盐碱地是一种土壤退化的障碍性土地，我国盐碱地面积达到9.9×10⁷ hm²，约占国土总面积的10%^[1]。盐碱土壤表层积聚过多的盐碱成分致使土壤溶液浓度升高，土壤有机质和养分含量降低，土壤结构和物理性能改变，同时也会直接毒害农作物根，抑制农作物对土壤养分和水分的吸收，影响植物光合作用，最终威胁农作物产量，严重损害农户经济效益^[2]。但是，对于盐碱地的改良和利用坚决不能“放弃”。我国盐碱地中约有1/3具有开发利用潜力，如果能唤醒这一“沉睡”的后备耕地资源，将会缓解我国耕地总量相对较少的问题，科学有效发展抗盐碱农业也会在用好耕地存量的同时提高土地增量，进而实现我国土地资源的扩容、提质和增效。

近年来，人们对盐碱地的开发利用采取了多种措施，除抗盐碱作物育种外，利用生物修复方法改善土壤质地、提高作物耐盐碱能力也一直是研究的重点^[3]。土壤中聚集着大量的微生物资源，特别是部分功能微生物是植物赖以生存的“伙伴”^[4-5]。例如，土壤中存在着大量的固氮菌、产吲哚乙酸(Indole acetic acid, IAA)细菌、拮抗细菌和溶磷细菌^[6-9]，它们参与植物的生长过程，促进植物生长，驱动陆地生态系统的物质循环。研究表明，施用耐盐碱促生菌对改善盐碱胁迫下作物生长和提高作物盐碱耐受能力均有较好效果^{[6, 10]}。

耐盐碱促生菌种类较为丰富，且在微生物资源开发和菌肥利用中具有重要地位，目前已成为微生态研究的热点。已有研究报道耐盐碱促生菌有芽孢杆菌属(Bacillus)^[11]、固氮螺菌属(Azospirillum)、假单胞菌属(Pseudomonas)^[12]、涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)^[13]、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)^[14]、考克氏菌属(Kocuria)^[15]和盐单胞菌属(Halomonas)^[16]等。上述耐盐碱促生菌耐盐碱机制较为复杂，可以通过参与植物养分吸收、调节植物激素浓度、激活植物抗氧化防御机制、积累渗透调节物质、分泌胞外多糖、分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC)脱氨酶、释放挥发性有机化合物或是分子调控等机制促进植物生长^[17-19]。

本研究采用可培养方法拟从宁夏回族自治区银川市盐碱地土壤中分离出耐盐碱促生菌株，旨在挖掘盐碱土壤中的促生微生物资源，并探究其在盐碱环境中的促生机制。本研究的研究结果有望为盐碱地综合利用提供微生物种质资源和理论支持，对于提高盐碱地土壤利用率，促进盐碱地区农业可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 盐碱土壤样品及植物品种

供试土壤采集于中国宁夏回族自治区银川市盐碱地，将采集的土壤过5 mm筛，混合均匀后放入封口袋，置于冰盒内带回实验室，保存在4 ℃冰箱待用。拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0种子和大豆(东生9，Dongsheng 9)种子为实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒，Promega公司；rTaq聚合酶，TaKaRa公司；Salkowski试剂的配制参照Tsavkelova等^[20]；其他常规化学试剂均为分析纯。TBS-380荧光仪，Turner BioSystems公司；Biolog Gen Ⅲ微孔板，BIOLOG公司。

1.3 培养基

LB培养基参照文献[16]配制。

含色氨酸LB液体培养基(g/L)：LB培养基中含色氨酸100.0。

MS培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司(产品编号为HB8469)，按照商品说明书进行配制。

1.4 菌株的分离纯化

取5 g供试土壤加入装有45 mL无菌水的锥形瓶中，同时加入灭菌玻璃珠，28 ℃、180 r/min摇床振荡30 min后进行逐级梯度稀释至10^–6，选取100 μL各浓度梯度菌悬液涂布于9% NaCl的LB固体培养基中分离耐盐细菌。将平板倒置放入28 ℃恒温培养箱中培养48−72 h，选取菌落形态、颜色、黏稠度和大小不同的菌株，挑取单一菌落划线培养，分别继代培养4−5代获得单菌落。−80 ℃甘油保存。

