。
使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取试验结束后的A和AF组小鼠盲肠内容物中的细菌基因组DNA。根据特定肠道菌群16Sr RNA基因序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)引物(
特定菌群RT-qPCR引物序列
Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR of specific bacterial populations
Target bacteria | Primer sequence (5′→3′) | Sequence length (bp) |
F: AGCAGTAGGGAATCTTCCA |
341 | |
F: CCCACAACCTCAAACTCCTGTAT |
260 | |
F: CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT |
144 | |
F: GGAGCAAACAGGATTAGATACCC |
317 | |
All bacteria | F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG |
200 |
实验数据应用SPSS 12.0统计学软件分析,采用
适应性喂养阶段至试验第4周,各组小鼠每天稳定进食且保持活跃状态,粪便黑硬。试验第5周至试验周期结束期间,A组小鼠出现厌食、懒动、嗜睡等症状,粪便呈米黄色、湿润。AF组小鼠相较于A组小鼠仍保持相对活跃的状态,少部分小鼠出现厌食的症状。N组小鼠无明显变化。适应性喂养后的小鼠生长发育情况趋于稳定,体重指数能够反映小鼠的生理和发育状况。如
不同处理组小鼠平均体重变化
Changes of average body weight of mice in different treatment group.
血清总蛋白是反映肝脏合成功能的重要指标,具有维持血液渗透压、运输多种代谢物、免疫作用、营养作用等功能。如
二氢杨梅素对抗生素应激小鼠血清抗氧化性的影响
Effects of dihydromyricetin on serum antioxidation in antibiotic stressed mice.
CAT、SOD、GSH-Px是生物体内重要的抗氧化防御酶,如
T-NOS为总一氧化氮合酶,其中iNOS为诱导型一氧化氮合酶,由机体组织、细胞受损刺激后诱导合成,iNOS催化生成NO的速度远快于其他类型NOS,是NO大量生成的主要因素。机体内NO可与亲脂性的过氧化自由基(LOO−)反应生成LOONO,阻止了脂质的过氧化。根据
试验选取了N、A、AF这3组小鼠盲肠内容物为样本进行高通量测序。所有样本(3组,每组4个,共12个)的DNA片段在Illumina MiSeq平台测序获得原始序列。过滤和剔除疑问序列及低质量序列后共获得1 088 561个有效序列。在序列97%相似度阈值的条件下对获得的有效序列进行合并和分类(即OTU归并划分)用于后续分析。
小鼠肠道菌群OTU的Venn图
Venn map of intestinal microflora in mice.
对于微生物群落,有多种指数来反映其α多样性。常用的α多样性指数包含Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数,其中Chao1和ACE指数侧重反映群落丰富度,Shannon和Simpson指数则在反映群落丰富度的同时兼顾了群落均匀度。如
各处理组小鼠肠道微生物α多样性指数
Alpha diversity indexes of intestinal microorganisms in each treatment group
Group | Chao1 index | ACE index | Shannon index | Simpson index |
数据表示为平均数±标准差( |
||||
N | 1 362.44±230.00 | 1 412.16±245.54 | 7.71±0.77 | 0.97±0.24 |
A | 333.75±32.44 | 346.72±35.63 | 3.70±0.45 | 0.74±0.14 |
AF | 273.12±58.07 | 282.29±56.87 | 3.38±0.47 | 0.75±0.09 |
为探究不同样本间肠道菌群组成成分的差异性,采用基于UniFrac距离的主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)来反映不同样本间微生物群落的相似度。其中,UniFrac距离分为unweighted和weighted两组,前者仅侧重于OTU种类不同而导致的样本差异,后者则兼顾了群落间的系统发育关系和在各自样本中的丰度。如
小鼠肠道菌群unweighted UniFrac距离(A)和weighted UniFrac距离(B)的主坐标分析
Principal coordinate analysisl PCoA plots of unweighted UniFrac distance values (A) and weighted UniFrac distance values (B) of intestinal microflora in mice.
如
小鼠肠道微生物在门(A)和科(B)水平下微生物种类分布图
Microbial species distribution of mouse gut microbiota at the phylum (A) and family (B) level.
采用LEfSe分析工具对各组微生物菌群进行差异比较,在此选择
LEfSe菌群组间差异分析图
Analysis of differences among bacterial groups based on LEfSe software.
为探究二氢杨梅素的功能及与肠道菌群间的相互作用关系,基于微生物差异分析结果,在差异显著的菌群中选取了乳杆菌属、梭菌属、肠球菌属、肠杆菌科4种科属水平特定的典型益生菌群和条件致病菌群,通过荧光定量PCR测定了其在A、AF两组样本中的相对丰度。结果如
抗生素组和抗生素+二氢杨梅素组小鼠肠道特定菌群的组间相对丰度
Relative abundance of specific intestinal microflora of mice in antibiotic group and antibiotic+dihydromyricetin group.
