微生物学通报  2024, Vol. 51 Issue (8): 2785−2796
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病原微生物检测主要是通过病原微生物的特异性核酸来鉴别[1]。病原微生物检测技术在不断进步，但是现有检测技术，包括微生物培养、RT-PCR、质谱技术和基因测序技术等仍面临一些问题，如检测时间较长、检测特异性不够强、检测灵敏度不够高、检测范围有限和技术依赖性等。因此，现有检测技术仍需要进一步改进，以提高检测速度、范围和准确性，同时降低成本和技术门槛。
近年来出现了多种核酸等温扩增方法，具有简单易行、快速高效、灵敏度高、适用性广泛和仪器依赖度低等优点，如滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)[2]、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[3]、交叉引物扩增(cross priming amplification, CPA)[4]和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)[5]等。目前，RPA是应用较为广泛的等温扩增方法，在分子诊断[6]、食品安全检测[7]和环境监测[8]等领域广泛应用。相较于其他恒温扩增技术，RPA可在恒温37 ℃即可完成扩增过程，核酸扩增速度较快，可在30 min内获得目的扩增产物，并且不需要复杂仪器，可真正实现快速恒温核酸检测。RPA因其使用相对简单，具有更高的特异性、敏感性并可以使用多重引物等特点被广泛应用。然而，对于某些微量病原微生物，RPA的产物检测下限仍不能满足要求[9]，并且与PCR类似也会出现非特异扩增的问题[10]。因此，RPA的检测特异性有待进一步提升。
成簇的规律间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein, CRISPR/Cas)具有核酸酶活性，可应用于核酸检测领域[11]。基于CRISPR反式切割能力的诊断技术以specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK)诊断系统、highly one-hour low-cost multipurpose efficient system (HOLMES)诊断系统和DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter (DETECTR)诊断系统为代表，2016年，有研究者创造了基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK系统，Cas13a与sgRNA的复合物具有特异性识别靶RNA后激活其非特异性降解其他RNA的功能[12]。基于CRISPR-Cas12a的HOLMES系统则是通过PCR步骤实现模板扩增，利用Cas12a的反式切割活性对单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)和双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)靶标均能特异性识别[13]。相较于SHERLOCK系统只能切割靶RNA与HOLMES系统只能通过PCR实现模板扩增，基于CRISPR-Cas12a的DETECTR系统可通过RPA方法扩增产物，并通过Cas12a和sgRNA复合物进行特异性识别，同时激活Cas12a反式切割活性，可对靶dsDNA与非特异性ssDNA进行切割[14]。因而可将二者联用，由RPA负责恒温扩增靶标序列以提高靶序列的拷贝数，CRISPR/Cas12a负责特异性酶切靶标序列。同时，RPA-CRISPR/Cas12a既可以避免RPA的非特异性扩增，又可以提高检测的灵敏度[15]，也可对目的基因进行双重特异性识别，极大地提高检测特异性[16]。该方法既可用于拥有特殊仪器的实验室进行核酸定量检测[17]，也可仅采用便携式实时荧光检测仪或核酸试纸条用于现场和基层实验室大批量样本的初筛与检测[18]。
本文对RPA-CRISPR/Cas12a体系原理、产物检测手段及其在病原微生物中的最新应用进展进行阐述，并对其应用前景进行展望，以期为RPA-CRISPR/Cas12a体系的进一步应用提供一定的参考依据。
1 RPA-CRISPR/Cas12a体系原理 1.1 RPA-CRISPR/Cas12a体系构成RPA-CRISPR/Cas12a体系主要依赖于重组酶(T4UvsX)、单链结合蛋白(single-stranded binding protein, SSB)、链置换DNA聚合酶、CRISPR/Cas12a和CRISPR-derived RNA (crRNA)等，且以上物质最佳反应温度均为37 ℃左右。重组酶为T4噬菌体来源，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)。CRISPR Ⅱ类蛋白Cas12a是一个多功能蛋白，含有dsDNA结合域和核酸酶域。其中核酸酶域具有DNA内切酶活性，可以特异性地切割靶dsDNA，也可以非特异性切割ssDNA，但在不存在靶DNA的情况下，Cas12a的核酸酶活性是抑制的。crRNA是处理过的RNA分子，含有与靶DNA互补的序列，可以特异性识别靶DNA。但多个crRNA可以成簇，以提高靶向效率。因此，RPA-CRISPR/Cas12a体系主要由4种蛋白与1种crRNA构成，可在37 ℃完成整个反应。