1.5 菌株耐盐能力检测

按1%接种量将培养24 h的种子菌液接种在含有0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%和9% NaCl的LB培养基中，28 ℃、180 r/min摇床振荡培养48 h，测定光吸收值(OD₆₀₀)，以不接种菌液的不同NaCl浓度培养基为对照组，绘制生长曲线并判断菌株NaCl生长范围，确定菌株最适生长NaCl浓度，选出对NaCl浓度耐受能力最高的菌株进行后续试验。

1.6 菌株耐碱性检测

将培养过夜后的菌悬液分别接种至pH值为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5和14.0的LB液体培养基中(10% NaOH用于pH值调节)，每个梯度设3次重复，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，OD₆₀₀测定菌悬液浓度，以不接种菌液的不同pH培养基为对照组，绘制生长曲线并判断菌株pH生长范围，确定菌株最适生长pH。

1.7 菌株降碱能力测定

将保存菌株活化后以1%接种量分别接种至pH值为8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0和11.5的LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后观察菌株生长情况并测定发酵后菌液pH，菌株降碱率计算如下：

式中：η为菌株降碱能力；pH_前为菌株发酵前培养基的pH；pH_后为菌株发酵后培养基的pH^[16]。

1.8 菌株分子生物学鉴定

用Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒提取耐盐碱细菌基因组DNA，用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对菌株16S rRNA基因进行PCR扩增^[21]。PCR反应体系(10 μL)：27F、1492R引物(50 pmoL/μL)各0.1 μL，模板DNA 0.3 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)1 μL，10×ExTaq Buffer 1 μL，rTaq聚合酶(5 U/μL) 0.3 μL，ddH₂O补足10 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物送深圳华大基因股份有限公司进行测序。将测序得到的序列在https://www.ezbiocloud.net/网站进行序列比对，用软件MEGA 7.0构建系统发育树。

1.9 菌株碳源特征分析

利用Biolog Gen Ⅲ微孔板对耐盐碱菌YS-AT2进行碳源利用测定，共进行94种不同碳源和化学物质测试，其中包括71种碳源利用测试和23种化学敏感性测试。具体操作按照说明书进行。

1.10 菌株产IAA能力测定

采用Salkowski比色法评估菌株分泌IAA的能力^[22]。首先，将待测菌株在28 ℃、180 r/min条件下培养3 d。然后，将培养好的菌株接种到含有色氨酸的LB液体培养基中，每个菌株进行3次重复。同时，将不加菌液的LB培养基作为对照组，28 ℃、180 r/min培养3 d。培养结束后将菌悬液以10 000 r/min的速度离心5 min取上清液，将上清液与Salkowski比色液按照1:2的体积比混合后加入酶标板中，避光静置反应30 min。最后，测定OD₄₉₀吸光值，并利用线性公式[IAA浓度=(OD₄₉₀−0.068 3)/0.010 5]计算待测菌株分泌的IAA浓度。

1.11 菌株促盐碱胁迫下拟南芥生长能力测定

配制NaHCO₃为2 mmol/L (pH 9.5)的1/2 MS培养基备用。将拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0种子用75%酒精表面消毒后点种于1/2 MS培养基表面一侧于一条直线上，每个平皿10粒，4 ℃冰箱避光静置72 h，培养基另一侧接种10 μL菌悬液(OD₆₀₀=1.0)，以接种等量无菌水为对照，置于光照培养箱培养(温度为30 ℃，光照强度12 000 lx，光照16 h，黑暗8 h)，每个处理3次重复，培养7 d后观察拟南芥生长表型。

1.12 菌株促大豆种子在盐碱胁迫条件下发芽能力测定

大豆种子先用无菌水清洗表面尘土，再用75%酒精消毒5 min后用无菌水冲洗5次。室温下，将种子浸没于菌悬液(OD₆₀₀=1)中过夜，以无菌水浸泡的大豆种子为对照。隔天将浸泡后种子置于无菌培养袋中28 ℃恒温培养，定期分别加入15 mL NaCl (50、100和200 mmol/L)和15 mL NaHCO₃ (50、100和200 mmol/L)溶液，5 d后观察大豆早期幼苗生长情况。

