产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病原菌，广泛分布于自然界(土壤、污水、饲料、粪便等)，其宿主较为广泛，可感染牛、猪、羊、鸡和人等^[1-2]。依据主要致死性毒素(α、β1、β2、ε、ι、CPE、NetB)及其抗毒素的中和试验，可将C. perfringens分为7种血清型(A、B、C、D、E、F、G)^[3-4]。牛产气荚膜梭菌病主要由A型、C型和D型所引起，临床表现为牛梭菌性肠炎、出血性肠炎、空肠出血综合征、肠毒血症、猝死等症状，会给养牛业造成巨大的经济损失^[5-7]。现阶段预防该病主要以灭活疫苗为主，但其产生抗体滴度会随时间延长而下降^[8-9]。因此，建立灵敏、特异、快速准确的诊断方法对于疫病诊断和抗体水平监测非常重要。

检测C. perfringens的方法有细菌分离培养、分子生物学和血清学检测等。细菌分离培养存在操作烦琐、耗时长等缺点；PCR或荧光定量PCR方法存在成本高昂、需特殊设备、对操作人员要求较高等缺点^[10-11]；ELISA方法具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，且可监测动物抗体水平^[12]。

选择良好的靶抗原是建立间接ELISA抗体检测方法的关键。α毒素存在于所有类型C. perfringens中，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性，可进入血液循环引起动物败血症或毒血症，进而导致急性死亡^[13]；β2毒素是由B、C型产气荚膜梭菌分泌的一种具有细胞毒性、致死性的毒素，可使感染动物引起坏死性肠炎和肠毒血症^[14]；ε毒素主要是B型和D型C. perfringens分泌的一种外毒素，能使感染动物出现肌肉组织坏死^[15]。目前，虽有以α毒素、β1毒素为包被抗原建立的间接ELISA方法，但其靶标单一，抗体检测存在一定局限性^[16-17]。

本研究以重组α-β2-ε融合蛋白为靶抗原，优化反应条件后建立C. perfringens间接ELISA抗体检测方法，以期为C. perfringens流行病学调查、疫病诊断及抗体水平监测提供技术支撑。

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus, BPIV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)和牛支原体(Mycoplasma bovis)的阳性血清，以及C. perfringens的阳性血清和阴性血清、E. coli BL21(DE3)感受态细胞、马血清、24份阳性血清和24份阴性血清均由中国兽医药品监察所制备保存。277份牦牛血清样品采自四川省甘孜藏族自治州部分地区(其中九龙县12份、甘孜县24份、道孚县60份、炉霍县19份、理塘县79份、雅江县49份和色达县34份)。

HRP-兔抗牛IgG (H+L)、蛋白Marker (10‒180 kDa)，博奥龙生物科技有限公司；TMB显色液、快速转膜液、ECL化学发光试剂盒、PVDF膜和Bradford蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；PBS、PBST缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；96孔酶标板，康宁公司；产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒，上海烜雅生物科技有限公司。核酸蛋白测定仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；分光光度计，美谷分子仪器有限公司；凝胶成像仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

使用EditSeq、Protean软件及Jameson-Wolf方法分别预测α、β2和ε毒素蛋白的抗原指数^[18]，选择抗原指数较高的肽段并通过柔性Linker (5′-GGTGGCGGCGGCTCT-3′)将3个片段进行连接。将连接后的序列送北京睿博兴科生物科技有限公司进行整体密码子优化后合成并构建重组表达质粒pET-32α-β2-ε。根据GenBank公布的α、ε基因序列，利用Vazyme网页在线设计引物(https://crm.vazyme.com/cetool/simple.html)，得到α-F (5′-GACAAGGCCATGGCTGATATCATG AGTCATAGTTGGGATGATTGGG-3′)和ε-R (5′-TT ATTTTATTCCTGGTGCCTTAATAGA-3′)，并由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物工作浓度均为10 μmol/L。对合成后的重组表达质粒进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，引物α-F、ε-R各1 μL，菌液2 μL，ddH₂O 8.5 μL；PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。反应结束后取5 µL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，送北京睿博兴科生物科技有限公司测序。

