2024, Vol. 51
表1(Table 1)
宏基因组学在环境微生物组研究中的应用与展望
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文章信息
- 王慧, 鞠峰
- WANG Hui, JU Feng
- 宏基因组学在环境微生物组研究中的应用与展望
- Applications and perspectives of metagenomics in environmental microbiome research
- 微生物学通报, 2024, 51(6): 1814-1833
- Microbiology China, 2024, 51(6): 1814-1833
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.231088
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文章历史
- 收稿日期: 2023-12-30
- 接受日期: 2024-03-06
- 网络首发日期: 2024-04-09
王慧, 鞠峰. 宏基因组学在环境微生物组研究中的应用与展望[J]. 微生物学通报, 2024, 51(6): 1814-1833.
WANG Hui, JU Feng. Applications and perspectives of metagenomics in environmental microbiome research[J]. Microbiology China, 2024, 51(6): 1814-1833.
宏基因组学在环境微生物组研究中的应用与展望
1. 西湖大学工学院环境微生物组与生物技术实验室, 浙江 杭州 310030;
2. 西湖大学生命科学学院 西湖实验室, 浙江 杭州 310030
2. 西湖大学生命科学学院 西湖实验室, 浙江 杭州 310030
摘要: 自2005年罗氏公司推出首台商业化第二代DNA测序仪，基于高通量测序的宏基因组学方法被广泛用于各种环境中微生物群落的组成和功能分析，揭示了环境微生物组中蕴藏着的大量未被发现的新物种、新基因、酶和代谢过程。该系列工作表明了未培养微生物在驱动生物地球化学循环中发挥着重要作用，同时促进了污染物降解、环境修复、生物技术和天然药物研发等领域的理论突破和技术创新。本文从发现新的物种、功能基因(簇)、物质代谢途径和微生物(M)-环境(E)-效能(P)关联4个方面综述了宏基因组学在环境微生物组研究中的应用与进展，并对未来研究进行了展望。
关键词:
宏基因组学 环境微生物组 物种 基因 代谢过程
Applications and perspectives of metagenomics in environmental microbiome research
1. Environmental Microbiome and Biotechnology Laboratory, School of Engineering, Westlake University, Hangzhou 310030, Zhejiang, China;
2. School of Life Sciences & Westlake Laboratory, Westlake University, Hangzhou 310030, Zhejiang, China
2. School of Life Sciences & Westlake Laboratory, Westlake University, Hangzhou 310030, Zhejiang, China
Abstract: Since Roche launched the first commercial next-generation DNA sequencer in 2005, high-throughput sequencing-based metagenomic approaches have been widely employed to analyze the composition and functions of microbial communities in various environments, revealing numerous novel species, genes, enzymes, and metabolic processes within environmental microbiomes. The relevant work indicates that uncultured microorganisms play crucial roles in driving biogeochemical cycles and promotes theoretical breakthroughs and technological innovation in areas such as pollutant degradation, environmental remediation, biotechnology, and natural pharmaceutical development. This review comprehensively discusses the applications and progress of metagenomics in environmental microbiome, focusing on four aspects of discovery including new species, functional genes (clusters), metabolic pathways, and Microorganism-Environment-Performance (M-E-P) nexus, and prospects the future research.
