微生物学通报  2024, Vol. 51 Issue (6): 2158−2169
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纤维素是秸秆的主要成分之一，约占秸秆成分的30%−40%[1]。我国秸秆产量大、种类繁多，每年因秸秆产生的资源浪费、环境污染等问题引起了广泛的关注。据统计，东北地区秸秆产量占全国秸秆总产量的21.63%，秸秆利用率仅为63.43%[2]。东北地区由于具有冬季气温低、持续时间长等特点，作物收获后秸秆降解速度慢，很难在春季耕作前全部腐解[3]。生产中常使用秸秆分解菌剂加速秸秆的降解[4]。获取低温纤维素降解微生物资源是促进还田秸秆加速降解的关键方法之一。
目前，已被筛选出的纤维素降解菌株的种类很多，如真菌、细菌、放线菌。相较于真菌和放线菌，细菌对极端环境的适应能力较强且产生的纤维素酶活性较高[5]。孟建宇等[6]从内蒙古西部地区偏碱性土壤中共分离出5株低温(4 ℃)嗜碱性纤维素降解细菌，其酶活最高的菌株为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。单建荣等[7]从黑龙江省哈尔滨牛场的冻牛粪和辽宁省凤凰山冻土中共分离得到11株低温(9 ℃)纤维素降解纯培养菌株，刚果红降解圈最大的菌株为假单胞菌属(Pseudomonas)。Thakur等[8]从喜马拉雅山不同地点共获得低温(10 ℃)细菌355株、嗜冷(4 ℃)细菌35株；其中，假单胞菌属(Pseudomonas)最多，其次为芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和黄杆菌属(Flavobacterium)；这些细菌都可以在pH 5.0−10.0、NaCl浓度为2%下生长，并且70%以上都具有纤维素降解能力。由此可见，细菌在低温环境中依然具有分布广泛、种类繁多的特点，是当前纤维素类物质降解研究的首选。由于样品的地理位置不同导致获得的微生物资源种类各不相同，对纤维素的降解能力也存在差异。然而，已获得的低温纤维素降解细菌类型较少，降解能力不能满足实际的需求，需要扩充低温高效纤维素降解菌种资源。
为了获得适宜东北黑土区的秸秆降解和纤维素酶产酶能力较强的纯培养菌株，扩展低温纤维素降解微生物资源，本研究从冬季东北黑土区的土壤中分离低温纤维素降解细菌，通过优化菌株的产酶条件并分析其对滤纸、水稻秸秆和玉米秸秆的降解能力，以期为寒冷地区秸秆快速降解提供新的菌种资源。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品取冬季乌苏里江边农田(134°18.51′E, 48°22.10′N)土壤样品，取样时气温为9 ℃，使用取样器采集5−10 cm深的土壤于自封袋内冰袋箱保存，返回实验室于4 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 培养基初筛培养基(g/L)：CMC-Na 10.0，(NH4)2SO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1.0，NaCl 0.3，琼脂粉20.0。
产酶培养基(g/L)：在初筛培养基的基础上，添加1.0酵母浸粉。
纤维素材料降解培养基：在产酶培养基的基础上，将10.0 g/L CMC-Na分别替换为5.0 g/L滤纸、5.0 g/L水稻秸秆和5.0 g/L玉米秸秆。
不同纤维材料的处理：使用前将滤纸剪成1 cm×1 cm的正方形，水稻秸秆和玉米秸秆剪成2 cm的小段，在105 ℃烘干8 h后加入培养基中。
1.1.3 主要试剂和仪器CMC-Na，西陇科学股份有限公司；(NH4)2SO4，福晨(天津)化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O和NaCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；刚果红，天津市科密欧化学试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技(北京)有限公司。
紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；扫描电镜，日立科学仪器(北京)有限公司；微型pH计，Horiba公司。
1.2 低温纤维素降解菌株的筛选 1.2.1 菌株的初筛取5 g土壤样品置于装有50 mL灭菌蒸馏水的100 mL锥形瓶中，15 ℃、160 r/min振荡培养1 h后静置30 min。取上清液进行稀释涂布，分别选取10−3−10−6稀释液于初筛培养基内进行涂布，每个梯度3个重复，15 ℃静置培养。待有菌落长出后分别挑取不同形态的菌落进行划线培养，反复划线后得到纯培养菌株。
1.2.2 菌株的复筛将得到的纯培养菌株点种于初筛培养基中间位置，15 ℃培养7−10 d后用1.0 g/L刚果红溶液浸染1 h，弃掉溶液，再加入1 mol/L NaCl溶液脱色1 h，选取有透明圈出现的菌株进行后续试验。测定菌株水解圈直径(D, cm)和菌落直径(d, cm)，并根据水解圈直径与菌落直径的比值(D/d)判断菌株产纤维素酶的能力。
1.3 纤维素酶活力测定CMC酶活和滤纸酶活的测定方法参照文献[9]并稍作改动。
将菌株接种于液体产酶培养基中15 ℃静置培养18 d，每48 h取2 mL菌液，3个重复，15 ℃、12 000 r/min离心10 min，将上清液分别加入以1%的CMC溶液和滤纸条为反应底物的试管中，以未接菌培养基的上清液作为对照，15 ℃反应30 min后立即加入2 mL DNS试剂终止反应。在紫外分光光度计波长为540 nm下测定菌株的吸光值，并通过标准曲线分别计算出CMC和滤纸酶活力大小。