1.2 RPA-CRISPR/Cas12a体系反应过程RPA-CRISPR/Cas12a反应过程如图 1所示。具体反应步骤如下：(1) 重组酶与正反向引物结合形成重组酶引物复合体，并在目的DNA中寻找同源序列，一旦定位到同源序列，重组酶引物复合体就会插入dsDNA形成D环结构，启动链置换反应，SSB蛋白与解开的DNA链结合防止进一步被置换；(2) 重组酶从重组酶引物复合体中被水解，3′端引物暴露并与DNA聚合酶结合；(3) DNA开始复制延伸；(4) 两条母链分离；(5) 形成两条新的互补dsDNA，实现模板上目标区域的指数式扩增[19]；(6) 在体系中加入crRNA与Cas12a，crRNA与Cas12a结合后也不会激活其酶活性，维持无活性状态；(7) 当crRNA结合的Cas12a与靶DNA发生碱基配对时，Cas12a的核酸酶域会被激活；(8) Cas12a核酸酶域对靶DNA进行剪切；(9) 生成大量标记的靶DNA片段；(10) 当Cas12a识别到靶DNA序列存在时，也会持续对单链探针底物进行DNA内切割，从而释放荧光报告基团，激活后的Cas12a也会被降解。周围ssDNA探针可以用荧光素和淬灭剂标记来实现检测功能。通过捕获荧光信号即可判断靶标DNA是否存在。
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| 图 1 RPA-CRISPR/Cas12a体系原理图示 Figure 1 Schematic representation of the RPA-CRISPR/Cas12a system. 1−5: Process of isothermal amplification reaction for the target gene in RPA-CRISPR/Cas12a system in B tube; 6−11: The nucleic acid shear process of target gene and fluorescent probe after adding Cas12a enzyme in the D tube. The whole reaction was completed at 37 ℃. PAM: Protospacer adjacent motif. 1−5：B管内RPA-CRISPR/Cas12a体系中目的基因进行等温扩增反应的过程；6−11：D管内加入Cas12a酶后进行目的基因及荧光探针的核酸剪切过程. 整个反应在37 ℃完成. PAM：原间隔序列临近基序 |
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采用实时荧光定量PCR仪、便携式实时荧光定量PCR仪可对RPA-CRISPR/Cas12a扩增的过程进行实时监测。如雷荣等[16]建立十足目虹彩病毒1 (decapod iridescent virus 1, DIV1)的快速检测方法，结果显示该方法可在40 min内实现对虾样本DNA中DIV1的检测，检测下限为10 copies/μL。Jiang等[20]开发了双艰难梭菌毒素的快速特异性检测平台，该平台的多重RPA-Cas12a荧光检测中，tcdA和tcdB的检测下限分别为10 copies/μL和1 copies/μL。因此，实时检测具有灵敏度高、特异性高、可定量和快速性等优点，已经成为病原微生物检测的重要方法之一。
2.1.2 基于数字PCR (digital PCR)的定量检测数字PCR的原理与荧光定量PCR相似，其将待测的DNA样本分割成几十到几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝数的目标分子，在其中进行RPA-CRISPR/Cas12a反应，然后根据反应区域中的扩增结果，可以确定反应区域的阳性与否，从而得到原始DNA样本中待测物质的数量。如Xia等[21]设计了一种无吸附自吸数字PCR芯片，并基于该芯片建立了用于超灵敏检测沙门氏菌病原体的直接数字双crRNA (3D)检测方法，该3D检测能够准确可靠地对沙门氏菌进行数字PCR绝对定量，检测下限为0.2 cell/mL，而且该测定无须提取核酸可直接检测牛奶中的沙门氏菌。相较于RT-qPCR，数字PCR具有绝对定量、灵敏度高、特异性高、不受抑制效应影响及灵活性高等优点，在病原微生物检测领域也具有重要的应用价值。
