2024, Vol. 51
表1(Table 1)
贝莱斯芽孢杆菌PJP10的抑菌物质稳定性及活性代谢产物挖掘
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文章信息
- 娄向弟, 周强, 贺江, 张向向, 王永慧, 熊建华, 郜彦彦
- LOU Xiangdi, ZHOU Qiang, HE Jiang, ZHANG Xiangxiang, WANG Yonghui, XIONG Jianhua, GAO Yanyan
- 贝莱斯芽孢杆菌PJP10的抑菌物质稳定性及活性代谢产物挖掘
- Stability evaluation and genome mining of antimicrobial metabolites of Bacillus velezensis PJP10
- 微生物学通报, 2024, 51(3): 935-949
- Microbiology China, 2024, 51(3): 935-949
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230705
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文章历史
- 收稿日期: 2023-08-31
- 接受日期: 2023-10-31
- 网络首发日期: 2023-12-06
娄向弟, 周强, 贺江, 张向向, 王永慧, 熊建华, 郜彦彦. 贝莱斯芽孢杆菌PJP10的抑菌物质稳定性及活性代谢产物挖掘[J]. 微生物学通报, 2024, 51(3): 935-949.
LOU Xiangdi, ZHOU Qiang, HE Jiang, ZHANG Xiangxiang, WANG Yonghui, XIONG Jianhua, GAO Yanyan. Stability evaluation and genome mining of antimicrobial metabolites of Bacillus velezensis PJP10[J]. Microbiology China, 2024, 51(3): 935-949.
贝莱斯芽孢杆菌PJP10的抑菌物质稳定性及活性代谢产物挖掘
1. 江西农业大学食品科学与工程学院, 江西 南昌 330045;
2. 江苏沿海地区农业科学研究所, 江苏 盐城 224002
2. 江苏沿海地区农业科学研究所, 江苏 盐城 224002
摘要: 【背景】 食源性致病菌在食品中易生长繁殖且致病性强，严重威胁着公共卫生和食品安全。【目的】 通过多个指标分析贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) PJP10的抑菌物质稳定性，利用基因组测序预测编码抑菌活性相关酶和代谢产物合成蛋白的基因并检测酶和代谢产物的离体活性，为该菌工农业开发和应用提供参考数据。【方法】 通过抑菌试验确定pH、温度、蛋白酶、金属离子、紫外线照射和盐浓度等因素对抑菌物质稳定性的影响。利用全基因组测序了解菌株PJP10潜在的产酶基因，并通过酶活试验检测其产酶能力。使用在线软件antiSMASH预测代谢产物合成基因簇，并利用酸沉淀法和乙酸乙酯萃取法获得无菌发酵液粗提物，通过高效液相色谱和抑菌试验初步探究菌株PJP10的胞外活性代谢产物成分。【结果】 菌株PJP10无菌发酵液能够耐受强酸、强碱、高温、高盐和紫外线照射等环境，对蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，但对胰蛋白酶和金属离子敏感。全基因组中存在编码淀粉酶、氨肽酶、蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、酯酶、果胶酶、葡聚糖酶和酰胺酶等抑菌酶的基因，酶活测定结果表明该菌株具有蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶活性。antiSMASH预测发现菌株PJP10基因组中包含杆菌素(bacillaene)、地非西丁(difficidin)、大环内酰亚胺(macrolactin) H、表面活性素(surfactin)、杆菌霉素(bacillomycin) D、泛革素(fengycin)、溶杆菌素(bacilysin)、儿茶酚型铁载体(bacillibactin)，以及解淀粉芽孢杆菌素(amylocyclicin)和植物唑霉素(plantazolicin)等多种活性代谢产物合成基因簇。此外，抑菌试验发现酸沉淀粗提物对沙门氏菌和大肠杆菌抑菌活性显著，对辣椒青枯菌无抑菌活性，乙酸乙酯粗提物对金黄色葡萄球菌和辣椒青枯菌抑菌活性显著，对沙门氏菌和大肠杆菌抑菌活性明显减弱，根据HPLC结果推测，菌株PJP10无菌发酵液中的抑菌物质可能是iturin、fengycin和surfactin这3个家族的成员。【结论】 菌株PJP10抑菌物质稳定性良好，基因组中含有丰富的活性酶基因和活性代谢产物合成基因簇，在工农业生产领域具有较好的应用潜力。
关键词:
贝莱斯芽孢杆菌 抑菌活性 稳定性 全基因组测序 抑菌代谢产物
Stability evaluation and genome mining of antimicrobial metabolites of Bacillus velezensis PJP10
1. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, Jiangxi, China;
2. Jiangsu Coastal Area Institute of Agricultural Science, Yancheng 224002, Jiangsu, China
2. Jiangsu Coastal Area Institute of Agricultural Science, Yancheng 224002, Jiangsu, China