1.4 菌种鉴定 1.4.1 形态学鉴定将菌株接种于初筛培养基中，固体培养基用于观察革兰氏染色和芽孢染色，液体培养基用于扫描电镜观察。革兰氏染色方法参照文献[10]。芽孢染色方法参照文献[11]。在无菌环境下，取1 mL菌液在10 000 r/min下离心5 min，倒掉上清加入2.5%的戊二醛固定液过夜；用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗3次，每次15 min；用1%锇酸溶液固定样品，1−2 h后倒掉废液并漂洗3次；用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇进行梯度脱水，每个梯度脱水2次，每次15 min；最后将处理好的样品置于扫描电镜下观察并拍照。
1.4.2 生理生化鉴定参照《常见细菌与古菌系统分类鉴定手册》[12]和《伯杰氏系统细菌学手册》[13]的研究方法，通过淀粉水解试验、明胶液化试验、甲基红试验、V-P试验、硫化氢产气试验、碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和甘露醇)利用试验，对菌株生理生化特性进行鉴定。
1.4.3 分子生物学鉴定利用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGAT CATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TAGGGTTACC TTGTTACGACTT-3′)对菌株进行16S rRNA基因序列扩增。PCR反应体系(50.0 μL)：基因组DNA (20 ng/μL) 1.0 μL，10×Buffer (含2.5 mmol/L Mg2+) 5.0 μL，Taq聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1.0 μL，27F引物(10 μmol/L) 1.5 μL，1492R引物(10 μmol/L) 1.5 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 7 min。将纯化后的产物送至上海派森诺生物科技有限公司进行测序。使用NCBI BLAST程序将测序结果与数据库中的序列进行比对，确定与目标菌株相似性最高的菌属，并构建系统发育树。
1.5 产酶条件优化 1.5.1 单因素试验设计在产酶培养基中其他成分不变的情况下，选取初始pH、装液量、接种量、温度、酵母添加量5个因素进行产酶条件优化。分别设置初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，装液量为40/100、50/100、60/100、70/100、80/100 (mL/mL)，接种量为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%，培养温度为5、10、15、20、25 ℃，酵母添加量为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/L，测定以上条件下菌株CMC酶活力。
1.5.2 正交试验设计在单因素试验的基础上，选取初始pH、装液量、接种量和培养温度4个因素的显著范围，如表 1所示。使用SPASSAU在线软件设计四因素三水平试验方案，以CMC酶活为响应值，对菌株的培养条件进行优化。
| 序号 Number |
初始pH Initial pH |
培养温度 Culture temperature (℃) |
装液量 Liquid loading volume (mL) |
接种量 Inoculum volume (%) |
| 1 | 6.0 | 5 | 40 | 10.0 |
| 2 | 7.0 | 10 | 50 | 12.5 |
| 3 | 8.0 | 15 | 60 | 15.0 |
将菌株接种于最佳培养条件下进行培养，传代稳定后，测定其CMC酶活力大小，并与优化前的酶活进行对比。
1.6 对不同纤维材料的降解采用优化后的培养条件，将菌株分别接种于已灭菌且含有60 mL产酶培养基的100 mL锥形瓶中，瓶内分别加入0.3 g烘干后的滤纸片、剪成2 cm小段的水稻秸秆及玉米秸秆，15 ℃静置培养，每48 h取样1次，每次3个重复，使用失重法[14]测定菌株在生长过程中对不同纤维材料的降解能力，并利用Origin 8.5软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 菌株的分离与筛选使用初筛培养基反复划线培养共获得7株单菌，经刚果红染色及NaCl溶液脱色后有1株单菌出现较明显的透明圈，如图 1所示，将其命名为BYAU-LC3。产生的水解圈直径为3.5 cm，菌落直径为0.8 cm。菌株BYAU-LC3在生长过程中纤维素酶活力变化如图 2所示。在第0−2天滤纸酶活和CMC酶活快速升高，分别为129.58 U/mL和125.35 U/mL，之后滤纸酶活一直高于CMC酶活，在第14天CMC酶活超过滤纸酶活达到最高值为283.51 U/mL，因此，选择CMC酶活作为后续试验的响应值。
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| 图 1 菌株BYAU-LC3产生透明圈 Figure 1 Strain BYAU-LC3 produces hyaline circles. |