Keywords:
metagenomics environmental microbiome species genes metabolic processes
微生物的种类繁多且分布广泛，对自然界的物质循环和能量转化至关重要，然而环境中绝大部分微生物尚未被分离培养[1]。基于经典的分离培养方法不能全面解析环境中微生物群落的组成、多样性和功能，环境中海量的未培养微生物资源有待开发与利用。
1 环境微生物与宏基因组学宏基因组学(metagenomics)也称元基因组学或生态基因组学(ecogenomics)，通过直接分析环境样品中的遗传材料来研究微生物群落的结构与功能[2]。宏基因组学方法不依赖对微生物的分离培养，也无须对微生物进行富集或对其DNA进行PCR扩增，避免了来自微生物可培养性、引物设计和扩增偏好性等问题的干扰，能更真实反映微生物群落在实际环境中的时空多样性及组成信息。近20年来，随着DNA测序成本的大幅降低，第2代与第3代高通量测序技术(next-generation sequencing, NGS)相继得以不断发展和大规模应用，环境微生物宏基因组学已发展成环境科学与微生物学交叉学科研究中的一个重要分支，显著转变了环境微生物学与微生物生态学的传统研究方式[3-4]。同时，伴随着现代分子生物学方法的自动化与技术流程的商业化，当前环境微生物群落研究的主要科研时间与经济成本投入已从检测通量低、劳动密集型的分子生物学“湿实验”转变为检测通量高、数据处理密集型的计算生物学“干实验” (例如生物信息学分析与统计学分析等)[4-5]。
宏基因组学是打开通往未培养环境微生物世界大门的钥匙，近10余年来显著推动了包括新物种、新功能基因(簇)以及新物质代谢途径的发现，其方法学的不断完善与广泛应用也极大拓展了我们对各类生境中微生物暗物质多样性的认知，以及对其功能进行深度挖掘与利用的能力。同时，随着微生物生态基因组学研究的深入，新生命进化树与物种分类新规则也相继被提出，完善了微生物的进化谱系并为环境微生物多样性的研究提供了新方法与新参考。此外，大规模时空尺度的环境微生物组的宏基因组学研究也广泛用于解析微生物之间及微生物与环境之间的相互作用关系，进而阐释群落构建机制，显著完善了微生物组的群落生态学理论[6-10]。本文综述了在近10年里，宏基因组学在环境微生物组研究中的应用和所取得的一系列新发现与代表性成果，并展望了这一全球新兴研究领域的发展趋势和未来研究重点。
2 宏基因组学在环境微生物组研究中的应用及进展 2.1 新物种的发现与物种分类新规则环境中的微生物多样性高，但其中大部分微生物尚未被成功分离和培养，仍有待进一步研究。宏基因组学为揭示环境中微生物群落的结构与功能多样性提供了高效的方法，极大地推动了新生命进化树的构建和物种分类新规则的建立(图 1)。在宏基因组学研究中，首要的步骤通常是需要从目标环境样本中提取核酸，并进行DNA测序。然后，借助生物信息学中的一系列先进工具和方法，对得到的数据进行分析，以重构样品中微生物的基因组。这一过程不仅有助于我们识别环境样本中赋存的新物种，更能深入探究微生物群落的结构和功能多样性，从而为揭示环境微生物组中的奥秘提供重要信息[11-12]。例如，Brown等利用宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genome, MAG)和转录组分析，研究了美国科罗拉多河地区蓄水层的微生物群落，在其中发现了一类“不寻常微生物”，这类微生物被命名为“候选门辐射群” (candidate phyla radiation, CPR)[13]；此外，这项对CPR微生物基因组结构的研究也挑战了学者们对原核生物基因序列应该是连续无间断的传统理解。相较于传统观点，即认为原核生物的基因序列连续且不具有内含子结构，只有真核生物的基因组含有不连续DNA序列构成的断裂基因，CPR微生物的基因组却编码了外显子与内含子。该发现更新了学界对原核生物基因组成的理解，也引发了国际同行对包括CPR在内的未培养微生物暗物质的广泛关注和研究[14-17]。除此之外，Singleton团队利用长度长测序、MAG分析和转录组分析等方法对全球污水处理系统的微生物群落进行了研究，重构得到了大量高质量的MAG[18]，并在其中发现了新型脱氮除磷功能菌，如Candidatus Methylophosphatis、Candidatus Dechloromonas phosphoritropha和Candidatus Dechloromonas phosphorivorans[19]。这些发现不仅丰富了学界对聚磷微生物多样性的认识，也为未来的环境微生物组学研究提供了新思路。
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| 图 1 基于宏基因组组装基因组方法发现并研究环境微生物群落中新物种的路线图 Figure 1 Roadmap for discovering and studying novel microorganisms in environmental microbial communities based on a metagenome-assembled genome (MAG) approach. |