Abstract: [Background] Food-borne pathogens are easy to grow and reproduce in food and have high pathogenicity, posing critical threats to food safety and public health. [Objective] To analyze the antimicrobial stability of Bacillus velezensis PJP10 from multiple perspectives, discover the genes encoding antimicrobial enzymes and involved in the biosynthesis of antimicrobial substances by genome sequencing, and measure the in vitro activities of enzymes and active metabolites, so as to provide data for the application of this strain in industry and agriculture. [Methods] The microbial inhibition tests were carried out to examine the effects of pH, temperature, protease, metal ions, ultraviolet (UV), and salt concentration on the antimicrobial stability of the strain. The potential genes encoding antimicrobial enzymes of PJP10 were investigated by whole genome sequencing and the enzyme-producing abilities assessed by enzyme activity assays. The secondary metabolites of PJP10 were predicted by antiSMASH. HPLC and microbial inhibition tests were employed to analyze the components of the crude extract obtained by the acid precipitation and ethyl acetate extraction. [Results] The cell-free fermentation supernatant exhibited excellent stability at high temperatures, strong acid, strong alkali, high salt and UV, and was sensitive to trypsin and metal ions, but not proteinase K or pepsin. The genome of PJP10 carried abundant genes encoding amylase, aminopeptidase, protease, chitinase, cellulase, esterase, pectinase, glucanase, and amidase, and the strain could produce protease, amylase, cellulase, and esterase. The antiSMASH predicted that strain PJP10 had a variety of gene clusters for the synthesis of secondary metabolites, including bacillaene, difficidin, macrolactin H, surfactin, bacillomycin D, fengycin, bacilysin, bacillibactin, amylocyclicin, and plantazolicin. In addition, the extract obtained by acidification exhibited strong inhibitory activities against Salmonella enteritidis and Escherichia coli but no activity against Ralstonia solanacearum. The ethyl acetate extract showed strong inhibitory effects on Staphylococcus aureus and R. solanacearum and weak inhibitory effects on S. enteritidis and E. coli. According to HPLC results, we hypothesized that the antimicrobial substances in the cell-free supernatant of PJP10 were iturin, fengycin, and surfactin. [Conclusion] The strain PJP10 shows high antimicrobial stability and carries rich genes encoding active enzyme and abundant gene clusters for the synthesis of antimicrobial substances, demonstrating a promising prospect of application in industry and agriculture.
Keywords:
Bacillus velezensis antimicrobial activity stability whole genome sequencing antimicrobial metabolites
