沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,可引起多种食源性疾病。
了解云南地区鸭源沙门菌病的流行现状、耐药现象及毒力基因携带等基本情况。
无菌采集云南各地区病死鸭肝脏样品169份进行沙门菌分离,对分离株进行血清分型鉴定、药敏及相关耐药基因、毒力基因筛查。
分离到鸭源沙门菌48株,分离率为28.40%,鉴定出3种血清型,其中肠炎沙门菌为优势血清型。分离株对青霉素G、林可霉素、克林霉素和利福平的耐药率达100%,每株菌至少对3类6种及以上的抗生素耐药,单株最高可耐14种,产生了22种耐药谱型。共检出耐药基因5种,
云南地区鸭源沙门菌主要流行血清型为肠炎沙门菌,耐药性及多重耐药情况严重,耐药机制复杂,耐药基因与耐药表型符合率低,毒力基因检出率较高。研究结果可为云南地区鸭群沙门菌病的防控和净化提供参考。
This research was to investigate the prevalence, antimicrobial resistance and virulence gene of salmonellosis in ducks in Yunnan province.
A total of 169 liver samples of dead ducks from various regions in Yunnan province were collected for
Forty-eight
Salmonella)是一种革兰氏阴性的胞内杆菌,血清型众多,在我国约分布有三百多种,宿主谱广泛,是肠杆菌科中重要的人畜共患病原菌[
目前,抗生素在家禽养殖生产中已被广泛应用于预防、治疗疾病和促进生长等环节,但生产中长期不规范甚至滥用抗生素导致细菌耐药的现象越来越严重,极大地促进了沙门菌耐药菌株的出现和传播,对养殖业沙门菌病防控及净化工作造成了极大的困难,还严重威胁人类公共卫生安全[
2014−2020年由云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所收集自云南省宜良县、建水县、石林县、陆良县、元江县等地送检疑似沙门菌感染的病死鸭肝脏样品169份。质控菌株大肠埃希氏菌ATCC 25922,中国微生物菌种保藏中心;肠炎沙门菌BNCC 103307和鼠伤寒沙门菌ATCC 14028,北纳创联生物科技公司。
麦康凯培养基、SS培养基、沙门菌微量生化鉴定管和革兰氏染色试剂盒,广东环凯微生物科技有限公司;沙门菌属诊断血清60种,宁波天润生物药业有限公司;抗生素药敏纸片,杭州滨和微生物试剂有限公司;2×San
无菌挑取病死鸭肝脏划线接种于麦康凯培养基,于37 ℃培养过夜后,挑取沙门菌疑似菌落划线接种于SS培养基,于37 ℃培养过夜后进行革兰氏染色镜检并使用沙门菌微量生化鉴定管进行生化鉴定。
对初步判定的可疑菌株使用沙门菌属诊断血清以玻片凝集法做血清型鉴定,并以煮沸裂解法制备可疑菌株的DNA模板,分装后−20 ℃冻存用于后续实验。依照文献[
多重PCR引物信息
Multiple PCR primer information
基因类别 |
基因 |
引物序列 |
片段大小 |
16S rRNA | 16S (27−519) | F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
500 |
16S (357−1115) | F: CTCCTACGGGAGGCAGCAG |
750 | |
16S (926−1492) | F: AAACTYAAAKGAATTGACGG |
560 | |
F: ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA |
495 | ||
F: TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG |
304 | ||
F: TTGTTCACTTTTTACCCCTGAA |
401 | ||
F: CGGTGTACTGCCCGCTAT |
252 | ||
F: GATCTGCTGCCAGCTCAA |
174 |
采用K-B纸片扩散法对沙门菌分离株进行药敏特性检测,判断标准按抗生素类药敏纸片使用说明书进行。根据耐药表型统计结果,参照文献[
耐药基因引物信息
Drug resistance genes primer information
基因类别 |
基因 |
引物序列 |
片段大小 |