将重组表达质粒pET-32α-β2-ε转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37 ℃静置培养过夜。挑取单菌落接种于10 mL含Amp的LB培养基，37 ℃、200 r/min培养过夜。将菌液按1%接种量接种至500 mL含Amp的LB培养基，待菌液OD₆₀₀为0.6时，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、200 r/min诱导表达5 h。5 000 r/min离心2 min弃上清，使用PBS重悬菌体，在高压细胞破碎机128 MPa条件下将其破碎后，用8 mol/L尿素溶解沉淀，并使用Ni NTABeads 6FF重力柱进行纯化，分别在含8、6、4、2 mmol/L尿素的透析缓冲液中透析8 h，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，−20 ℃保存备用。

对重组α-β2-ε融合蛋白用20%的蛋白预制胶进行SDS-PAGE鉴定，观察纯化结果，再进行Western blotting分析：将SDS-PAGE蛋白带转移至亲水PVDF膜上，5%脱脂乳37 ℃封闭2 h；C. perfringens阳性血清1:200稀释并于37 ℃孵育1 h，用PBST洗涤10次，每次3 min；HRP-兔抗牛IgG (H+L) 1:5 000稀释并于37 ℃孵育1 h；PBST洗涤10次，每次3 min；使用ECL化学发光试剂盒避光显色1‒2 min，在凝胶成像仪器中观察结果。

采用棋盘法和控制单一变量法确定最佳反应条件。将重组α-β2-ε融合蛋白用PBS (pH 9.6)分别稀释至10.0、5.0、2.5 μg/mL (抗原包被浓度优化)，100 μL/孔，4 ℃过夜；PBST洗涤3次；用5.0%脱脂乳、1.0%马血清、5.0% BSA、2.5%脱脂乳、2.5% BSA、1.0%明胶分别封闭(封闭剂优化)，300 μL/孔，37 ℃分别孵育30、60、90、120 min (封闭时间优化)；PBST洗涤3次；C. perfringens阳性血清和阴性血清分别进行1:100、1:150、1:200、1:250、1:300稀释(最佳血清稀释倍数优化)，100 μL/孔，37 ℃分别孵育30、45、60 min (最佳血清作用时间优化)；HRP-兔抗牛IgG (H+L)分别按照1:500、1:1 000、1:1 500、1:2 000稀释(酶标二抗稀释倍数优化)，100 μL/孔，37 ℃分别孵育30、45、60 min (酶标二抗作用时间优化)；PBST洗涤3次；加TMB显色液100 μL/孔，分别避光显色5、10、15 min (显色时间优化)；每孔加入50 μL终止液，在OD₄₅₀条件下读数，选择阳性/阴性(positive/negative, P/N)值最大的为最佳条件(以上试验均重复3次，取平均值)。

利用已优化的间接ELISA方法对已知标准的24份阳性血清和24份阴性血清进行检测，获得每个样品的OD₄₅₀值，使用SPSS软件分析并绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)，确定检测方法的敏感度值(sensitivity, Se)、特异度值(specificity, Sp)及曲线下面积(area under curve, AUC)，并计算约登指数(Youden=Se+Sp‒1)，Youden指数最大的值对应的数值为检测临界值^[19]。

将C. perfringens阳性血清和阴性血清分别使用PBS进行倍比稀释，从1:100稀释到1:25 600，按照优化好的条件进行检测，测定每孔OD₄₅₀值，以验证该方法能检测到的血清最大稀释度(每个试验3个重复，求平均值)。

利用建立的间接ELISA方法分别对M. haemolytica、S. enteriditis、E. coli、S. aureus、P. multocida、BVDV、IBRV、BPIV、BCoV和Mycoplasma bovis的阳性血清进行检测，以阳性血清和阴性血清为对照，以评价该方法的特异性(每个试验3个重复，求平均值)。

随机选取6份血清样品，利用建立的C. perfringens间接ELISA抗体检测方法对同一批次包被的3个不同ELISA板进行批内重复性试验；另外随机选用3个不同批次包被的ELISA板，用本试验建立的方法对上述6份血清样品进行批间重复性试验。计算批间或批内的平均值(x)、标准差(standard deviation, SD)和变异系数(coefficient of variation, CV)，评估该检测方法的重复性。

利用本研究建立的C. perfringens间接ELISA抗体检测方法与商业化的产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒同时检测采集的277份牦牛血清，初步评估该方法的临床应用效果。