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌，为革兰氏阳性菌，在自然界中分布广泛[1]。该菌在食品中易生长繁殖且致病性强，多引起以呕吐和腹泻为主要症状的食物中毒反应[2]。近年来，过量抗生素的使用导致大量耐药菌出现，尤其是多重耐药菌的出现，使得抗生素应用面临着严峻的挑战[3]，不仅给畜牧业造成严重的经济损失，也严重威胁着食品安全和公众健康[4]。因此，寻找能够有效抑制食品中金黄色葡萄球菌生长的抑菌物，对于提高食品货架期并保证食品质量安全具有非常重要的意义。
芽孢杆菌广泛存在于自然界中，因其易培养、易储存、便于生物技术操作及具有广谱抑菌活性等优点吸引了大量研究学者的关注，是典型的植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，在农业生产上被广泛应用[5]。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)[6]作为其中的一员，一经发现就展现出了良好的应用潜力，该菌能够产生抗生素、酶、植物激素、铁螯合剂、抗氧化剂、生长促进剂和抗肿瘤药物等丰富的活性代谢产物[7-8]。贝莱斯芽孢杆菌能够抑制多种土传植物病原菌，促进植物生长并且诱导植物系统抗性，作为生防菌剂开发潜力巨大[9-10]。也有少量研究显示贝莱斯芽孢杆菌对食源性致病菌具有很好的抑制作用，Zhang等[11]从长白山寒冷区域分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) CB6对食源性病原菌表现出广谱抑制作用，能够产生一种抗菌蛋白ATP-1，其是一种潜在的新型抗细菌药物，并且该蛋白在促进活性代谢产物合成过程中起重要作用。Nam等[12]从土壤样品中分离获得的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) NST6对致病菌金黄色葡萄球菌具有强烈的拮抗活性，并鉴定到C15-bacillomycin D是该菌拮抗金黄色葡萄球菌的主要化合物。朱亚珠等[13]从自然发酵海洋鱼酱油中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) SW5对金黄色葡萄球菌等多种食品中的常见病原菌有抑制能力，飞行时间质谱(time of flight mass spectrometry, TOF-MS)分析表明，该菌发酵上清液中含有的抑菌物质为表面活性素、山茱萸苷A、氨基糖苷类抗生素庆大霉素和异帕米星，以及链霉菌素类抗生素达福普丁。
本实验室前期从农家酱中分离鉴定出一株贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) PJP10，在抑菌谱测定试验中，该菌对金黄色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 25923、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis) ATCC BAA708和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 17802等食源性致病菌表现出了显著的拮抗效果[14]。本研究在此基础上继续以食品源贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) PJP10为研究对象，分析其对食源性致病菌金黄色葡萄球菌(S. aureus)的抑菌活性稳定性，并对其进行全基因组测序与分析，预测产酶基因并对产酶活性进行验证。采用antiSMASH在线软件挖掘其潜在的活性代谢产物合成基因簇，通过酸沉淀法和乙酸乙酯提取法结合高效液相色谱和抑菌试验研究菌株PJP10产生的胞外活性代谢产物，为该菌工农业开发和应用提供参考数据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) PJP10为本实验室分离菌株[14]。
大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 35218、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis) ATCC BAA708、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923和辣椒青枯菌(Ralstonia solanacearum) QK2013为本实验室保存菌株。
1.1.2 培养基LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0。固体培养基另加20.0琼脂粉。
蛋白酶测定培养基(g/L)：脱脂奶粉5.0，琼脂粉20.0，pH 7.0。
淀粉酶测定培养基(g/L)：酵母膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂粉20.0，pH 7.0，加入20.0可溶性淀粉。
果胶酶测定培养基(g/L)：蛋白胨2.0，果胶5.0，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.3，琼脂粉20.0，pH 7.2。
纤维素酶测定培养基(g/L)：蛋白胨1.00，羧甲基纤维素钠1.00，酵母膏0.50，NaCl 1.00，MgSO4·7H2O 0.02，KH2PO4 0.10，琼脂粉20.00，pH自然。
几丁质酶测定培养基(g/L)：胶体几丁质15.00，酵母粉3.00，(NH4)2SO4 1.00，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.30，琼脂粉20.00，pH 7.0。
葡聚糖酶测定培养基[15](g/L)：葡聚糖20.0，NaNO3 3.0，K2HPO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4 0.1，琼脂粉20.0，pH 7.0。