β-内酰胺类 |
F: GCAAGTAGGGCAGGCAATCA |
422 | |
F: ATCAGTTGGGTGCACGAGTG |
608 | ||
MOX | F: GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT |
520 | |
CIT | F: TGGCCAGAACTGACAGGCAAA |
462 | |
DHA | F: AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT |
405 | |
ACC | F: AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA |
346 | |
EBC | F: TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG |
302 | |
FOX | F: AACATGGGGTATCAGGGAGATG |
190 | |
氨基糖苷类 |
F: CATTGAGCGCCATCTGGAAT |
500 | |
F: CTAGCTGCGGCAGATGAGC |
300 | ||
F: GTTACACCGGACCTTGGA |
674 | ||
F: GTGGATGGCGGCCTGAAGCC |
526 | ||
磺胺类 |
F: CGGACGCGAGGCCTGTATC |
591 | |
F: GCGCAGGCGCGTAAGCTGAT |
514 | ||
F: GGGAGCCGCTTCCAGTAAT |
500 | ||
F: CAATGGCTGTTGGTTGGAC |
254 | ||
四环素类 |
F: GCTGTCGGATCGTTTCGG |
658 | |
F: TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG |
659 | ||
F: TCTAACAATGCGCTCATCGT |
589 | ||
F: TCTTGCAGGAGCCGCAGTCGAT |
721 | ||
F: AGGACGACGGTGCTTGCT |
297 | ||
F: CAATAATTGGTGGTGGACCC |
456 |
依据文献[
毒力基因引物信息
Virulence genes primer information
基因类别 |
基因 |
引物序列 |
片段大小 |
SPI-1 | F: CCTGTATTGTTGAGCGTCTGG |
422 | |
SPI-2 | F: GAATAGCGAATGAAGAGCGTCC |
677 | |
SPI-3 | F: TTCTGATCGCCGCTATTCG |
200 | |
SPI-4 | F: GAATAGAAGACAAAGCGATCATC |
1 231 | |
SPI-5 | F: CGGACCGGCCAGCAACAAAACAAGAAGAAG |
220 | |
毒力质粒 |
F: CTATCAGCCCCGCACGGAGAGCAGTTTTTA |
717 | |
F: AAGGTCGTTCAACAAGCC |
252 | ||
菌毛 |
F: ACCAGAGACATTGCCTTCC |
467 | |
F: GCGCCGCTCAGCCGAACCAG |
157 | ||
毒素 |
F: CAACCAGATAGTAAAGACCG |
234 | |
F: ACAACTGTCGCATCTCGCCCCGTCATT |
268 |
经过细菌分离纯化、革兰氏染色镜检、生化鉴定后,从169份病死鸭肝脏样品中共分离到沙门菌属可疑菌株48株。可疑菌株在麦康凯琼脂上形成表面光滑、无色半透明、边缘整齐的圆形菌落;在SS琼脂平板上菌落也呈半透明状,部分菌株中心带有黑点。镜检为革兰氏阴性的短杆状。生化鉴定结果显示,所有可疑菌株的赖氨酸脱羧酶、氨基酸、甘露醇和山梨醇均为阳性,在三糖铁琼脂上均可产硫化氢,靛基质、尿素、氰化钾和β-半乳糖苷试验均为阴性,按照沙门菌微量生化鉴定管说明书初步判定48株分离株均为沙门菌。
对分离到的48株沙门菌可疑株进行血清型鉴定,结果表明,48株沙门菌分属B群鼠伤寒沙门菌(1株)、C2群科特布斯沙门菌(1株)和D群肠炎沙门菌(46株),与多重PCR鉴定结果相符(
部分分离菌株多重PCR扩增结果
Results of multiplex PCR amplification of some isolates strain.