1.13 菌株促盐碱胁迫条件下盆栽大豆幼苗生长效果

大豆种子于菌悬液(OD₆₀₀=1)中浸泡过夜，以无菌水浸泡种子作为对照，第2天将大豆种子播种在pH 8.2、土壤电导率(electricity conductivity, EC)为450 μs/cm的碱性土壤中，3次重复，在幼苗生长的第14天，向浸种处理的幼苗生长盆中浇灌40 mL菌液(OD₆₀₀=1)，于幼苗生长第24天收获大豆地上植株和根部，测量地上部分株高、鲜重和干重，清洗根部附着土壤，用根系扫描仪(Epson scanner)扫描植株根，并用WinRHIZO软件分析根长。

1.14 菌株基因组分析

按照Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒说明书提取菌株YS-AT2的基因组DNA后，纯化的基因组DNA采用TBS-380荧光仪进行定量。高质量的DNA (OD_260/280=1.8–2.0，DNA总量≥5 μg，浓度≥60 ng/μL)用于建库测序，具体测序委托深圳华大基因股份有限公司完成。测序完成后采用NCBI原核基因组自动注释管道(prokaryotic genomes automatic annotation pipeline)进行基因组注释^[23]，以文献报道的嗜盐和嗜碱机制密切相关的基因为关键词进行检索，在基因组水平上挖掘其可能参与耐盐碱过程的基因。

1.15 数据处理及分析

运用SPSS 16.0分析软件进行方差分析。

2 结果与分析 2.1 菌株分离及其耐碱性鉴定

通过含有9% NaCl的LB培养基的筛选，从宁夏回族自治区银川市盐碱地土壤中分离多株耐盐碱细菌，其中菌株YS-AT2对NaCl浓度和pH耐受范围最大[NaCl：0%–9% (质量体积分数)；pH 8.0–12.0] (图 1)，选取该菌株进行后续试验。该菌株在LB固体培养基上28 ℃培养2 d，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，略凸起，半透明，半流质，淡黄色，透射电镜下观察该菌株呈杆状(图 2)。该菌株已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2021238。降碱能力测定结果显示菌株在不同pH条件下降碱能力存在差异，在pH 8.5、9.0和9.5环境中降碱能力最强，降碱率分别为14.5%、13.2%和13.9%。

2.2 菌株YS-AT2的分子生物学鉴定结果

为进一步确定菌株YS-AT2的生物学地位，将菌株16S rRNA基因序列进行测序，并将测序结果在EzBioCloud网站与已发表的典型菌株进行相似性比对，菌株YS-AT2与Citrobacter freundii DSM 30039相似性为99.37%，采用neighbor-joining法构建的菌株系统发育树发现该菌株与Citrobacter freundii DSM 30039序列可构成稳定的进化分支。因此，确定该菌株是隶属于柠檬酸杆菌属的一个种，并将其命名为Citrobacter YS-AT2 (图 3)。

2.3 菌株YS-AT2表型测定情况

根据Biolog Gen Ⅲ微孔板显色情况可以进一步反映待测菌株YS-AT2对不同碳源的利用能力。结果表明，去除阴性和阳性对照，在剩余待测的94种表型测试中，71种碳源(表 1)明显显色的有D-麦芽糖等32种，弱显色的有D-麦海藻糖等22种，可见YS-AT2可利用碳源共有54种，占76.06%，不可利用碳源有D-松二糖等17种，占23.94%。23种化学敏感性测试(表 1)发生明显显色的有13种，弱显色的有7种，占86.96%，不显色的有3种，占13.04%。

2.4 菌株YS-AT2分泌IAA能力和促盐碱胁迫下拟南芥生长

为鉴定菌株YS-AT2分泌IAA的能力及盐碱环境下对植物的促生效果，采用比色法测定菌株IAA分泌能力，比色板明显变色，初步证明菌株YS-AT2具备IAA分泌能力。在pH 9.5的1/2 MS培养基平板中接种YS-AT2菌悬液培养7 d后，拟南芥生长情况如图 4所示，表明菌株YS-AT2可明显促进碱性条件下拟南芥生长。

2.5 菌株YS-AT2促进盐碱胁迫条件下大豆种子萌发

为进一步鉴定菌株YS-AT2在盐碱胁迫条件下对农作物生长的影响，选取早期大豆种子萌发情况进行研究。经测定，加入50、100和200 mmol/L NaCl盐溶液后培养液pH值分别为5.75 (图 5A)、5.82 (图 5B)和5.78 (图 5C)，加入50、100和200 mmol/L NaHCO₃后培养液pH值分别升高至8.53 (图 5D)、8.65 (图 5E)和8.91 (图 5F)。由图 5可见，菌株YS-AT2在不同浓度盐碱胁迫下可促进大豆种子萌发。