酯酶测定培养基[16](g/L)：NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 1.0，琼脂粉20.0，pH 7.0，使用前添加终浓度为0.5 mmol/L的邻苯二甲酸丁苄酯。
1.1.3 主要试剂和仪器蛋白胨、酵母膏、果胶和羧甲基纤维素钠，生工生物工程(上海)股份有限公司；邻苯二甲酸丁苄酯和葡聚糖，阿拉丁试剂(上海)有限公司；甲醇和乙酸乙酯，天津市永大化学试剂有限公司。
电子天平，上海菁海仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；高效液相色谱仪，Waters科技有限公司。
1.2 方法 1.2.1 菌种抑菌活性的测定菌种活化、培养与无菌发酵液的制备：取出−80 ℃冻存的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) PJP10，快速划线至LB固体培养基，37 ℃培养箱活化过夜。取活化好的单菌落接种至50 mL LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养36 h，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤作为无菌发酵液，4 ℃保存待用。
打孔法测定抑菌活性：以金黄色葡萄球菌为指示菌，37 ℃、180 r/min培养过夜，作为指示菌种子液，将指示菌种子液稀释到1×108 CFU/mL，取50 μL均匀涂布LB固体培养基，晾干后打孔(孔径为9.00 mm)，在各孔内分别加入100 μL经不同条件处理的菌株PJP10的无菌发酵液，以100 μL未经处理的菌株PJP10的无菌发酵液为阴性对照，每个处理3次重复，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈的大小，计算不同条件处理后菌株PJP10无菌发酵液的相对抑菌率。
相对抑菌率(%)=处理组抑菌圈直径/对照组抑菌圈直径×100。
1.2.2 抑菌物质稳定性测定酸碱稳定性[17]：取10 mL菌株PJP10的无菌发酵液，用1 mol/L HCl和NaOH将无菌发酵液的pH值分别调至3.0、5.0、9.0和11.0，处理1 h后将pH值回调至7.0，以未经处理的无菌发酵液为对照，测定不同pH值处理后无菌发酵液的抑菌活性。
热稳定性[18]：将10 mL菌株PJP10的无菌发酵液分别置于30、50、65、85和100 ℃水浴中处理30 min，反应结束后置于冰水中冷却5 min，以未经热处理的无菌发酵液为对照，测定经不同温度处理后无菌发酵液的抑菌活性。
蛋白酶稳定性[19]：取1 mL菌株PJP10的无菌发酵液分别加入胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和蛋白酶K溶液，酶的终浓度为2 μg/mL，置于37 ℃水浴中处理6 h，然后在80 ℃水浴中处理30 min，冰浴待用，以未加蛋白酶的无菌发酵液为对照，测定经不同蛋白酶处理后无菌发酵液的抑菌活性。
金属离子稳定性：取1 mL菌株PJP10的无菌发酵液分别加入Cu2+ (CuSO4)、K+ (KCl)、Mn2+ (MnCl2)金属离子溶剂，终浓度为5 μmol/L，处理2 h，以未加金属离子的无菌发酵液为对照，测定不同金属离子处理后无菌发酵液抑菌活性的变化。
紫外线稳定性：分别吸取10 mL菌株PJP10的无菌发酵液置于9 cm的玻璃平皿内，距离30 W紫外灯30 cm处，分别照射30、60、120和240 s，以未经紫外线照射的无菌发酵液为对照，测定经紫外线照射不同时间处理后无菌发酵液的抑菌活性。
盐浓度稳定性：分别取5 mL菌株PJP10的无菌发酵液，加入终浓度为2%、4%、6%、8%和10%的NaCl，再用LB液体培养基补足10 mL，同时制备相同盐浓度的LB液体培养基作阴性对照，处理3.5 h，以未经处理的无菌发酵液作阳性对照，测定盐浓度对无菌发酵液抑菌活性的影响。
1.2.3 菌株PJP10全基因组测序从LB固体培养基上挑取菌株PJP10单菌落转接至100 mL LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min培养过夜。4 ℃、10 000 r/min离心10 min后弃上清，菌体送至武汉希望组生物技术有限公司进行3代NanoPore高通量测序。
采用Prodial v2.6.3软件预测编码基因，采用tRNAscan-SE v2.0软件预测tRNA基因，采用RNAmmer v1.2软件预测rRNA基因，采用Infernal v1.1.3软件搜索Rfam (http://rfam.xfam.org/)数据库对其他ncRNA进行预测，分别用Minced v0.3.0软件和Islander v1.2软件预测规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和基因岛，采用Circos v0.69软件绘制基因组圈图。
1.2.4 产酶基因预测与验证提取基因组编码蛋白，用InterProScan v5.25-64.0软件进行注释，提取TIGRFAMs 15.0 (http://tigrfams.jcvi.org/cgi-bin/index.cgi)、Pfam 31.0 (https://pfam.xfam.org/)和GO (gene ontolog, http://geneontology.org/)数据库的注释信息；利用KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes, https://www.kegg.jp/kegg/)、RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)和COG (clusters of orthologous groups of proteins, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)数据库对编码蛋白进行功能注释，预测菌株PJP10基因组上是否包含淀粉酶、氨肽酶、蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、酯酶、果胶酶、葡聚糖酶和酰胺酶的合成基因。