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真核生物起源被认为是生物界中仅次于生命起源的第二大未解之谜[20]。宏基因组学推动了环境中新物种的发现，为揭示真核生物的起源提供了线索。Spang等[21]通过对北冰洋中脊受热液作用的深海沉积物进行样品采集与宏基因组学研究，发现了首个Asgard古菌超门中的Lokiarchaeota古菌门，系统发育树分析表明该门类是当时已知的微生物中与真核生物亲缘关系最近的古菌生物，并且它们基因组中也编码了大量传统认为真核生物的特有蛋白。从此，Asgard古菌超门被假定为真核生物的起源，但是，Asgard古菌超门中的哪一分支是真核生物的祖先仍然有很大的不确定性。随着Asgard超门中Odinarchaeota、Heimdallarchaeota、Thorarchaeota和Helarchaeota等古菌门[22-23]被陆续发现，与真核生物亲缘关系最近的物种被修正至Heimdallarchaeota古菌。2021年，Liu等[24]对滨海湿地、近海沉积物和西太平洋深渊等不同环境样品进行宏基因组学研究，通过对162个高质量的Asgard古菌基因组的分析，他们发现了6个新门；其中，新发现的Wukongarchaeota具有氢氧化的自养代谢潜能。此外，该研究还提出真核生物可能起源于Heimdallarchaeota和Wukongarchaeota古菌的共同祖先分支，为真核生物起源提供了新见解和依据[20, 24]。
生命进化树与物种分类规则是微生物多样性和生态学研究的重要基础[25-26]。生命进化树分析可以揭示不同微生物的进化历史和亲缘关系，帮助我们理解微生物适应环境的生态学机制。物种分类规则为更准确地识别微生物的种类提供了方法，促进了微生物在生态系统中角色、功能和相互作用的研究[12, 27-28]。环境微生物宏基因组学研究增加了我们对环境中微生物多样性的认知，进而推动了新的生命进化树和物种分类新规则的建立。Hug等通过MAG分析重构了来自不同生境中的上千种未培养微生物的基因组草图，结合公共数据库中已发表的数据，对基因组中完整核糖体蛋白的序列进行系统发育分析，提出了生命之树可以重新划分为2个域的观点[26]，这个新的系统发育关系也支持了真核生物从古菌内部演化而来的观点[21]。Parks等利用从公共数据库中获取的细菌和古菌的基因组构建了基因组分类数据库(genome taxonomy database, GTDB)，并根据基因组间的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)选择出了不同物种的代表基因组，同时他们将GTDB中包含的所有基因组划分为数量明确的物种簇并进行命名，建立了一个可以为细菌和古菌基因组提供完整的从域到种的分类学新框架[29-31]。目前，GTDB已被广泛用于宏基因组数据分析中的物种分类研究，极大促进了研究人员对未培养物种的鉴定和领域同行之间所取得研究结果的交流[12, 27-28]。由此可见，全球公共数据库中储存的宏基因组数据是环境微生物学研究的宝贵资源，其不但为关于生命进化树新见解的提出和物种分类新规则的建立提供必要的基础数据，还是解析环境中海量未培养微生物的多样性和功能潜力的重要参考依据[25-26]。例如，Eloe-Fadrosh等[32]对JGI-IMG/M数据库中5.2 TB的宏基因组数据进行重分析与深度挖掘，发现了一种新的候选细菌门Candidatus Kryptonia。基因组分析表明该门中的未培养微生物为异养菌，主要分布在高温且pH呈中性的地热泉环境中[32]。这项研究充分展示了如何通过全球公共数据库中可开源获取的宏基因组数据的重分析和深度挖掘，发现微生物的新物种并解码其功能潜力，为后续相关研究提供了指导和研究范式。
2.2 新功能基因(簇)的挖掘针对各种环境样品的大规模测序与宏基因组学研究极大地推动了微生物编码的新功能基因(簇)的发现。例如，CRISPR是“成簇规律间隔短回文重复序列” (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的英文首字母缩写，该序列在细菌和古菌基因组中发挥着至关重要的作用。CRISPR编码了一种获得性免疫系统，该系统能够精准地识别入侵细菌的病毒DNA序列并启动防御机制。一旦识别到外源DNA，CRISPR系统便会迅速启动，产生如Cas9等特殊的酶类，对入侵病毒的DNA进行破坏，从而使病毒失活[33]。2012年，Jinek等在Science期刊上发表核心论文，揭示了CRISPR-Cas9系统的作用机制，并指明了其作为基因编辑工具的巨大应用潜力，推动了CRISPR基因编辑技术在基因功能研究、药物靶点筛选、疾病治疗、和农作物育种等领域的发展和应用[34-36]。随后，Burstein等对来自地下水、底泥、生物膜、土壤以及婴儿肠道等不同环境微生物样品的宏基因组数据进行分析和深度挖掘，从TB级别的宏基因组序列中重构了约1.55亿个蛋白(酶)编码基因和大量MAG；该研究进一步通过对这些重构的MAG展开深入研究，发现了首个来自古菌域的Cas9蛋白编码基因，以及两种新的细菌的CRISPR-Cas系统，分别命名为CRISPR-CasX和CRISPR-CasY[37]。Jennifer Doudna教授及其合作者因其在CRISPR/Cas9系统研究领域的杰出贡献，于2020年荣获“诺贝尔化学奖”。综上所述，宏基因组学研究为寻找更多新型CRISPR-Cas系统提供了有力工具，同时也为该系统在生物技术和疾病治疗等领域的进一步发展提供了更多的新机会和广阔的可能性。