2.1.3 基于微流控芯片的定量检测利用微流控芯片的微型通道和微阀门的特性，可将扩增产物通过微流控芯片进行分离和检测。通过微阀门控制进样通道，使样品进入微流控芯片的微型通道中。然后通过控制微阀门的开闭状态，将混合物分离成不同的组分。常用的方法有电泳分离、滤波分离等。分离后的DNA扩增产物通过光学检测器进行检测。被Cass12a酶剪切后暴露荧光素的ssDNA，会在激发光的作用下发出荧光信号，检测器可以通过接收这些信号来确定是否存在特定的DNA序列。如Sun等[22]建立了基于RPA-Cas12a结合数字微流控(digital microfluidics, DMF)的RPA-Cas12a-DMF (RCD)平台，实现了流感病毒和SARS-CoV-2的自动化快速检测，平台内的反应液滴均处于微升级，可在30 min内完成检测；而且一个芯片可以检测多个反应区域，整个过程都在芯片中完成，降低了气溶胶污染的风险。其检测结果与RT-qPCR的结果一致。Huang等[23]开发了一种荧光微流体检测系统，用于诊断6种HPV亚型(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31和HPV33)，将RPA-Cas12a检测集成到微流体装置中，能够在35 min内检测处理过的临床样本，该测定使用112个临床拭子样本进行了验证，并获得了与RT-qPCR一致的结果，一致性为99.1%。因此，基于微流控芯片的定量检测技术在病原微生物检测中具有分析快速、样本和试剂用量低、灵敏度和准确性高，以及多重并行检测等特点，已经成为病原微生物检测领域的一种重要方法。
2.1.4 基于比色法的定量检测利用紫外-可见分光光度计测量RPA-CRISPR/Cas12a反应体系中的吸光度，通过比色反应进行终点判读，可判断扩增产物是否存在。Zhang等[24]提出了一种逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)与CRISPR-Cas12a比色测定相结合的SARS-CoV-2检测方法，并利用金纳米颗粒(Au nanoparticles，AuNPs)作为通用比色读数，可以通过紫外-可见分光光度计进行检测，灵敏度可达每次测试1个病毒基因组序列拷贝数。Mao等[25]通过比色法对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因进行检测，检测下限为20 copies/mL，并且未观察到与其他病毒的交叉反应。比色法测定具有宽线性范围，能够同时检测低浓度和高浓度的样品，并进行定量检测。
2.2 定性检测 2.2.1 基于肉眼的定性检测基于肉眼的定性检测无需专用设备，可直接通过蓝/紫光照射进行观测。当样品中的荧光物质遇到蓝光或紫外光时会处于激发态，进而发生弛豫过程，即从激发态跃迁到基态。在这个过程中，荧光物质会重新辐射出能量较低的可见光。不同的荧光物质会辐射出不同波长的可见光[26]。Lin等[27]检测食品中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)时可以在紫外线照射下用肉眼检测样品，这种新颖的测定方法可在1 ℃下10 min内特异性稳定地检测低至37−40 copies/μL的金黄色葡萄球菌。Wang等[28]提出了一种Cas12a荧光测定法区分临床样品中的主要皮肤癣菌，结果可在蓝光下30 min内肉眼直接可见，所有测试样品均与真菌培养和ITS测序结果一致。此外，也可通过加入阳离子水溶性共轭聚噻吩(cationic water-soluble conjugated polythiophene, PMNT)[29]使溶液颜色和荧光强度发生相应的变化，并通过这一信号变化实现检测。刘华等[30]在快速检测转基因植物外源基因CP4-EPSPS中使用聚噻吩显色技术，进行RPA-CRISPR/Cas12a反应后，加入PMNT溶液，裸眼观察溶液从红色变为黄色，紫外光照射下则为橘红色变为橙黄色，检出限为45拷贝数。Jiang等[31]提出了一种快速的可视化检测方法，将其命名为“Cas12aVIP”，通过将RPA-CRISPR/Cas12a系统和PMNT相结合，在无靶DNA的情况下溶液为红色，存在靶基因时显示为黄色，从而实现靶DNA的比色检测。该检测技术无需特殊技术或辅助设备，具有快速简便、可视化结果和低成本等优点，可在40 min内完成，为现场或者基层快速核酸检测提供了参考。
2.2.2 基于凝胶电泳的定性检测凝胶电泳是一种通过利用DNA在电场中的迁移速度差异，将DNA片段按照大小分离的技术。通过在凝胶上形成电场，将DNA样品加入凝胶孔道中，施加电压使DNA片段在凝胶中迁移，较短的片段迁移距离较长，较长的片段迁移距离较短，从而实现分离[32]。Tian等[33]根据模板浓度和琼脂糖凝胶电泳结果无拖曳现象，开发了快速核酸裂解液的最佳方案，并验证了CRISPR/Cas12a结合RPA技术的快速检测能力。凝胶电泳技术现通常用于产物检测技术的对照与验证试验。