挑取活化好的PJP10菌落分别点接到蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶和酯酶测定培养基上，37 ℃培养48 h，重复3次，观察相应测定培养基上菌落周围是否有透明圈产生；在长出菌斑的淀粉酶测定培养基中加入碘液，观察菌落周围是否有透明圈；在长出菌斑的纤维素酶和几丁质酶测定培养基中倒入0.5%的刚果红染料，染色50 min后倒出染料，加入5%的NaCl溶液，浸泡1 h后倒出，观察菌落周围有无透明圈。
1.2.5 活性代谢产物预测及HPLC初探利用antiSMASH v6.1.1 (https://antismash.secondarymetabolites.org)进行代谢基因簇分析，挖掘菌株PJP10的活性代谢产物合成基因簇。
酸沉淀法提取抑菌物质：参考刘安等[20]的提取方法并略作改动。取200 mL无菌发酵液用6 mol/L盐酸调节pH值至2.0，静置过夜，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min后除去上清液，将沉淀用甲醇溶解，收集备用。
乙酸乙酯萃取法提取抑菌物质：参考兰宝锋等[21]的提取方法并略作改动。以少量多次的原则，用乙酸乙酯将200 mL无菌发酵液多次萃取，将萃取的有机相收集起来，于40 ℃的旋转蒸发仪中除去乙酸乙酯，剩余沉淀用甲醇溶解，收集备用。
抑菌试验分析：采用打孔法检测2种不同提取方法获得的抑菌物质对4种不同的指示菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和辣椒青枯菌)的抑制效果，在各孔内分别加入100 μL甲醇溶解物，以100 μL甲醇溶液为阴性对照，每个处理3次重复，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径。
高效液相色谱法初步测定：将2种方法收集到的甲醇溶解物分别用0.22 μm滤膜去除杂质，通过高效液相色谱仪检测活性物质，高效液相色谱仪的参数为：色谱柱Alltima C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，流动相A：1%乙酸，流动相B：乙腈，检测波长230 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。
1.2.6 数据分析试验数据使用SPSS 25.0软件进行统计分析，试验结果采用平均值±标准差表示，每组设置3组平行，试验重复3次。使用SigmaPlot 14.0和Origin 2022软件作图分析。
2 结果与分析 2.1 菌株PJP10无菌发酵液抑菌物质的稳定性 2.1.1 酸碱稳定性如图 1A所示，pH 9.0时相对抑菌率最大为101.23%。pH 5.0时，相对抑菌率为92.59%，抑菌活性略有下降。强酸和强碱处理下抑菌活性均呈下降趋势，pH 3.0和pH 11.0时，相对抑菌率均为81.48%，但仍然保持在80%以上，说明发酵液中的抑菌物质对强酸和强碱具有较好的耐受性。
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| 图 1 不同条件下贝莱斯芽孢杆菌PJP10无菌发酵液的抑菌稳定性 Figure 1 Antimicrobial stability of Bacillus velezensis PJP10 cell-free fermentation supernatant under different conditions. A: pH. B: Temperature. C: Protease. D: UV light. E: Metal ion. F: NaCl. Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05 level. A：pH. B：温度. C：蛋白酶. D：紫外线. E：金属离子. F：盐浓度. 不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著 |
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30、50、65和85 ℃热处理对菌株PJP10无菌发酵液的抑菌活性无显著影响。当温度升高至100 ℃时，抑菌活性明显下降至72% (图 1B)，说明菌株PJP10无菌发酵液中的抑菌物质在30−85 ℃具有良好的热稳定性，能够耐受100 ℃高温，100 ℃高温处理后相对抑菌活性保留在70%以上。
2.1.3 蛋白酶稳定性菌株PJP10无菌发酵液经蛋白酶K处理后的抑菌活性未受到影响，经胃蛋白酶处理后抑菌活性略有下降，相对抑菌率为96.70%，经胰蛋白酶处理后抑菌活性下降明显，相对抑菌率降至73.63% (图 1C)，说明无菌发酵液中的抑菌物质对胰蛋白酶敏感，对蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，推测菌株PJP10的抑菌物质活性部位存在胰蛋白酶敏感区，可能包含蛋白类拮抗物质。
2.1.4 紫外线稳定性如图 1D所示，菌株PJP10无菌发酵液经紫外线照射处理后，其抑菌活性受到影响，经过30 W紫外线照射30 s，其相对抑菌率下降至92.75%，但是延长照射时间对其抑菌活性并无显著影响，照射60、120和240 s之后的抑菌活性几乎未发生变化，相对抑菌率分别为91.30%、92.75%和91.30%，相对抑菌率均保持在90%以上，由此可见菌株PJP10无菌发酵液具有良好的紫外线稳定性。
2.1.5 金属离子稳定性图 1E显示金属离子Cu2+、K+和Mn2+对于菌株PJP10无菌发酵液的抑菌活性均有抑制作用，相对抑菌率分别为89.77%、82.95%和69.32%，其中Mn2+对抑菌活性的抑制作用最强。
2.1.6 盐浓度稳定性图 1F显示了提高盐浓度对菌株PJP10无菌发酵液的抑菌活性具有显著影响，盐浓度提高至2%和4%时，相对抑菌率分别为93.67%和86.08%。但是继续提高盐浓度至6%、8%和10%，相对抑菌活性无显著变化，分别为78.48%、77.22%和74.68%，这表明了大部分菌株PJP10抑菌活性物质不受盐浓度影响，具有较好的盐浓度稳定性。