宏基因组学方法不仅极大地推动了新型基因编辑系统的发现，而且在挖掘新型生物活性物质，特别是抗生素的过程中，发挥着举足轻重的作用。生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster, BGC)是生物体内一组编码特定化合物合成途径的基因，其主要作用是合成次级代谢产物(secondary metabolites, SMs)[38]。目前，这些微生物合成次级代谢产物已成为抗生素等药物的重要来源，并在生物医药领域发挥着关键作用。然而，现有大多数抗生素类药物主要来自于已被成功分离培养的微生物，这仅仅涵盖了自然界微生物多样性的冰山一角，很多重要的微生物合成基因簇还有待被发掘和利用。近年来，某些新型传染性疾病和超级耐药细菌的出现，对全球公共卫生安全构成了威胁。传统的抗生素对于这些新型病原体和耐药细菌的处理效果往往不佳，因此，开发新型有效的抗生素和药物变得尤为迫切[39-41]。宏基因组学方法的应用，为学者们提供了从大规模环境样品中发掘更多生物合成基因簇的机会。例如，发现合成新型抗生素、抗菌剂和免疫抑制剂等微生物次级代谢产物的编码基因簇并对其进行利用[42-45]。Hover等对来自不同环境的2 000多份土壤样品进行微生物群落的DNA提取和测序，从中发现了可以合成新型抗生素“马拉西啶(malacidins)”的基因簇[45]；这种新型抗生素具有直接攻击细菌细胞壁关键部位的能力，且微生物不会对其产生耐药性。此外，中国学者也在这一领域取得了显著进展。Zhang等自主构建了首个中国南海微生物天然产物的资源库，并开发出了高通量筛选活性化合物的新方法，这不仅促进了对活性新颖天然产物的高效发掘与利用，还为揭示微生物天然产物的作用机制和微生物天然产物的高效合成和制造方面取得突破奠定了基础[46-49]。例如，聚酮类药物[50]、青蒿素类[51]和阿维菌素[52-53]等多种药物的功能机制研究和生物制造。
环境微生物组赋存的生物合成基因簇测序、生物信息学识别和候选功能基因簇的异源表达等步骤是发掘环境微生物赋存的新型次级代谢产物的重要方法和技术途径。随着高通量测序技术和相关生物信息学分析方法的快速发展，利用宏基因组学技术挖掘土壤与海洋等热点环境中的各类生物合成基因簇，并结合先进的功能基因组学与合成生物学技术(如内源表达或异源表达)进行功能验证和转化应用(图 2)，必将为更多微生物天然产物的开发及其在生物医药等领域的转化应用持续带来更多的新发现与新突破。
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| 图 2 新的生物合成基因簇的挖掘和面向新型天然生物活性化合物转化应用的研究路线 Figure 2 Exploration of novel biosynthetic gene clusters (BGCs) and research pathways for the transformation applications of novel natural bioactive compounds. |
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宏基因组学不仅有助于发现新的功能基因(簇)和酶系统，还推动了学界对未培养微生物的物质与能量代谢途径以及它们在全球生物地球化学循环中作用的全新认知。氨氧化过程作为全球氮循环的核心组成部分，一直备受学术界的广泛关注。本文列举了以氨氧化过程为代表的微生物驱动的氮循环过程，以及氮元素与碳、硫、磷和铁等其他元素之间的代谢耦合过程，涵盖了相应的功能菌和代表性物种(表 1)。2015年，Daims等[54]和van Kessel等[55]在Nature杂志同期发表研究论文，他们通过富集培养、宏基因组测序和生物信息学分析等多种方法，发现并证实了完全氨氧化(Comammox)微生物的存在。这一重大发现打破了“硝化过程需要氨氧化菌与亚硝酸盐氧化菌两种功能微生物类群分两步完成”的传统观念，为理解完全氨氧化微生物在生物地球化学循环中的作用奠定了基础。厌氧氨氧化(Anammox)是由厌氧氨氧化细菌主导的一种高效低能耗的脱氮过程，其在厌氧条件下直接将亚硝态氮和氨氮转化为氮气，无须外加有机碳源，在处理低碳氮比污水中具有广阔的应用前景[73]。厌氧氨氧化细菌来自浮霉菌门(Planctomycetes)，分布在该门下的6个属[56, 74]，包括Candidatus Scalindua[59]、Candidatus Kuenenia[57]、Candidatus Brocadia[56]、Candidatus Anammoxoglobus[60]、Candidatus Jettenia[58]以及近期在德国某污水处理厂发现的Candidatus Loosdrechtia[61]。尽管厌氧氨氧化细菌的分离培养仍是一大挑战，但以标记基因测序分析、宏基因组、宏转录组等为代表的宏组学(meta-omics)方法已成为探究该类微生物代谢特征和功能机制的重要手段，这对于厌氧氨氧化工艺的推广应用和优化升级具有重要价值。宏基因组学也在研究其他氨氧化代谢途径中发挥了重要作用(表 1)。值得一提的是，Wu等从活性污泥中分离出一株可以将氨直接氧化为氮气的微生物，Alcaligenes ammonioxydans strain HO-1；通过分子生物学实验和基因组与转录组测序，该研究发现HO-1菌株编码的功能基因dnfABC介导了直接氨氧化过程[62]。这一发现为开发新型、高效的污水脱氮工艺提供了新思路[63]。在自然生境中，宏基因组学也帮助学者们揭示了氮循环的更多奥秘。Kraft等利用宏基因组学研究和实验验证，发现海洋中的氨氧化古菌Nitrosopumilus maritimus在缺氧条件下能够通过自身产生氧气进行氨氧化，同时将亚硝酸盐还原为一氧化二氮和氮气[75]。这加深了学界对海洋环境中最小含氧带氮循环和微生物多样性的理解。