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| 图 2 菌株BYAU-LC3纤维素酶活力变化 Figure 2 Changes in cellulase activity of strain BYAU-LC3. |
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菌株BYAU-LC3在初筛培养基上呈不规则形状，乳白色不透明，表面有褶皱，质地如胶一样黏稠，单个菌落易挑起、不易分离，如图 3所示。经扫描电镜观察，菌株BYAU-LC3为革兰氏阴性，无孢子产生。扫描电镜结果显示，菌体长度约为0.93 μm，直径约为0.53 μm，呈短杆状且两端钝圆，表面粗糙有颗粒感，如图 4所示。
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| 图 3 菌株BYAU-LC3形态观察 Figure 3 Morphological observation of strain BYAU-LC3. |
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| 图 4 菌株BYAU-LC3电镜观察(3 000×) Figure 4 Electron microscopic observation of strain BYAU-LC3 (3 000×). |
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菌株BYAU-LC3的生理生化试验结果如表 2所示，淀粉水解试验和明胶液化试验结果呈阳性，说明菌株BYAU-LC3能够水解淀粉和明胶；甲基红试验、V-P试验、硫化氢产气试验结果呈阴性，说明菌株BYAU-LC3不能产生酸性物质；碳源利用试验中的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖利用试验结果呈阳性，甘露醇利用试验结果呈阴性，说明菌株BYAU-LC3能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖。
| Item | Result |
| 淀粉水解试验 Starch hydrolysis test |
+ |
| 明胶液化试验 Gelatin liquefaction test |
+ |
| 甲基红试验 Methyl red test |
− |
| V-P试验 V-P test |
− |
| 硫化氢产气试验 Hydrogen sulfide gas production test |
− |
| 葡萄糖利用试验 Glucose utilization test |
+ |
| 蔗糖利用试验 Sucrose utilization test |
+ |
| 乳糖利用试验 Lactose utilization test |
+ |
| 半乳糖利用试验 Galactose utilization test |
+ |
| 甘露糖利用试验 Mannitol utilization test |
− |
| +：反应为阳性；−：反应为阴性 +: Reactions are positive; −: Reactions are negative. |
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将测序得到的序列在NCBI BLAST数据库进行比对，下载与菌株BYAU-LC3亲缘性最相似的7个标准菌株序列，并利用MEGA 11软件构建系统发育树，如图 5所示。菌株BYAU-LC3与Duganella dendranthematis在同一个分支上，且一致性为100%，结合形态学、生理生化特性初步判断为杜擀氏菌属(Duganella)。同时，菌株BYAU-L3的核酸序列已提交至NCBI数据库，获得的GenBank登录号为PP448179。
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| 图 5 菌株BYAU-LC3的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of strain BYAU-LC3. 参与对比的标准菌株登录号列于括号中；分支位置的数字代表自展值；标尺长度为0.1核苷酸置换率 Preservation numbers of standard strains involved in the comparison are listed in parentheses; Numbers in branch positions represent self-expansion values; Scale lengths are 0.1 nucleotide substitution rates. |
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不同培养温度对菌株BYAU-LC3 CMC酶活力的影响如图 6所示。当培养温度为10 ℃时，酶活最高为421.33 U/mL；当培养温度为25 ℃时，酶活力最低为313 U/mL；说明菌株BYAU-LC3适合在较低的温度下生长，因此，选择培养温度在5−15 ℃区间进行后续试验。
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| 图 6 培养温度对CMC酶活的影响 Figure 6 Effect of culture temperature on CMC enzyme activity. |