2.2 菌株PJP10全基因组分析为进一步明确菌株PJP10的抑菌机制，本研究对其全基因组进行测序，序列已上传至NCBI (GenBank登录号为CP117059)。测序结果显示菌株PJP10含有一条4 108 273 bp大小的染色体，不含质粒，其中G+C含量为46.21%。染色体包含4 026个编码序列(coding sequence, CDS)，总长度占基因组长度的88.63%。含有87个tRNA，27个rRNA(其中9个5S rRNA、9个16S rRNA和9个23S rRNA)。发现2个CRISPRs，全长3 058 bp (图 2)。
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| 图 2 菌株PJP10基因组圈图 Figure 2 Circular genome map of strain PJP10. From outer to inner: Forward strand gene, reverse strand gene, tRNA (orange) and rRNA (purple), CRISPR (blue) and gene island (green), G+C content, G+C-skew, sequencing depth, respectively. 由外到内依次为编码基因(正义链)、编码基因(负义链)、tRNA (橙色)和rRNA (紫色)、CRISPR (蓝色)和基因岛(绿色)、G+C比、G+C-skew和测序深度 |
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贝莱斯芽孢杆菌可产生多种具有拮抗活性的蛋白类抑菌物质，如蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶等，可以降解病原真菌的细胞壁，从而发挥拮抗病原真菌的作用[22]。王青华等[23]从深海海水中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) DH82，其发酵上清液通过硫酸铵沉淀获得粗蛋白提取物，对金黄色葡萄球菌等多种病原菌具有明显的抑制作用。菌株PJP10基因组中包含淀粉酶、氨肽酶、蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、酯酶、果胶酶、葡聚糖酶和酰胺酶等合成基因(表 1)，表明其含有丰富多样的拮抗酶合成基因，具有分泌拮抗蛋白类抑菌物质的潜力。通过点接法检测菌株PJP10的产酶活性，结果显示菌株PJP10能够在蛋白酶(图 3A)、淀粉酶(图 3B)、纤维素酶(图 3C)和邻苯二甲酸丁苄酯酶(图 3D)测定培养基上生长并产生透明圈，在几丁质酶、果胶酶和葡聚糖酶的测定培养基上能生长但不产生透明圈，表明菌株PJP10能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶，但未检测到果胶酶、葡聚糖酶和几丁质酶活性。方园等[24]从根际土壤中分离得到贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) SF327，基因组GO分析显示该菌基因组中含有几丁质酶和纤维素酶编码基因，但却不具有几丁质酶和纤维素酶活性。尽管基因组预测和酶活性验证结果存在差异，但菌株PJP10能够产生丰富的酶类活性物质，这为其具有广谱的拮抗活性奠定了基础。
表 1 菌株PJP10基因组中几种酶类基因
Table 1 Several enzymes gene of the strain PJP10
| Gene ID | Gene name | Gene size (bp) | Enzyme | Enzyme activity |
| BAM2021_00322 | AmyA | 1 980 | Alpha-amylase | + |
| BAM2021_00511 | MenH | 804 | Aminopeptidase | / |
| BAM2021_03877 | FlgD | 2 412 | Serine protease | + |
| BAM2021_03327 | csn | 837 | Chitosanase | − |
| BAM2021_01880 | BglC | 1 500 | Endoglucanase | + |
| BAM2021_03442 | yvaK | 741 | Carboxylesterase | + |
| BAM2021_03977 | PelB | 1 065 | Pectate lyase | − |
| BAM2021_03960 | BglS | 732 | Glucanase | − |
| BAM2021_00187 | cwlD | 714 | Amidase | / |
| +：阳性；−：阴性；/：未检测 +: Positive; −: Negative; /: No detection. | ||||
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| 图 3 菌株PJP10酶活性结果平板图 Figure 3 Enzyme activity results of strain PJP10. A: Protease. B: Amylase. C: Cellulase. D: Esterase. A：蛋白酶. B：淀粉酶. C：纤维素酶. D：酯酶 |