2.2.3 基于试纸条的定性检测基于试纸条定性检测的原理主要是抗原抗体特异性结合。试纸条上固定的试剂通常含有特定的抗原或抗体，如检测线上的标记抗体与结合垫区域的标记基质。检测线上被检测物质与试剂发生特定的抗原-抗体反应，产生可见的颜色变化。质检线上不与被检测物质发生反应，而是与结合垫区域标记基质发生反应，产生可见的颜色变化。这种检测方法可以使得检测结果可视化，并进行快速检测，更适合应用于检测设备不全面的基层检测或需要快速出结果的现场检测。如黄坚等[34]建立了靶向猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1, FHV-1)基因的快速可视化检测方法，结果显示，该方法可以特异性地检出FHV-1，灵敏度极高(最低检测下限为2.35×10−1 copies/μL)，检测时间短，结果可视化。Liu等[35]针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) UreB基因开发了快速检测系统，可在50 min内完成，用于临床幽门螺杆菌早期诊断和检测，结果显示基于侧向流动试纸条的检测下限为12拷贝数。该检测手段对环境的要求低，仅需一台便携式恒温仪器，恒温条件37 ℃就可进行反应，简便快捷，操作易上手，且更适用于快速现场检测、口岸检疫等场景。
3 RPA-CRISPR/Cas12a应用进展 3.1 在病毒检测方面的应用传统的病毒检测方法可能存在一定的局限性。另外，一些病毒含量非常低或者存在于样本中的其他物质干扰可能会影响到准确的病毒检测。因此，发展更快速、精确的病毒检测方法至关重要。徐博文等[18]针对非洲猪瘟病毒(ASFV) B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA与引物(RPA1-F/RPA1-R, RPA2F/RPA2-R)建立了ASFV的快速检测方法，结果显示，该方法仅能检测出ASFV，最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL。何雨龙等[36]以马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)为检测对象，通过与核酸粗提及逆转录反应联合，可在非实验室环境下进行PVY检测，整个过程耗时约60 min；检测模板的最低限度为3×102 copies/μL，灵敏度高于PCR及qPCR检测法。该研究为在非实验室条件下实时快速检测植物病毒提供了一种有效方法。Gong等[37]开发了一种集成式的三位一体检测呼吸道合胞病毒A和B (respiratory syncytial virus A and B, RSV A and RSV B)系统，该系统可以检测到1.38×10−1 copies/μL浓度的病毒，并且可以在37 min内区分RSV A或RSV B，RSV A的敏感性和特异性分别为73.08%和90%，RSV B的敏感性和特异性分别为42.86%和93.33%。因此，RPA-CRISPR/Cas12a在病毒检测方面具有极高的灵敏度和特异性，并且已经有了较为广泛的应用，对病毒的检测和预防提供了方便可靠的现场诊断工具。
3.2 在细菌检测方面的应用细菌检测大多数是通过传统的分离培养鉴定，这种方法不仅耗时耗力，而且操作过程中可能会对实验人员安全产生一定的威胁，也需要较长的时间和复杂的操作流程，且可能存在一定的误差率。栾天等[38]根据猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, App) apxIVA基因，设计CRISPR-Cas12a特异性gRNA与RPA引物，建立可用于临床检测App的方法；该方法仅对App的检测为阳性，特异性较强；敏感性试验结果显示该方法对App重组质粒标准品的检测下限可达10 copies/μL，比普通PCR方法敏感性高1 000倍。目前，现有的多杀性巴氏杆菌检测方法耗时长，需要复杂的专业操作，限制了现场检测的应用。Hao等[39]提出了一体可视化CRISPR-Cas12a (naked-eye CRISPR-Cas12a, Cas12a-NEye)平台方法用于检测多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，整个实验过程包括快速DNA提取(< 1 h)和Cas12a-NEye测定(25 min)，可在1.5 h内完成，检测下限是个位数的拷贝数，且仅对多杀性巴氏杆菌的检测为阳性。建立快捷准确的RPA-CRISPR/Cas12a分子检测技术对于细菌病原鉴定有重大现实意义。因此，RPA-CRISPR/ Cas12a在细菌检测方面展示出了快速省力、安全可靠的特点，并具有极高的灵敏度和特异性，在食品检测及动植物疾病检测方面具有较大的应用前景。