表 1 环境微生物驱动的氮循环及其与其他元素耦合代谢过程的宏基因组学研究
Table 1 Metagenomic research on microbial mediated nitrogen cycling and coupled metabolic processes with other elements in the environment
| 名称 Name |
代谢途径/过程 Metabolic pathway/Process |
功能菌及代表物种 Functional microorganisms and representative species |
| 氨氧化过程 Ammonia oxidation process | ||
| 完全氨氧化 Complete ammonia oxidation (Comammox) |
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Comammox bacteria, e.g., Candidatus Nitrospira inopinata[54], Candidatus Nitrospira nitrosa, Candidatus Nitrospira nitrificans[55] |
| 厌氧氨氧化 Anaerobic ammonia oxidation (Anammox) |
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Comammox bacteria, e.g., Candidatus Brocadia[56], Candidatus Kuenenia[57], Candidatus Jettenia[58], Candidatus Scalindua[59], Candidatus Anammoxglobus[60], Candidatus Loosdrechtia[61] |
| 直接氨氧化 Direct ammonia oxidation (Dirammox) |
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Dirammox bacteria, e.g., Alcaligenes ammonioxydans[62-63] |
| 氮碳耦合过程 Nitrogen-carbon coupling process | ||
| 亚硝酸盐/硝酸盐型厌氧甲烷氧化 Anaerobic methane oxidation coupled with nitrite/nitrate |
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Denitrifying anaerobic methane oxidation (n-DAMO) bacteria, e.g., Candidatus Methylomirabilis sinica[64], Candidatus Methylomirabilis oxyfera[65], and n-DAMO archaea, e.g., Candidatus Methanoperedens nitroreducens[66] |
| 氮硫耦合过程 Nitrogen-sulfur coupling process | ||
| 硫酸盐型厌氧氨氧化 Anaerobic ammonia oxidation coupled with sulfate |
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Sulfate-coupled anaerobic ammonia-oxidizing (SRAO) bacteria, e.g., Anammoxoglobus sulfate[67] and Bacillus benzoevorans[68] |
| 硫自养反硝化 Sulfur autotrophic denitrification |
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Sulfur autotrophic denitrifying (SDAD) bacteria, e.g., Thiobacillus denitrificans and Sulfurimonas denitrificans[69] |
| 氮磷耦合过程 Nitrogen-phosphorus coupling process | ||
| 反硝化聚磷 Denitrifying phosphate accumulation |
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Denitrifying polyphosphate accumulating organisms (DPAO), e.g., members within the genera Tetrasphaera[70] and Dechloromonas[19] |
| 氮铁耦合过程 Nitrogen-iron coupling process | ||