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通过antiSMASH在线预测和NCBI BLAST比对分析，发现菌株PJP10全基因组上包含大部分生防模式菌B. velezensis FZB42[7-8]活性代谢产物合成的同源基因簇，它们是8种非依赖核糖体合成的抑菌化合物，其中包括3种聚酮类化合物，分别为杆菌素(bacillaene)、地非西丁(difficidin)和大环内酰亚胺H (macrolactin H)，3种脂肽类化合物，分别为表面活性素(surfactin)、杆菌霉素(bacillomycin) D和泛革素(fengycin)，1种二肽溶杆菌素(bacilysin)和1种儿茶酚型铁载体(bacillibactin)；还有2种依赖核糖体合成的抑菌化合物，分别为环肽解淀粉芽孢杆菌素(amylocyclicin)和植物唑霉素(plantazolicin)。此外，还包含与Bacillus subtilis和Paenibacillus sp.全基因组中抑菌化合物plipastatin、mycosubtilin、iturin、bacillibactin、paenilarvins、paenibacterin和paenibactin等同源的合成基因簇。以上抑菌化合物除surfactin和plantazolicin的合成基因簇与Bacillus velezensis FZB42的相似性为78%和91%，iturin的合成基因簇与Bacillus subtilis的相似性为88%，paenibacterin合成基因簇与Paenibacillus sp. OSY-SE的相似性为60%外，其余抑菌化合物的合成基因簇与比对基因组的相似性均为100% (表 2)。活性代谢产物预测的结果显示，菌株PJP10基因组中包含大量的抑菌化合物合成基因簇，对细菌和真菌具有广谱的抑制活性，与前期该菌株抑菌谱研究的结果相一致，充分说明菌株PJP10可能通过这些抑菌化合物发挥其拮抗功能。
表 2 贝莱斯芽孢杆菌PJP10基因组中预测的基因簇及其合成的抑菌物质
Table 2 Gene clusters predicted in the genome of strain PJP10 and the biosynthetic antimicrobial substance
| MIBiG accession number | Gene cluster | Strain | Similarity (%) | Substance | Structure |
| BGC0000433 |  |
Bacillus velezensis FZB42 | 78 | Surfactin |  |
| BGC0000569 |  |
91 | Plantazolicin | ‒ | |
| BGC0000181 |  |
100 | Macrolactin H |  |
|
| BGC0001089 |  |
100 | Bacillaene |  |
|
| BGC0001095 |  |
100 | Fengycin |  |
|
| BGC0001090 |  |
100 | Bacillomycin D |  |
|
| BGC0000176 |  |
100 | Difficidin |  |
|
| BGC0000616 |  |
100 | Amylocyclicin | ‒ | |
| BGC0001185 |  |
100 | Bacillibactin |  |
|
| BGC0001184 |  |
100 | Bacilysin |  |
|
| BGC0000407 |  |
Bacillus subtilis subsp. subtilis | 100 | Plipastatin |  |
| BGC0001103 |  |
Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633 | 100 | Mycosubtilin |  |
| BGC0001098 |  |
Bacillus subtilis | 88 | Iturin |  |
| BGC0000309 |  |
Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 | 100 | Bacillibactin |  |
| BGC0000402 |  |
Paenibacillus larvae subsp. larvae DSM 25430 | 100 | Paenilarvins | ‒ |
| BGC0000400 |  |
Paenibacillus sp. OSY-SE | 60 | Paenibacterin |  |
| BGC0000401 |  |
Paenibacillus elgii B69 | 100 | Paenibactin | ‒ |
| ‒：无结构信息 ‒: No structure information available. | |||||
芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质应用于农业和食品领域，其中脂肽类物质具有抑制病原细菌和真菌等多种活性，是主要的抑菌物质[25-26]。本研究表明，酸沉淀粗提物对大肠杆菌(E. coli) ATCC 35218、沙门氏菌(S. enteritidis) ATCC BAA708和金黄色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 25923具有较好的拮抗效果，其中对大肠杆菌(E. coli) ATCC 35218和沙门氏菌(S. enteritidis) ATCC BAA708的抑菌效果最显著，而对辣椒青枯菌(R. solanacearum) QK2013无抑菌效果。乙酸乙酯粗提物对4种指示菌均有抑菌效果，其中对金黄色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 25923的抑菌效果最为显著，这与邓丽等[27]研究结果中乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌(S. aureus) PJ-1具有良好的抑菌活性相一致。对辣椒青枯菌(R. solanacearum) QK2013的抑菌效果稍弱于发酵原液，而对大肠杆菌(E. coli) ATCC 35218和沙门氏菌(S. enteritidis) ATCC BAA708的抑菌效果明显减弱(表 3)。由此也说明菌株PJP10能够产生多种抑菌物质，对于4种指示菌产生拮抗的物质并不相同，除了对食源性致病菌有较强的抑菌效果外，还对辣椒青枯菌(R. solanacearum) QK2013展现了很好的抑菌活性，说明菌株PJP10在农业生防菌剂的开发方面也具有很大的潜力。