用Protean软件预测α、β2和ε毒素蛋白的抗原指数，发现α、β2和ε毒素蛋白抗原指数均较高，整体抗原性较好(图 1)。选择抗原性较为突出且中间部分无终止密码子的α毒素蛋白的241‒403肽段、β2毒素蛋白的161‒355肽段和ε毒素蛋白的154‒331肽段进行融合表达，经PCR和测序鉴定其基因含碱基1 617 bp，与预期一致(图 2)。

图 1　Protean软件预测α (A)、β2 (B)和ε毒素(C)的蛋白抗原表位 Figure 1　Prediction of protein epitopes of α (A), β2 (B) and ε toxins (C) by Protean software.

图选项

图 2　产气荚膜梭菌α-β2-ε重组质粒菌液PCR产物扩增图 Figure 2　Amplification of Clostridium perfringens α-β2-ε recombinant plasmid PCR products. M: DL2000 DNA Marker; 1: α-β2-ε amplification product, size 1 617 bp. M：DL2000 DNA Marker；1：α-β2-ε扩增的产物，大小1 617 bp

图选项

对诱导表达的500 mL菌液离心破碎，经SDS‐PAGE鉴定，主要以包涵体形式表达，上清表达较少(图 3)。通过对包涵体变性、纯化、复性，最终获得2.27 mg蛋白质。经Western blotting鉴定，重组α-β2-ε融合蛋白相对分子质量约80 kDa，并且该蛋白可与C. perfringens阳性血清发生良好的反应，表明其反应原性较好(图 4)。

图 3　重组α-β2-ε融合蛋白SDS-PAGE图 Figure 3　SDS-PAGE results of recombinant α-β2-ε fusion protein. M: 11‒180 kDa Protein Marker; 1: Whole bacteria not lysed before induction; 2: Lysed bacterial solution after induction; 3: Supernatant; 4: Precipitation; 5: Penetrating fluid; 6: Washing liquid; 7‒8: Protein eluent. M：11‒180 kDa蛋白Marker；1：诱导前未裂解全菌；2：诱导后裂解菌液；3：上清；4：沉淀；5：流穿液；6：洗涤液；7‒8：蛋白洗脱液

图选项

图 4　Western blotting结果 Figure 4　Western blotting results. M: 11‒180 kDa protein Marker; 1: C. perfringens positive serum reaction. M：11‒180 kDa蛋白Marker；1：C. perfringens阳性血清反应

图选项

采用棋盘法对包被抗原浓度与血清稀释倍数进行优化。结果显示(表 1)，当抗原包被浓度为5 μg/mL，血清稀释倍数为1:150时，P/N值最大。

采用单一控制变量法分别对封闭剂及封闭时间、血清作用时间、酶标二抗稀释倍数及作用时间以及显色时间进行优化。结果显示，5%脱脂乳作为封闭剂最优(图 5A)，封闭1 h (图 5B)，最佳血清作用时间为30 min (图 5C)，酶标二抗最佳稀释倍数为1:2 000 (图 5D)，其最佳作用时间为30 min (图 5E)，最佳显色时间为10 min (图 5F)。

图 5　间接ELISA相关反应条件优化结果 Figure 5　The optimization results of indirect ELISA related reaction conditions. A: Screening of encapsulants. B: Optimisation of encapsulation time. C: Optimisation of optimal serum action time. D: Optimisation of enzyme-labelled secondary antibody dilution. E: Optimisation of enzyme-labelled secondary antibody action time. F: Optimisation of optimal colour development time. P: Positive serum; N: Negative serum. A：封闭剂筛选；B：封闭时间优化；C：最佳血清作用时间优化；D：酶标二抗稀释倍数优化；E：酶标二抗作用时间优化；F：最佳显色时间优化. P：阳性血清；N：阴性血清

图选项

利用已优化的间接ELISA方法对已知标准的24份阳性血清和24份阴性血清进行检测，使用SPSS软件分析并绘制ROC曲线。结果显示，当OD₄₅₀=0.470 2时，Se为88%；Sp为100%，Youden指数=0.88最大(图 6)，AUC=0.986。因此，当OD₄₅₀≥0.470 2时，判定检测血清为阳性；当OD₄₅₀ < 0.470 2时，判定检测血清为阴性。