| 铁自养反硝化 Iron autotrophic denitrification |
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Iron autotrophic denitrifying organisms (NDFO), e.g., members within the genera Paracoccus, Ferrooxidans, Acidovorax, and Pseudomonas[71-72] |
环境微生物在自然界中发挥着关键作用，不仅驱动氮元素的循环，还深刻影响着碳、硫等元素的地球化学循环和它们之间的耦合过程。近期，Yao等成功分离了一株厌氧甲烷氧化细菌Candidatus Methylomirabilis sinica，并证实了该菌独立介导的全程反硝化型厌氧甲烷氧化反应和在自然界中的分布广泛[64]。该发现不仅拓宽了学界对全球碳氮循环的理解，也为水处理领域新工艺的开发提供了科学支撑。除了亚硝酸盐/硝酸盐型厌氧甲烷氧化过程，好氧反硝化过程也属于碳氮循环中的一环，但是目前对该过程的研究仍处于起步阶段，其中的酶学特征和脱氮路径还有待进一步研究和证实[76-79]。在硫循环方面，硫酸盐氧化菌和硫酸盐还原菌是主要的功能菌。根据有无光敏色素，硫酸盐氧化菌可以分为绿色硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌以及无色硫细菌等4类[80]，它们的代表性物种分别为Chlorobaculum tepidum[81]、Allochromatium vinosum[82]、Rhodopseudomonas palustris[83]和Beggiatoa leptomitoformis[84]。硫酸盐还原菌主要分布在Deltaproteobacteria、Nitrospirae、Clostridia、Negativicutes和Thermodesulfobacteria组成的5个细菌纲以及Thermoprotei和Archaeoglobi组成的2个古菌纲中[85]。此外，硫循环与氮循环紧密相关，特别是在缺氧条件下，硫化物氧化与硝酸盐还原过程存在强烈的耦合作用。Walsh等对海洋最小含氧带中的微生物群落进行宏基因组研究，发现海洋中存在自发进行的硫氮耦合过程[86]。Canfield等基于宏基因组学研究发现在智利北部海岸无氧水域中存在着不同寻常的硫酸盐还原和硫化物氧化过程, 这些过程与厌氧氨氧化在内的氮循环过程密切关联[87]。这些研究揭示了海洋环境中硫氮耦合过程的复杂性和重要性，也为学界理解全球海洋硫氮循环提供了新视角。此外，硫氮耦合过程的研究也促进了水处理新工艺的开发。例如，Jiang等基于硫循环驱动的厌氧氨氧化过程开发了异养硫酸盐还原、自养反硝化、硝化反应一体化的高盐污水处理技术，成功实现了对低碳氮比污水的主流处理，展现了微生物驱动的硫氮循环耦合过程在水处理新工艺开发中的应用潜力[88]。
环境微生物通过调控磷的形态驱动了自然生态系统中磷元素及其与氮元素耦合循环的过程。其中，解磷菌能够将不溶态的磷转化为溶解态，使磷能够被生物利用，这类微生物在土壤、沉积物和污水处理系统中普遍存在。Jing等基于单细胞拉曼分选技术分离了污水中的解磷菌，并结合通量测序和宏组学分析等技术解析了解磷菌新类群的解磷机制[89]。聚磷菌也是一类在污水生物除磷过程中发挥重要作用的微生物，它们具有厌氧释磷，好氧超量吸磷的特性[90-91]。目前常见的聚磷菌属包括Candidatus Accumulibacter、Tetrasphaera和Dechloromonas等[70]。Stokholm-Bjerregaard等基于16S rRNA基因扩增子测序技术，研究了污水厂中聚磷菌的多样性，并较为全面地总结了目前假定的聚磷菌的物种分类，为学界认识这类微生物的多样性提供了参考[92]。近年来宏基因组学和实验验证结合的研究发现以Tetrasphaera为代表的聚磷菌不仅具有除磷功能，还具有发酵和反硝化的功能潜力，能够同步驱动污水处理系统中的碳、氮、磷元素循环耦合过程[93-94]。这一发现为污水反硝化除磷除碳新工艺的开发提供了新思路，展示了环境微生物在污水处理领域的巨大潜力。此外，微生物也驱动了铁元素与铁氮耦合的地球化学循环过程，宏组学方法促进了对于驱动铁循环的功能微生物的多样性、代谢通路和胞外电子传递机制的研究[95]。研究表明，介导铁氧化的微生物在Thiobacillus、Leptothrix、Sideroxydans和Gallionella等多个细菌属中均有分布[95-97]。介导铁还原过程的微生物也分布在多个细菌门和古菌目中，其中Geobacter和Shewanella较为常见[98-99]。在铁氮耦合方面，Yang等在自然生境中证实了厌氧铁氨氧化过程的存在[100]。Huang等分离了首株可以还原三价铁的同时将氨氮氧化为亚硝氮的厌氧铁氨氧化菌Acidimicrobiaceae sp. A6，并基于16S rRNA基因扩增子测序和分析阐明了其系统发育地位[101]。尽管目前关于厌氧铁氨氧化过程的驱动机制仍存在争议，但这一过程可实现自养脱氮，无须外加碳源和曝气，具有发展成为一种新型污水脱氮工艺的潜力[102]。
综上所述，环境微生物驱动的生物地球化学循环过程丰富多样，而以宏基因组与宏转录组等为代表的宏组学方法为深入解析各种环境中微生物驱动的新物质代谢途径提供了强有力的工具，从而加速了学界对微生物介导的物质代谢过程的理解。这将有助于推动农业生产、工业制造和环境修复等领域的生物技术创新与可持续发展。