表 3 两种粗提物抑菌效果对比表
Table 3 Comparison of the antibacterial effect of crude extracts by two different methods
| Indicator strains | Acid precipitation | Ethyl acetate extraction |
| Staphylococcus aureus ATCC 25923 | ++ | +++ |
| Salmonella enteritidis ATCC BAA708 | +++ | + |
| Ralstonia solanacearum QK2013 | − | ++ |
| Escherichia coli ATCC 35218 | +++ | + |
| +++：抑菌圈直径 > 2.5 cm；++：抑菌圈直径1.5−2.5 cm；+：抑菌圈直径0.8−1.5 cm；−：不抑菌 +++: Inhibition zone diameter > 2.5 cm; ++: Inhibition zone diameter 1.5−2.5 cm; +: Inhibition zone diameter 0.8−1.5 cm; −: No inhibition. | ||
高效液相色谱法检测活性物质成分，发现2种提取方法所获得的粗提液的成分和含量存在差异。Yang等[28]以标准品为参照，采用RP-HPLC分析酸沉淀粗提物中成分发现，乙腈作为流动相，样品保留时间可分为3部分，即6−10、10−16和16−25 min，对应的化合物分别为iturin、fengycin和surfactin家族的成员，并得到MALDI-TOF-MS/MS证实。参照Yang等[28]的酸沉淀粗提物液相色谱条件，菌株PJP10的酸沉淀粗提取物和乙酸乙酯萃取粗提取物对应的色谱图大致可分成3部分，即保留时间5−13、13−23和23 min以后(图 4)，推测粗提物的主要成分可能为iturin、fengycin和surfactin等家族的化合物，这一推测结果与Lin等[29]报道的商业化标准品iturin、fengycin和surfactin混合物的色谱图划分相一致。不同提取方法获得的抑菌物质结构及含量不同，因而表现出的抑菌活性也不同，各组分的分子结构还有待进一步分析验证。
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| 图 4 两种不同提取方法获得粗提物的高效液相色谱图 Figure 4 HPLC results of the crude extracts by two different methods. A: Acid precipitation. B: Ethyl acetate extraction. A：酸沉淀. B：乙酸乙酯提取物 |
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本研究对菌株PJP10抑菌活性物质稳定性分析显示，菌株PJP10无菌发酵液对酸碱、高温和紫外线的耐受性较好，并且对蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，具有较好的抑菌稳定性。此外，本研究还对盐浓度稳定性进行分析，菌株PJP10产生的抑菌活性物质在10%的高盐环境中仍然具有较高的抑菌活性，显示了较好的在高盐食品防腐中的应用价值。李永丽等[30]从新疆野苹果枝干中分离得到的内生菌贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) Pm9对葡萄座腔菌的抑菌活性稳定，其无菌发酵滤液耐受酸碱范围广，对紫外线和蛋白酶K不敏感，且80 ℃以内具有较强的热稳定性。结合本研究结果，表明了贝莱斯芽孢杆菌胞外产生的大多数抑菌活性物质具有较好的稳定性，在食品和农业领域应用价值和开发潜力巨大。
在对菌株PJP10的全基因组分析中发现，菌株PJP10基因组中不包含质粒和基因岛，但是含有2个CRISPR序列。酶活测定试验验证了菌株PJP10能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶等预测到的多种活性酶，胞外蛋白类拮抗物质丰富。antiSMASH在线比对分析显示，与B. velezensis FZB42的活性代谢产物合成基因簇相比，菌株PJP10比对到了大部分活性代谢产物的合成基因簇，预测到的代谢产物具有多种生物活性，在绿色防控、医药开发、食品安全和工业生产等领域均发挥着重要的作用[31]。贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) LM2303基因组挖掘揭示了其基因组中包含13个生物合成基因簇用来编码代谢产物的合成酶，对致病性真菌镰刀菌具有生物防控潜力[32]。本研究对菌株PJP10的基因组进行挖掘分析，antiSMASH在线比对到13个生物合成基因簇用来合成菌株PJP10的代谢产物，该比对结果与Chen等[32]的比对结果一致，HPLC分析菌株PJP10粗提物显示，其主要成分可能为iturin、fengycin和surfactin这3个家族的成员。其中surfactin被证实是一种强大有效的表面活性剂分子，对多种病原细菌具有拮抗活性，fengycin对丝状真菌具有广谱的拮抗活性[33]，iturin则对多种植物病原细菌和真菌均表现出拮抗活性[34]。贝莱斯芽孢杆菌在生物防控方面的研究和应用逐年增加，从盆栽试验到田间防控都有大量的研究实施案例，但是在食品加工和保鲜领域的研究相对较少，菌株PJP10对多种食源性致病菌表现出显著的拮抗活性，并且抑菌稳定性较好，本研究可为其在食品加工和保鲜领域的开发和应用提供重要的研究基础，预测到的具有生防活性的代谢产物也展现了该菌在农业生产领域上的巨大应用潜力。
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