3.3 在真菌检测方面的应用目前在医学上对真菌的检测主要是通过其形态学和生理学等表型进行鉴别，而这些方法往往所需周期长且检出率低[40]。向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii)与丁香疫霉病菌(Phytophthora syringae)均是我国的植物检疫性有害生物，邝瑞瑞等[15]根据向日葵黑茎病菌及其近似种的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列差异，设计特异性RPA引物和CRISPR-Cas12a的crRNA，建立了向日葵黑茎病快速检测方法，结果显示荧光法检测灵敏度与实时荧光PCR的灵敏度相当，最低检测量为0.1 pg，试纸条法检测最低检测量为1 pg。雷荣等[16]根据GenBank中丁香疫霉病菌的Ypt1基因设计特异性引物，建立荧光法和侧向流层析试纸条快速检测方法，结果显示该方法在37 ℃扩增40 min，能特异性地检测丁香疫霉菌，灵敏度为133 fg，与荧光定量PCR相当。RPA-CRISPR/Cas12a为真菌诊断提供了快速、准确的新方法。因此，RPA-CRISPR/Cas12a在真菌检测方面展示出了快速准确、灵敏度高等特点，并在疾病诊断和食品质量评估的快速检测方面有广阔的应用前景。
3.4 在寄生虫检测方面的应用寄生虫病严重危害人体健康及畜禽养殖业，通常对其诊断主要依靠临床表现或者从动物分泌物等分离观察卵或者幼虫，这些常规方法不仅费时费力，而且诊断时已经产生不良后果。现需要一种针对早期寄生虫的检测方法。Li等[41]设计了阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)一体化检测技术，选择肌动蛋白作为靶基因设计RPA引物，并基于Cas12a结合位点设计crRNA，检测结果可在60 min内完成，最低检测下限为1 copies/μL，经特异性验证后与白色念珠菌(Candida albicans)、人原体、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、微小隐孢子虫、十二指肠G或刚地弓形虫无交叉反应。因此，RPA-CRISPR/Cas12a在早期寄生虫检测方面展现出了快速便捷、准确便宜的优点，具有人体健康及畜禽养殖业等方面的检测应用前景。
3.5 在其他病原微生物检测方面的应用除了上述四大主要类别的检测，还有关于转基因植物外源基因的检测，如外源基因CP4-EPSPS[39]通过RPA-CRISPR/Cas12a体系提供便捷诊断的方法。常见病原经常会混合感染，所以RPA-CRISPR/Cas12a检测技术不会局限于单一的病原检测，有望向着多重检测方向发展，扩大检测的范围。如Sun等[22]、Jiang等[20]和Jiao等[42]分别建立了关于不同细菌和病毒的结合CRISPR-Cas12a的多重RPA检测技术。其检测灵敏度高、特异性强、反应时间短，可用于现场检测与基层检测，具有良好的应用前景。
4 机遇与挑战RPA-CRISPR/Cas12a系统作为新一代的可扩展型诊断技术，开创了分子诊断的新时代，该系统表现出灵敏度高、特异性好、价格低廉和操作简单的优点，并且可以实现快速即时检测，在病原微生物检测方面展示出巨大的应用潜力。另外，随着RPA-CRISPR/Cas12a体系的快速发展，这一检测系统将在疾病诊断、环境评估和食品质量快速评估等领域有广阔的前景。
RPA-CRISPR/Cas12a的发展仍面临多重挑战，如：(1) 在保证检测灵敏性的条件下，开发临床样本的预处理方法、设计多条crRNA等，优化或免除核酸的提取。我们可以探索利用各种新型蛋白酶等酶解剂去除样本中的蛋白质干扰物，从而提高核酸的纯度。(2) 建立基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的定制型高通量检测或多病原检测方法及与自动化、人工智能等多学科的交叉[43]。可以利用自动化设备和人工智能算法，结合RPA-CRISPR/Cas12a系统，构建高通量的检测平台，然后通过优化反应条件、引物设计和测量仪器等方面的参数，最终实现对多个目标的同时检测。(3) 目前尚无针对RPA-CRISPR/Cas12a特异性引物设计的软件，因此需要较长时间优化引物序列。我们可以结合生物信息学工具和算法，发明简单便捷的引物设计软件，以加快引物设计的速度和准确性。这需要各学科一起发展进步。(4) PAM序列是CRISPR系统用于辨别目标序列的一部分，但有可能限制其核酸序列检测范围。因此，在设计CRISPR-Cas12a系统应用于特定目标序列之前，需要先确定目标序列中是否存在合适的PAM序列。若不存在，也可通过引入人工修饰来改变Cas12a对PAM序列的识别要求，或使用引物引导的扩增技术来增加目标序列的PAM序列。这些方法可以在一定程度上扩展CRISPR-Cas12a系统的应用范围。因此，RPA-CRISPR/Cas12a仍具有较大的拓展潜力。
5 结论综上所述，RPA-CRISPR/Cas12a具有检测特异性更强、灵敏度更高、适用范围广、操作简单、快速灵活、高通量和自动化等诸多优点，在病原微生物检测方面展现出优越的应用前景。此外，目前RPA-CRISPR/Cas12a的试剂成本比PCR高，但其人力成本与操作时间相对较少，未来可通过条件优化与创新来降低成本，获得更加完全的反应体系，将有更加广阔的应用空间，最终成为强有力的新一代检测工具。
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