2.4 微生物-环境-效能(microorganism-environment-performance, M-E-P)新关联的发现M-E-P关联是指微生物之间以及微生物与其生存环境之间的相互作用以及其对于效能的影响。该关联涵盖了微生物在特定环境中的相互作用、适应性和对环境的响应，旨在揭示该关联如何共同影响整个系统的功能和稳定性。在环境微生物组工程系统中，通过解码M-E-P关联，工程师能够更加准确和全面了解影响系统效能的重要功能微生物类群及其关键环境影响因素，从而制定出合理的调控策略优化系统的运行效能。在自然生态系统中，M-E-P关联解析可以预测环境变化对微生物多样性和系统效能的影响，从而制定相应的生态系统调控与管理策略，还可以为生态系统中环境指示微生物的识别、环境污染物的预测和通过微生物群落评价生态系统健康提供基础数据与理论支撑。相较于以往单独研究微生物与环境因子之间的关系或者微生物与系统运行效能之间关联，M-E-P关联能够综合考虑微生物、环境和系统效能的相互作用，从而提升了我们对生态系统功能的全面理解，以及对其进行利用和调控的能力。例如，调控土壤微生物群落的组成以提高作物的产量[103]、人工投加微生物菌剂修复受污染水体[104]以及富集培养具有特定功能的微生物用于污水中的资源回收[105]等。
环境微生物群落的多样性高且环境因素复杂多变，M-E-P关联的准确和全面解析需要大量高度相关的时空数据支撑，包括微生物群落、环境参数和系统效能的大数据信息，因此M-E-P关联解析的研究面临着有效数据获取和处理的挑战。环境中微生物群落的大规模时间或空间尺度的样品采集和高通量测序，已经成为解析微生物之间及微生物与环境之间复杂相互作用的重要研究方法。例如，在工程生态系统中，Ju等[7]对我国香港特别行政区沙田污水处理厂活性污泥工艺在5年时间尺度上的M-E-P关联进行系统性解析，发现了活性污泥微生物群落中驱动生物脱氮的“有益”菌群和导致污泥起泡的“有害”菌群分布在共现网络的不同模块，其各自占据的生态位与主控环境因素显著不同，并基于此提出了适当延长污泥停留时间和维持充足污泥混合液浓度的调控策略来抑制“有害”菌群的暴发，进而减轻活性污泥起泡问题的不利影响。Wu等[106]开展了23个国家269座污水处理厂的活性污泥微生物群落调研，揭示了其细菌群落中的核心物种包括28个属，并发现活性污泥微生物群落组成受温度和进水有机物浓度等确定性因素的显著影响，但群落构建很大程度由随机过程所驱动。Zhang等[107]通过时间和空间尺度的样品采集解析了南水北调中线工程总干渠中微生物群落的动态变化规律与构建机制，发现干渠水中整体微生物群落结构受季节变化的影响大于受水流变化的影响。在超长跨流域调水过程中蓝藻和潜在致病细菌的丰度显著降低，微生物在水体自净化过程中发挥重要作用。
针对自然生态系统中M-E-P关联解析有助于揭示微生物组对于生态系统功能的影响。García-García等[108]对美国威斯康星州8个沼泽湖进行为期3年的采样，通过M-E-P关联解析，发现群落的多样性对于其在复杂环境中维持功能稳定性具有重要影响。Bahram等[109]研究了全球645个湿地土壤的微生物群落结构和功能潜力并原位测定N2O的浓度，从而评估了古菌、细菌、真菌在氮循环、N2O释放中发挥的作用，这为全球湿地土壤N2O排放引起气温上升的原因提供了新见解。Gao等[110]在中国太湖蓝藻水华暴发期间进行连续采样，解析了水体中微生物群落结构的时空动态变化规律，并结合实验室内降解实验确定了蓝藻肽类在微生物群落构建中的重要作用，为理解蓝藻水华形成背后的生态学机制以及科学预测、监控和治理蓝藻水华提供了重要见解。Zhao等[111]通过对太平洋西海岸面积最大的淤泥质潮间带湿地(盐城湿地)进行高分辨率的时间序列采样和测序分析，发现潮间带表层水微生物群落结构潮汐周期响应的节律模式，并揭示了人为活动和污染物排放对于潮间带地下水微生物群落的影响，从而为海岸带生态健康的监测和评估提供了重要的数据支撑。
针对工程系统中M-E-P关联解析有助于理解并利用微生物群落服务社会与经济发展。人工构建微生物群落在环境领域应用广泛，尤其在生物降解、生物资源和生物合成等方面发挥着重要作用。近年来，学者们提出人工构建微生物群落应该遵循“设计-建造-测试-学习(design-build-test-learn, DBTL)”循环的研究路线。该路线分为“自上而下”以及“自下而上”两种策略[112-113]。“自上而下”的策略是指利用设计的环境条件，驱动现有微生物群落进行生态选择，从而获得可执行目标功能的微生物群落。常见的方法包括直接富集、人工筛选和定向进化等。在该策略中，M-E-P关联在构建微生物群落的环境条件设计中发挥了重要指导作用。例如，Wang等设计了有助于发酵型聚磷菌选择性富集的复合碳源，并使用基于硫脲的调控策略构建了强化除磷微生物群落，并验证了其用于污水中资源回收的应用潜力[114]。Chrysene (屈)是一种具有极强致癌性的多环芳烃。Vaidya等以屈为唯一碳源构建了可以降解屈的微生物群落，为多环芳烃污染土壤的生物修复提供了微生物资源[115]。“自下而上”的策略则是指利用天然或工程菌株，基于对它们代谢网络和相互作用等过程的认识，设计和构建微生物群落。其中，M-E-P关联的知识对于推断微生物间的相互作用和构建群落代谢网络具有指导价值。例如，Zengler等[116]系统性地描述了如何基于微生物间的共养相互作用构建复杂群落。Mee等[117]根据这一原理构建了14种不同缺陷型大肠杆菌组成的群落，并证明了合成群落通过优化氨基酸合成途径来强化群落中微生物的协同生长。因此，在DBTL循环的研究路线中，M-E-P关联既是指导群落设计的关键信息，也是实现目标微生物群落构建和测试的前提。对于已成功构建的微生物群落进行学习，解析其中的M-E-P关联，并识别驱动群落组装的关键环境因子和选择条件，进而为微生物群落下一阶段的优化设计提供指导(图 3)。例如，Kim等[118]通过解析己酸合成微生物群落的M-E-P关联和多次DBTL循环的优化建立了可以快速稳定产生己酸的微生物群落，己酸合成的效率相较于优化前提升了3.6倍。综上可见，基于宏基因组学解析M-E-P关联在DBTL循环中的设计和学习阶段发挥了重要作用，推动了循环的进行，对于实现微生物群落的定向构建和精准调控，用于改善人民生活水平和实现社会可持续发展意义重大。