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不同初始pH对菌株BYAU-LC3 CMC酶活力的影响如图 7所示。当初始pH值为6.0时，酶活最高为382.67 U/mL；当初始pH值为9.0时，酶活最低为213.83 U/mL；说明菌株BYAU-LC3适合在偏酸性环境下生长，因此，选择初始pH值在5.0−7.0区间进行后续试验。
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| 图 7 初始pH值对CMC酶活的影响 Figure 7 Effect of initial pH on CMC enzyme activity. |
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不同装液量对菌株BYAU-LC3 CMC酶活力的影响如图 8所示。当装液量为50 mL时，酶活最高为433.13 U/mL；当装液量为80 mL时，酶活最低为331 U/mL；说明菌株BYAU-LC3适合在氧气含量较高的环境下生长，因此，选择装液量在40−60 mL区间进行后续试验。
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| 图 8 装液量对CMC酶活力影响 Figure 8 Effect of liquid loading volume on CMC enzyme activity. |
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不同接种量对菌株BYAU-LC3 CMC酶活力的影响如图 9所示。当接种量为12.5%时，酶活最高为474.2 U/mL；当接种量为5.0%时，酶活最低为252.98 U/mL；说明菌株BYAU-LC3在接种量较高的环境下生长最快，因此，选择接种量在10.0%−15.0%区间进行后续试验。
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| 图 9 接种量对CMC酶活的影响 Figure 9 Effect of inoculum volume on CMC enzyme activity. |
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氮源是微生物生长所必需的元素之一，与无机氮源相比，有机氮源不仅含有氮元素，还包含其他生长所需要的营养。不同酵母添加量对菌株BYAU-LC3 CMC酶活力的影响，如图 10所示。当酵母添加量为0.75 g/L时，酶活最高为417.33 U/mL；当酵母添加量为1.50 g/L时，酶活最低为301.33 U/mL；说明酵母的添加量过多会抑制微生物的活性，因此，选择酵母添加量在0.50−1.00 g/L区间进行后续试验。
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| 图 10 酵母添加量对CMC酶活的影响 Figure 10 Effect of yeast addition on CMC enzyme activity. |
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根据正交试验设计进行四因素三水平试验分析，共9个试验点，将最终获得的CMC酶活结果填入表 3并对其进行方差分析。K代表 3个水平结果的总和，k代表 3个水平结果总和的平均数。R是极差分析，数值越大因素越显著。从R值可以看出，因素的显著性大小依次为：培养温度 > 初始pH > 装液量 > 接种量。根据k值最大水平得出菌株BYAU-LC3最佳培养条件为：培养温度15 ℃、初始pH值7.0、装液量50/100 mL、接种量12.5%。P < 0.05说明得到的显著因素具有理论科学性。
| 序号 Number |
A初始pH A Initial pH |
B培养温度 B Culture temperature (℃) |
C装液量 C Liquid loading volume (mL) |
D接种量 D Inoculum volume (%) |
CMC酶活 CMC enzyme activity (U/mL) |
| 1 | 6.00 | 5.00 | 40.00 | 10.00 | 171.91 |
| 2 | 6.00 | 10.00 | 60.00 | 12.50 | 267.63 |
| 3 | 6.00 | 15.00 | 50.00 | 15.00 | 396.04 |
| 4 | 7.00 | 15.00 | 60.00 | 10.00 | 411.52 |
| 5 | 7.00 | 5.00 | 50.00 | 12.50 | 308.32 |
| 6 | 7.00 | 10.00 | 40.00 | 15.00 | 324.84 |
| 7 | 8.00 | 10.00 | 50.00 | 10.00 | 329.40 |
| 8 | 8.00 | 15.00 | 40.00 | 12.50 | 351.90 |
| 9 | 8.00 | 5.00 | 60.00 | 15.00 | 185.86 |
| K1 | 825.58 | 666.09 | 848.65 | 912.83 | |
| K2 | 1 044.68 | 911.87 | 1 033.76 | 917.85 | |
| K3 | 867.16 | 1 159.46 | 855.01 | 906.74 | |