2.6 菌株YS-AT2促进盐碱胁迫条件下大豆幼苗生长

本研究又进一步分析了菌株YS-AT2在盐碱胁迫下对大豆幼苗生长的影响，菌株YS-AT2对pH 8.2、EC为450 μs/cm大豆幼苗生长的促进作用如图 6所示。接菌处理的大豆株高、鲜重、干重和根长分别比对照提高19.84%、18.75%、10.31%和32.58%，其中对大豆株高、鲜重和根长影响显著(表 2)。

2.7 菌株YS-AT2基因组注释分析

菌株YS-AT2共有12类基因可能与嗜盐和嗜碱有关，分别为甘氨酸/甜菜碱转运蛋白(glycine/betaine transporter)、海藻糖合成系统(trehalose synthesis)、钠转运体(sodium symporter)、谷氨酸氨连接酶(glutamate ammonia ligase)、谷胱甘肽调节的钾外流系统(glutathione-regulated potassium-efflux system)、Trk系统钾转运体(Trk system potassium transporter)、钾转运ATP酶(potassium-transporting ATPase)和其他钾转运体(other potassium transporter)和F0F1 ATP合成酶(F0F1 ATP synthase)等(表 3)。上述基因表明该菌株的耐盐碱机制可能是通过自身细胞对盐碱性物质的运输、对钠、钾离子的转运和调节以及合成高浓度细胞物质而实现的。

3 讨论

盐碱地是各种盐土、碱土以及不同程度盐化和碱化土壤的总称。其特点是土体中含有较多的盐碱成分，导致土壤不良的物理化学性质，致使大多数植物的生长受到不同程度的抑制，严重影响植物生长发育，制约了现代农业和经济的可持续发展，威胁生态安全^[24-25]。研究表明，耐盐碱促生菌可通过调控植物体内激素变化、诱导形成抗氧化系统、产生渗透调节物质、分泌胞外多糖和介导离子平衡等方式来缓解盐逆境损伤，提高植物的耐盐碱性，促进植物生长^{[5, 26-27]}。如Kuklinsky-sobral等^[28]研究发现，约80%的固氮菌属(Azotobacter)、荧光假单胞菌(Pseudomans fluorescens)、20%的芽孢杆菌属(Bacillus)在盐碱胁迫下可以通过分泌IAA促进植物生长，分泌的IAA可以通过参与植物质膜H⁺-ATP酶合成基因的修饰过程，进而提高植物的抗逆能力^[29]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在盐碱胁迫下可以通过proB和proA基因超表达而提高细胞合成脯氨酸的能力，脯氨酸属于渗透调节物质的一种，其积累可以介导提高植物的抗逆性^[30-31]。

在盐碱环境中促生菌有利于缓解盐碱胁迫作用对植物的伤害，促进植物种子萌发、器官分化和生物量积累与分配，进而提高植物的产量和品质^[32]。其中，种子萌发阶段是植物生长周期中最基本和最重要的阶段，影响着植物后续的生长发育^[33]。盐分的过度积累会使土壤渗透势增加，阻碍种子对水分的吸收，干扰种子内部核酸和蛋白质代谢，影响内源激素合成，抑制种子萌发^[34-35]。因此，近年来关于促生菌在盐碱胁迫下促进种子萌发作用也得到了越来越多的研究和应用。苑霖等^[36]从盐地碱蓬根际土中分离一株具有耐盐能力的克锡勒氏细菌(Kushneria indalinina) JP-JH，发现该菌接种后可通过提高根系草酸和酒石酸含量促进苗期小麦生长。Habib等^[34]研究证实分别在75 mmol/L和100 mmol/L盐胁迫下，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) UPMR2和肠杆菌(Enterobacter sp.) UPMR18可以通过诱导活性氧清除酶活性，提高秋葵的耐盐性，促进秋葵种子的萌发。本研究从中国宁夏回族自治区银川市盐碱地土壤中获得的耐盐碱菌Citrobacter YS-AT2，经证实可以在pH 9.5且含NaHCO₃的盐碱性环境中促进大豆种子萌发以及拟南芥种子的生长，因此，耐盐碱菌Citrobacter YS-AT2是可以应用于盐碱地综合利用的潜在微生物菌种资源。