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| 图 3 微生物-环境-效能(M-E-P)关联分析方法及其在环境微生物群落研究中的应用 Figure 3 Microorganism-environment-performance (M-E-P) nexus analysis and its application in environmental microbial community research. |
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微生物在地球环境、生物经济和人类系统中发挥不可或缺的作用。宏基因组学是当前环境微生物学和微生物组研究的核心方法学，已被广泛用于不同环境中微生物生态学研究与微生物资源发掘。然而，鉴于环境样品中微生物的种类繁多且遗传代谢方式各异，目前学界对环境微生物功能的认知极其有限。因此，进一步的研究和探索显得尤为必要。本文从实验操作与组学方法的标准化、高质量参考数据库的构建与资源管理、多组学与多学科交叉协同3个方面对宏基因组学在环境微生物组研究中的应用进行展望。
(1) 标准化的实验操作与定量宏组学方法
微生物样品的采集、核酸提取、高通量测序和生物信息学分析等实验操作是开展环境微生物群落的宏基因组学与宏转录组学等宏组学(meta-omics)研究的必要步骤，可能影响研究结果的准确性和全面性。目前环境微生物群落的宏组学研究分析方法主要停留在基于高通量测序数据的相对定量分析层面，但对于不同类型或者受环境扰动前后生物量变化较大的环境样品，其相对丰度无法反映出其绝对量的组间差异或时空变化，这限制了我们对群落水平各种微生物的生长与代谢速率的预测以及对环境因素实际影响的精准评估[119]。因此，针对微生物群落开展绝对细胞数、基因和转录本拷贝数等绝对定量信息的分析以及样品之间的比较尤为重要。目前，基于人工合成核酸内标物的宏组学已被证明是一种可以有效实现微生物群落绝对定量的方法[120-122]，但是不同类型环境样品中微生物核酸提取效率的差异及其对绝对定量结果的影响还有待系统评估。
(2) 功能基因数据库的构建与注释工具开发
环境微生物群落的种类繁多且组成复杂，构建完备的功能基因参考序列数据库对于研究环境微生物的多样性和功能机制至关重要。目前KEGG和NCBI nr等权威参考数据库中包含的大部分基因序列的功能均基于同源性分析预测，尚未被实验验证。因此，结合高通量的功能基因组学实验验证，扩展不同类型功能基因的参考序列数据库具有重要意义。近年来，牛津纳米孔与PacBio长读长三代测序技术的应用显著提升了MAG的整体质量(如完整性与连续性)，促进了对未培养微生物的分类学[123-124]与功能潜力[125-128]的探究，但同时也对数据的处理和分析提出了挑战。相较于二代测序数据的分析流程和工具，长读长测序数据的分析方法仍处于发展阶段，数据分析工具需求迫切，尤其是序列错误率校正、数据组装等方面的新工具[129]。随着人工智能与宏组学时代的到来，新的生物信息学算法和工具不断涌现，这也必将加速环境微生物组研究及相关功能基因与酶资源的发掘。
(3) 多组学方法联用与多学科交叉
随着高通量测序技术和宏组学分析方法的不断进步，目前研究人员已能够容易地通过宏基因组测序分析大规模重构环境中未培养微生物的基因组草图，并据此预测其功能潜力和物种间的相互作用。然而，基因组层面的分析无法揭示微生物的功能表达与实际代谢活性。因此，宏基因组学与宏转录组学[130]、培养组学[131]、宏代谢组学[132]和宏蛋白质组学[133]等其多组学(multi-omics)方法的联用，将为深入剖析微生物群落功能及其环境响应机制提供有效途径。同时，获得功能微生物的纯培养物不仅可验证基于宏组学预测的微生物功能潜力、互作关系[134]与代谢途径[135]，还能应用于污染物降解[131]或高附加值产物合成[136]，具有良好的学术价值与工程应用潜力。此外，宏基因组学研究为环境微生物的分离培养提供了指示性的基因组功能信息[137]，为其功能的发掘和利用提供新基础。除了多组学方法的联用，多学科方法也在推动环境微生物组研究中起了关键作用。例如，通过宏基因组学与稳定同位素核酸探针技术、拉曼分选技术、荧光原位杂交技术等其他方法的交叉融通，研究人员能够更全面地探索微生物群落的互作[138]、空间组装[139]和原位代谢活性[140]等。因此，多组学方法联用与多学科交叉合作将会成为环境微生物组学领域发展的趋势。
致谢: 感谢中国农业科学院深圳农业基因组研究所刘永鑫研究员和西湖大学张璐博士在文章撰写和修改中给予的宝贵建议和指导；感谢西湖大学的赵泽和黄昕瑜在文章构思和文献整理中给予的帮助。
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