科特布斯沙门菌分离株基于16S rRNA基因序列建立的系统发育树
Phylogenetic tree established based on 16S rRNA gene sequences of
药敏特性检测结果(
48株沙门菌药敏特性检测
Drug sensitivity test of 48 strains of
Antibiotics | The number of bacteria corresponding to inhibition zone diameters (mm) | |||||||||||||||||||||||||
0 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | |
注:–:无数据 |
||||||||||||||||||||||||||
Penicillin G | 11 | – | – | 1 | – | 1 | – | 6 | 12 | 8 | 5 | 2 | 1 | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Ampicillin | 12 | – | – | – | – | – | – | 1 | 2 | 2 | – | 3 | 4 | 7 | 8 | 5 | 2 | 1 | – | – | 1 | – | – | – | – | – |
Amoxicillin | 5 | 1 | 2 | 1 | – | 2 | 1 | – | – | – | – | – | – | 1 | – | 4 | 10 | 13 | 3 | 4 | – | – | – | 1 | – | – |
Cephalexin | – | – | – | – | – | – | – | 3 | 1 | 2 | 6 | 4 | 9 | 13 | 1 | 8 | – | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Cefotaxime | – | – | – | – | – | – | – | – | – | 1 | 1 | – | 3 | 4 | 4 | 5 | 2 | 2 | 4 | 3 | 4 | 7 | 3 | 3 | 1 | 1 |
Cefradine | – | – | – | – | – | – | 1 | – | 2 | 4 | 5 | 7 | 8 | 9 | 5 | 3 | 2 | 2 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Streptomycin | 4 | – | – | – | – | 1 | – | – | – | 3 | 2 | 2 | 6 | 7 | 10 | 4 | 6 | 1 | 1 | – | – | 1 | – | – | – | – |
Kanamycin | 15 | – | 1 | – | – | – | – | – | – | 1 | 5 | 4 | 4 | 5 | 4 | 3 | 2 | 4 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Gentamicin | 14 | – | – | – | – | – | – | – | 1 | 3 | 3 | 7 | 6 | 3 | 4 | 5 | 1 | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Amikacin | – | – | – | – | – | – | – | – | – | 3 | 3 | 2 | 8 | 16 | 4 | 8 | 2 | 1 | – | – | – | 1 | – | – | – | – |
Neomycin | – | – | – | 1 | – | 4 | 7 | 2 | 1 | – | 1 | 2 | 6 | 6 | 9 | 4 | 3 | – | 1 | 1 | – | – | – | – | – | – |
Spectinomycin | 2 | – | – | – | – | – | – | 4 | 3 | 7 | 2 | – | 5 | 4 | 3 | 1 | 4 | 5 | 3 | 5 | – | – | – | – | – | – |
Tetracycline | 15 | – | – | – | – | 3 | – | 3 | 3 | 4 | 2 | 8 | 6 | 2 | – | 1 | – | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Doxycycline | 19 | – | – | 3 | 3 | 7 | 8 | 4 | 2 | 1 | – | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Erythromycin | 1 | 1 | 3 | 6 | 10 | 16 | 8 | 1 | 1 | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Azithromycin | 1 | – | – | – | – | – | – | 2 | 1 | 2 | 4 | 3 | 12 | 14 | 4 | 2 | 2 | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – |
Lincomycin | 48 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Clindamycin | 48 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Polymyxin B | – | 1 | – | – | – | 2 | 7 | 19 | 8 | 7 | 2 | 1 | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
Florfenicol | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | 1 | 1 | 4 | 6 | 10 | 12 | 7 | 4 | 1 | 1 | 1 | – | – | – | – | – |
Enrofloxacin | – | – | – | – | – | – | – | – | – | 2 | 2 | 2 | 7 | 6 | 3 | 2 | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 | 5 | – | – | – | – |
Compound sulfamethoxazole | 2 | – | – | – | – | – | – | – | – | 1 | – | 1 | 3 | 3 | 10 | 6 | 7 | 5 | 4 | 3 | 2 | – | 1 | – | – | – |
Rifampicin | 37 | – | 9 | 1 | – | – | – | – | 1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
分离菌株耐药率
Drug resistance rate of the isolated bacteria.
分离菌株多种耐药情况
Multiple drug resistance of the isolates strain.