目前，从基因组学角度解析微生物促生机制已得到了一些应用^{[17, 37]}，但仍不全面系统，关于微生物耐盐碱机制的微生物组学研究相对较少。微生物的耐盐碱机制相对复杂，高通量全基因组基因功能注释方法可以在基因组水平了解基因的功能，明确基因产物及其在生命活动中的作用，进而可以实现基因与其表现功能关系的判断。研究表明，耐盐碱细菌可以通过一系列策略适应盐碱环境，如土壤中过量的Na⁺会抑制植物对其他营养元素的吸收和体内分布，造成植物体内的离子比失衡，导致植物出现异常的生理状态，进而抑制植物的生长^[38]。然而植物体内K⁺的吸收能够有效激活植物体内关键酶促反应，维持胁迫条件下细胞渗透压平衡，帮助植物抵御盐碱胁迫的不利影响^[39]。因此，耐盐碱细菌比一般细菌具有更强的激活Na⁺/H⁺逆向转运蛋白和K⁺/Na⁺转运蛋白调节胞内离子渗透压的能力，进而可以抵御外界环境中盐碱的胁迫^[40]。在基因组学水平的研究有益于揭示菌株Citrobacter YS-AT2的耐盐碱促生机制，挖掘更多的基因组信息，本研究通过基因注释发现，菌株Citrobacter YS-AT2基因组中含有甘氨酸/甜菜碱转运蛋白和钠转运体等基因片段，有研究报道，甘氨酸/甜菜碱、脯氨酸的转运广泛存在于嗜盐细菌中，其可以作为相容性溶质来抵抗外界环境的胁迫^[41]。此外，菌株Citrobacter YS-AT2基因组中还含有Trk系统钾转运体、钾转运ATP酶和逆向转运体等钾离子输出系统，其可以通过细胞质酸化保护细胞免受亲电化合物的不利影响，进而保持稳定的渗透平衡，避免或者减少细胞受到的毒害作用。研究证实菌株Citrobacter YS-AT2在盐碱环境下能够通过多个基因组互作实现自身细胞对盐碱性物质的运输，对K⁺、Na⁺的转运和调节，进而维持体内外的渗透平衡来抵御外界高盐碱环境，保证自身的生命活动功能不受影响。

值得关注的是，Citrobacter属作为人体肠道菌群的一种，虽被广泛报道存在于土壤、水、食物等环境中，近年来关于Citrobacter属细菌的研究大多集中在致病力和抗生素生长潜力的研究^[42-43]，而对于其在植物生长上表现的促生功能报道相对较少。本研究获得的菌株Citrobacter YS-AT2来自盐碱地土壤，兼具促生和耐盐碱特性，不仅提高了人们对该属菌株特性的全面认识，而且为明确Citrobacter属的细菌多样性提供了菌株资源。但本研究仅验证了该菌株在拟南芥和大豆生长中表现促生能力，为全面评估该菌被开发成微生物菌肥应用到盐碱地的潜力，还需拓展该菌对其他作物的促生效果研究，未来也可利用多组学技术和同位素标记技术探讨该菌与作物互作和参与的土壤养分循环过程研究，揭示耐盐碱促生菌对作物元素利用情况的深层新机制。

4 结论

本研究从宁夏回族自治区银川市盐碱地土壤分离获得一株耐盐碱菌Citrobacter YS-AT2，其可在pH 8.0−12.0及NaCl含量0%−9%条件下生长，并可利用多种碳源和分泌IAA，对盐碱胁迫下拟南芥生长、大豆早期发芽和大豆幼苗生长均表现了显著的促生效应，丰富了人们对Citrobacter属细菌多样性的认知，同时，该菌也可作为潜在的微生物种质资源应用于盐碱农业的开发和综合利用。本研究在基因水平揭示了Citrobacter YS-AT2可能是通过自身细胞对盐碱性物质的运输以及对K⁺、Na⁺的转运和调节进而维持体内外渗透压和细胞内pH稳态，使得菌株在高盐碱环境下生存。