图 6　检测临界值的确定 Figure 6　Determination of detection critical value. A：48份血清检测结果. B：受试者工作特征曲线分析

图选项

将C. perfringens阳性血清和阴性血清分别使用PBS从1:100稀释到1:25 600，利用建立的间接ELISA方法进行检测。结果显示，当血清1:3 200稀释时，OD₄₅₀ > 0.519 (图 7)，仍可以检测到，表明该方法敏感性较高。

图 7　血清不同稀释倍数检测的OD值 Figure 7　Detection results of serum maximum dilution multiple.

图选项

结果显示，与其他阳性血清均无交叉反应(图 8)，表明该方法特异性较好。

图 8　特异性检测结果 Figure 8　Specific detection results.

图选项

结果显示，批间与批内试验变异系数均小于10% (表 2)，表明该方法重复性较好。

利用建立的C. perfringens间接ELISA抗体检测方法与商品化的产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒同时检测277份牦牛血清。结果显示，整体阳性率为89.89%，具体结果见表 3。此外，该方法与产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒鉴定阳性率88.09%符合，表明其具有良好的临床应用效果。

牦牛作为高原地区牧民家庭的主要养殖畜种，是当地畜牧业的重中之重，与地方经济发展紧密相关^{[7-8, 17]}。据报道，在高原地区产气荚膜梭菌的阳性率在22.99%‒47.06%。本研究选择在牦牛中C. perfringens流行率较高的A型、C型、D型的α毒素、β2毒素和ε毒素抗原性良好的肽段实现串联融合表达^[18-20]，建立适合检测牦牛C. perfringens抗体的间接ELISA方法。该方法检测C. perfringens阳性血清最大稀释倍数达1:3 200，与溶血性曼氏杆菌、传染性鼻气管炎病毒、牛支原体等11种代表性牛常见病原血清均无交叉反应，批间与批内试验变异系数均小于10%。运用本方法首次对四川省甘孜藏族自治州部分地区牦牛血清进行检测，结果整体阳性率为89.89%，与商品化的产气荚膜梭菌α毒素ELISA检测试剂盒检测结果基本一致，表明该方法具有良好的临床应用效果。

间接ELISA中包被抗原是建立该方法的前提。鲍长磊等^[21]基于重组表达的α毒素蛋白建立了间接ELISA抗体检测方法，该方法特异性为96.5%，敏感性为98%。吴霜等^[22]以β2毒素重组蛋白为靶抗原建立了间接ELISA抗体检测方法，并筛选出4株具有ELISA检测功能的单克隆抗体，且具有良好的特异性和敏感性。王武斌等^[23]以绵羊源C. perfringens的ε毒素重组蛋白为靶抗原建立了间接ELISA抗体检测方法，其检测血清敏感度为1:3 200，并且与其他病原菌阳性血清无交叉反应。据报道，α毒素虽存在所有型C. perfringens中，但仅在A型中表达水平最高^[9]。因此，本研究将β2和ε毒素部分片段与α毒素串联表达，以期在检测过程中加强与C型、D型反应。

临界值是影响间接ELISA结果准确判定的关键因素之一。通常使用检测阴性样品平均值x±3SD用于ELISA检测临界值的确定，但平均值x±3SD是假设数据服从正态分布，对于非正态分布数据可能会得到不准确的结果，而ROC曲线是将诊断试验结果划分为若干临界点，对所有可能的阈值加以计算，可显示灵敏度和特异性之间的相互关系，是较全面、准确评价诊断试验的有效工具。因此本试验采用ROC曲线法替代x±3SD方法^[24]。经C. perfringens ROC曲线法计算，间接ELISA抗体检测临界值为0.470 2，此时Se为88%，Sp为100%，所对应的约登指数最大，并且曲线下面积为0.986，表明准确性较好。

本研究成功建立了敏感、特异、稳定地检测牛C. perfringens抗体的间接ELISA方法，该方法已在临床牦牛血清样本中得到了初步应用，丰富了牦牛产气荚膜梭菌病流行病学数据，未来仍须进一步运用黄牛、水牛、奶牛等临床样品不断实践完善。