分离的48株沙门菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类、磺胺类和利福霉素类等8类抗生素存在不同的耐药率,共产生了22种多重耐药谱型(
沙门菌多重耐药谱型
Multiple resistant phenotype of
多重耐药型 |
抗生素耐药种类 |
耐药菌株占比 |
注:耐药菌株数为耐同一大类中任意一种或几种抗生素的菌株之和。β-LAC:β-内酰胺类;LIN:林克胺类;RIF:利福霉素类;AMI:氨基苷类;TET:四环素类;MAC:大环内酯类;SUL:磺胺类;POL:多肽类 |
||
β-LAC-LIN-RIF | 3 | 100 (48/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI | 4 | 47.92 (23/48) |
β-LAC-LIN-RIF-TET | 4 | 97.92 (47/48) |
β-LAC-LIN-RIF-MAC | 4 | 93.75 (45/48) |
β-LAC-LIN-RIF-POL | 4 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-SUL | 4 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET | 5 | 45.83 (22/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-MAC | 5 | 43.75 (21/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-POL | 5 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-SUL | 5 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-TET-MAC | 5 | 91.67 (44/48) |
β-LAC-LIN-RIF-TET-POL | 5 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-TET-SUL | 5 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-MAC-POL | 5 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-MAC-SUL | 5 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET-MAC | 6 | 41.67 (20/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET-POL | 6 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET-SUL | 6 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-MAC-POL | 6 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-MAC-SUL | 6 | 4.17 (2/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET-MAC-POL | 7 | 2.08 (1/48) |
β-LAC-LIN-RIF-AMI-TET-MAC-SUL | 7 | 4.17 (2/48) |
对分离的48株鸭源沙门菌进行4类22种抗生素耐药基因检测,结果显示,共检出
根据公式:耐药基因和耐药表型符合率=(携带耐药基因且同时具有相应耐药表型的菌株数/具有相应耐药表型的菌株数或携带相应耐药基因的菌株数)×100%,对分离的48株鸭源沙门菌进行耐药表型和耐药基因型相关性分析,结果显示,48株分离菌中有14株耐β-内酰胺类抗生素,其中13株含
对分离的48株鸭源沙门菌进行11种毒力基因PCR检测,结果显示,共检出毒力基因10种(
分离菌株毒力基因检出情况
Detection of virulence genes in isolates strain.
沙门菌毒力基因谱型
Virulence genotype of
毒力基因型 |
毒力基因数 |
菌株数百分比 |
5 | 10.42 (5/48) | |
6 | 10.42 (5/48) | |
7 | 10.42 (5/48) | |
8 | 4.17 (2/48) | |
8 | 6.25 (3/48) | |
8 | 2.08 (1/48) | |
9 | 8.33 (4/48) | |
9 | 6.25 (3/48) | |
10 | 41.67 (20/48) |
沙门菌病为禽类养殖过程中的重要疾病之一,该病原菌可以通过食品引起人食物中毒,严重威胁人类健康,其中
随着高度集约化养殖的发展,动物疾病的发病率也在不断增加,抗生素被广泛用于预防和治疗动物细菌性传染病,由于抗生素长时间、超剂量使用甚至滥用,大量抗生素及其残留物加速了更多耐药菌株的出现,这些耐药菌株及耐药基因便可能通过食物链传播给人类,从而严重威胁人类公共卫生安全。药敏试验结果显示,本次分离的48株鸭源沙门菌共存在22种多重耐药谱型,所有菌株均对3类及3类以上抗生素耐药,多重耐药率达100%,单株细菌最少对6种抗生素耐药,单株最高可耐14种抗生素,但这些菌株大部分对多肽类、酰胺醇类、喹诺酮类和磺胺类药物敏感,该结果可能与这些养殖场在饲养过程中不常轮换用药等因素有关。Zeng等[
作为一种新型的环境污染物,耐药基因可以在菌株之间垂直传播,稳定遗传给下一代菌株;此外,这些基因可经质粒、转座子或整合子之类的可移动性遗传元件在菌株与菌株、菌株与动物之间水平传播[
施开创等[
2014−2020年云南地区鸭源沙门菌主要优势流行株为肠炎沙门菌,多重耐药率高达100%,毒力基因检出率较高且携带形式复杂,在养殖生产中应加强沙门菌的防控和净化,科学合理地使用抗菌药物,禁止滥用,避免耐药菌株出现更多的耐药种类。
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