| k1 | 275.19 | 222.03 | 282.89 | 304.28 | |
| k2 | 348.23 | 303.96 | 344.59 | 305.95 | |
| k3 | 289.05 | 386.49 | 285.00 | 302.25 | |
| R | 73.03 | 164.46 | 61.70 | 3.70 | |
| 离差平方和 Sum of squares | 9 027.45 | 40 569.17 | 7 361.97 | 20.64 | |
| 自由度 Degree of freedom | 2.00 | 2.00 | 2.00 | 2.00 | |
| 均方 Mean square | 4 513.73 | 20 284.59 | 3 680.98 | 10.32 | |
| F值F value | 437.47 | 1 965.98 | 356.76 | 1.00 | |
| P值P value | 0.002 3 | 0.000 5 | 0.002 8 | 0.500 0 | |
| 最优培养条件 Optimal culture conditions | B3A2C2D2 | ||||
采用优化后的条件对菌株BYAU-LC3进行培养，得到CMC酶活力为398.2 U/mL，比优化前的酶活力提高了40.45%，说明正交试验优化的结果存在实际应用价值。
2.6 不同纤维材料的降解情况菌株BYAU-LC3对滤纸、水稻秸秆和玉米秸秆的降解率变化如图 11所示。滤纸在0−2 d开始变黄，2−6 d大部分变黄，6−14 d逐渐崩解，之后趋于平稳；水稻秸秆的降解率在2−14 d逐渐升高，14−18 d缓慢上升，18 d后趋于平稳；玉米秸秆的降解率在2−8 d缓慢上升，8−12 d快速升高到最高点后趋于平稳。在第18天，滤纸、水稻秸秆和玉米秸秆的降解率分别为19.24%、9.48%、7.30%。相较于水稻秸秆和玉米秸秆，菌株BYAU-LC3对滤纸的降解效果最好。
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| 图 11 菌株BYAU-LC3对不同纤维素材料的降解情况 Figure 11 Degradation of different cellulosic materials by strain BYAU-LC3. |
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目前，已获得的低温纤维素降解细菌的种类多集中在变形菌门(Proteobacteria)[15]、拟杆菌门(Bacteroidetes)[16]、厚壁菌门(Firmicutes)[17]等，本研究得到的杜擀氏菌属(Duganella)是已有研究中具有纤维素降解能力的新的菌属。李春艳等[18]对筛选得到的低温纤维素降解细菌FLX-1的产酶条件优化后，在10 ℃下CMC酶活为13.67 U/mL。本研究得到的菌株BYAU-LC3在10 ℃下CMC酶活为421.33 U/mL，远高于李春艳等的研究结果。酶活差距较大的原因可能是采集的样品、所用培养基及菌种的理化性质不同。然而，根据Morita[19]对嗜冷菌和耐冷菌的定义，菌株BYAU-LC3被认为是耐冷菌。培养基中的成分以及pH值变化均是影响微生物活性的重要条件。王敬红等[20]以硝酸铵、酒石酸铵、硝酸钠、氯化铵、酵母浸粉、尿素和蛋白胨为氮源种类进行条件优化，最终得到硝酸钠为单一氮源的降解效果最好。本研究是通过改变酵母浸粉的添加量得到菌株的最佳产酶条件。孟建宇等[21]分离出的常温纤维素降解细菌CB04最适产酶pH值为7.0，这与本研究的结果一致。综合以上研究，菌株BYAU-LC3具有耐低温、产酶活性高的特性，在一定的pH范围内能够产生纤维素酶。经过产酶条件优化后，菌株BYAU-LC3的CMC酶活提高了40.45%。
以往的研究表明，通过固态发酵[22]以及复合菌系的构建[23]可以提高低温纤维素降解纯培养菌株对秸秆的降解能力。本研究分别测定了菌株BYAU-LC3在静置状态下对滤纸、水稻秸秆及玉米秸秆的降解率变化。结果表明，菌株BYAU-LC3对玉米秸秆的降解率要低于水稻秸秆，原因可能是玉米秸秆中木质素的含量较高[24]或玉米秸秆角质层结构较复杂[25]，使微生物很难穿透其表面对纤维素进行分解。然而，菌株BYAU-L3对滤纸的降解率高于水稻秸秆和玉米秸秆，主要是滤纸的成分相对简单、对水的亲合力较强且表面有无数的小孔可供菌液通过。因此，通过比较菌株BYAU-LC3对不同纤维材料的降解能力，得出菌株BYAU-LC3对秸秆类纤维材料的降解能力与其呈现出的纤维素酶活力存在一定差异。
本研究主要从冬季土壤样品中获得一株纤维素酶活较高的纯培养菌株，其对不同纤维材料具有一定的降解能力，后续可以与其他具有纤维素降解能力的菌株构建成低温秸秆降解复合菌系，以便更好地应用于寒区秸秆还田中。
4 结论(1) 本试验筛选得到一株低温纤维素降解细菌BYAU-LC3，其CMC酶活最高为283.51 U/mL。
(2) 最佳产酶条件为：温度15 ℃、初始pH值7.0、装液量50/100 mL、接种量12.5%，此时的CMC酶活为398.2 U/mL，比优化前提高了40.45%。
(3) 在最佳培养条件下，菌株BYAU-LC3对滤纸、水稻秸秆和玉米秸秆的降解率分别为19.24%、9.48%、7.30%。
(4) 该菌株在低温环境下的生长状态良好且具有一定的纤维素降解能力，为寒区秸秆降解微生物资源提供了新的菌种资源。
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表1(Table 1)