二氢杨梅素是藤茶中主要的黄酮类物质,具有广泛的药理活性。近年来研究表明,其在抗氧化、抗炎等方面有显著效果,在对抗病原微生物、预防心血管疾病、缓解疲劳等方面具有较大临床应用潜力,而二氢杨梅素在机体中的药理特征和作用机制等问题还需进一步研究和确证。根据本试验结果,3组小鼠在前4周的体重变化趋势均稳步上升,进食状态积极,活跃好动;第4周后抗生素组(A)和二氢杨梅素+抗生素组(AF)小鼠体重出现负增长现象,其中抗生素组部分小鼠出现厌食、嗜睡和懒动的症状,而饲喂二氢杨梅素+抗生素组的小鼠依然能够保持一定的进食量和活跃状态。据报道长期大量服用抗生素对生长发育有影响,长期服用抗生素使机体产生耐药性,导致机体免疫功能低下,更能破坏肠道微生物稳态,影响机体的消化吸收[
T-AOC直接反映机体的总抗氧化能力,是各种抗氧化物质和抗氧化酶构成的总抗氧化水平,其活性直观地体现了生物机体代谢活力与生命进程。CAT、SOD、GSH-Px是生物体内重要的酶类抗氧化剂。CAT可以分解机体内的H2O2;SOD能够清除体内多余的氧离子自由基,以防止自由基对机体的损伤;GSH-Px能催化GSH变为谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG),还原有毒的过氧化物,促进H2O2的分解,保护机体细胞免受氧化损伤。本试验中,抗生素组小鼠在经过2周抗生素灌胃处理后,其总抗氧化能力(T-AOC)明显下降,说明大量服用抗生素会影响机体抗氧化系统的运行,如抗氧化酶的活性和非酶类抗氧化剂的合成,进而导致过多的氧化自由基无法清除,血液脂质过氧化水平升高,引起病态的发生。然而使用二氢杨梅素能够显著提高血清中CAT、SOD和GSH-Px酶活性,并超过对照组水平,并且在总体抗氧化水平上依然呈现该趋势。有关研究表明二氢杨梅素能通过提高CAT活性、抑制活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成来减弱偶氮二异丁脒盐酸盐(2, 2ʹ-azobis [2-methylpropionamidine] dihydrochloride, AAPH)引起的红细胞溶血和CuCl2诱导的血浆脂质过氧化水平[
非酶类抗氧化剂主要有维生素E、维生素C、谷胱甘肽、一氧化氮等,其中一氧化氮是生物体内重要的信使分子,参与多种生理和病理过程,如清除自由基、调节血管张力防止动脉硬化、消除血管炎症等,在肠道系统中具有保护胃黏膜的作用[
MDA是机体脂质过氧化的最终产物,具有细胞毒性,会引发一系列细胞膜结构和功能的破坏,其含量反映了氧化应激状态下机体细胞受损伤的程度。本试验中,抗生素的作用使小鼠血清中MDA含量急剧升高,抗生素的长期使用是导致细胞氧化受损的重要原因。王丹等[
肠道不仅是哺乳动物消化吸收的重要场所,也是发挥免疫防御功能的重要器官,其中肠道微生物不仅通过代谢为机体提供维生素、必需氨基酸和多肽等营养物质,在维持肠道微环境的稳定和调节宿主肠道健康中发挥重要作用[
通过小鼠肠道微生物差异分析发现,二氢杨梅素处理后的抗生素应激小鼠肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度比值显著升高。厚壁菌门/拟杆菌门(
在肠道中,益生菌能够有效地维持肠道微环境的稳态,而某些条件致病菌的大量繁殖是引发各类疾病的根源。乳杆菌属(
小鼠在抗生素应激条件下,其肠道微生物多样性锐减,受二氢杨梅素处理小鼠的肠道菌群组成与结构存在明显差异,说明二氢杨梅素的存在对小鼠肠道菌群有调节作用,介于肠道微生物对类黄酮物质的分解代谢作用,二氢杨梅素的分解代谢机制可能与上述差异菌群存在协同效应。Tong等[
综上所述,抗生素的滥用不仅对小鼠机体带来大量负面影响,也打破了小鼠肠道微生物的稳态,提高了疾病发生的风险。二氢杨梅素的使用能显著提高小鼠血清中抗氧化酶类的活性和抗氧化物质的含量,提高氧化自由基和脂质过氧化产物的清除效率,使小鼠的总抗氧化能力增强。因此,二氢杨梅素在治疗心血管疾病和抗衰老等方面有明显效果。抗生素的长期大量使用导致肠道微生物菌群的丰度和多样性显著降低,而二氢杨梅素能够通过提高厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比值,显著提高乳杆菌属、梭菌属丰度和降低肠杆菌科丰度来调控肠道微生态平衡,而且乳杆菌属、梭菌属细菌能够参与二氢杨梅素的代谢过程,产生有益代谢产物来提高机体的抗氧化能力和维持肠道健康,进而预防和治疗相关疾病。
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