2023, Vol. 50
表1(Table 1)
一株花椒根腐病拮抗菌的筛选、发酵条件及其抑菌物质的初步分析
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文章信息
- 田凤鸣, 陈强, 何九军, 张晓娜, 王国斌
- TIAN Fengming, CHEN Qiang, HE Jiujun, ZHANG Xiaona, WANG Guobin
- 一株花椒根腐病拮抗菌的筛选、发酵条件及其抑菌物质的初步分析
- A biocontrol bacterial strain against Zanthoxylum bungeanum root rot: screening, fermentation condition optimization, and preliminary identification of antimicrobial ingredients
- 微生物学通报, 2023, 50(7): 2950-2969
- Microbiology China, 2023, 50(7): 2950-2969
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230057
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文章历史
- 收稿日期: 2023-01-22
- 接受日期: 2023-04-12
- 网络首发日期: 2023-05-17
田凤鸣, 陈强, 何九军, 张晓娜, 王国斌. 一株花椒根腐病拮抗菌的筛选、发酵条件及其抑菌物质的初步分析[J]. 微生物学通报, 2023, 50(7): 2950-2969.
TIAN Fengming, CHEN Qiang, HE Jiujun, ZHANG Xiaona, WANG Guobin. A biocontrol bacterial strain against Zanthoxylum bungeanum root rot: screening, fermentation condition optimization, and preliminary identification of antimicrobial ingredients[J]. Microbiology China, 2023, 50(7): 2950-2969.
一株花椒根腐病拮抗菌的筛选、发酵条件及其抑菌物质的初步分析
1. 陇南师范高等专科学校农林技术学院, 甘肃 陇南 742500;
2. 陇南特色农业生物资源研究开发中心, 甘肃 陇南 742500;
3. 陇南市武都区花椒服务中心, 甘肃 陇南 742500
2. 陇南特色农业生物资源研究开发中心, 甘肃 陇南 742500;
3. 陇南市武都区花椒服务中心, 甘肃 陇南 742500
摘要: 【背景】 腐皮镰孢(Fusarium solani)是陇南花椒根腐病的主要病原物，是危害花椒生产的重要原因之一。【目的】 筛选拮抗腐皮镰孢的生防菌株，为开发防治花椒根腐病的微生物农药提供新的生物资源。【方法】 采用平板对峙法结合16S rRNA基因序列分析等方法从花椒根围中分离具有较强抑菌效果的细菌并进行筛选鉴定；通过Box-Benhnken中心组合设计试验探究该菌最佳发酵条件；采用液质联用(LC-MS)方法对该菌发酵液的有机溶剂提取相进行非靶向代谢组学分析及KEGG、Lipidmaps数据库注释。【结果】 分离筛选出一株拮抗菌株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis) W-1，该菌株对腐皮镰孢的抑菌率为89%，对藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、梅毒镰孢(Fusarium syphilis)、层生镰孢(Fusarium proliferatum)和松针刺盘孢(Colletotrichum fioriniae)的抑制率为57%−90%。优化后W-1的最佳发酵条件为pH值6.5、温度30 ℃、接种量5%、转速180 r/min；发酵菌液浓度OD600值达到1.93，与LB基础培养基菌浓度相比提高了2.6倍；无菌发酵液在pH 2.0−9.0范围内抑菌活性稳定，紫外线(UVC 200−280 nm, 100 μW/cm2)照射10 min后抑菌活性逐渐下降，温度超过80 ℃后抑菌活性显著降低。最佳抑菌活性成分提取的有机溶剂是乙酸乙酯，有机提取相代谢物中含有脂肽类化合物表面活性素、磷酸寡肽抗生素、丁酰苷菌素、聚酮类化合物、溶菌杆素、环二肽、短杆菌肽等多种拮抗物质。【结论】 贝莱斯芽胞杆菌W-1能分泌多种抑菌活性物质，对多种植物病原真菌抑制效果较强；其发酵液耐酸碱、耐高温，在花椒根腐病的生物防治中具有较大应用潜力。
关键词:
花椒根腐病 腐皮镰孢 拮抗菌 发酵优化
A biocontrol bacterial strain against Zanthoxylum bungeanum root rot: screening, fermentation condition optimization, and preliminary identification of antimicrobial ingredients
1. Technique College of Agriculture and Forestry, Longnan Teachers College, Longnan 742500, Gansu, China;
2. Center for Research and Development of Longnan Characteristic Agro-Bioresources, Longnan 742500, Gansu, China;
3. Prickly Ash Peel Service Center of Wudu District, Longnan 742500, Gansu, China
2. Center for Research and Development of Longnan Characteristic Agro-Bioresources, Longnan 742500, Gansu, China;
3. Prickly Ash Peel Service Center of Wudu District, Longnan 742500, Gansu, China
Abstract: [Background] Fusarium solani is the main pathogen of Zanthoxylum bungeanum root rot in Longnan, affecting the production of Z. bungeanum. [Objective] To screen out a strain for the biocontrol of F. solani and provide new bioresources for the development of microbial agents for the control of Z. bungeanum root rot. [Methods] In this study, we employed the plate confrontation method and 16S rRNA gene sequencing to screen and identify the bacterial strain with strong antimicrobial activity from the rhizosphere soil of Z. bungeanum. Box-Benhnken design was employed to optimize the fermentation conditions of the strain. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was used to study the changes of metabolites in the organic solvent phase of the bacterial fermentation broth. [Results] The antagonistic strain screened out was identified as Bacillus velezensis W-1, which showed the inhibition rates of 89% against F. solani and 57%–90% against Gibberella fujikuroi, Fusarium graminearum, Fusarium syphilis, Fusarium proliferatum, and Colletotrichum fioriniae. The fermentation conditions of W-1 were optimized as pH 6.5, 30 ℃, inoculum amount of 5%, and 180 r/min. The OD600 value of the fermentation broth obtained under the optimal conditions reached 1.93, which was 2.6 times higher than that of the LB basal medium. The antimicrobial activity of the sterile fermentation broth remained stable in the range of pH 2.0−9.0 and gradually decreased after the broth was irradiated with ultraviolet light (UVC 200−280 nm, 100 μW/cm2) for 10 min. The antimicrobial activity significantly decreased when the temperature exceeded 80 ℃. Ethyl acetate was the best organic solvent for the extraction of antimicrobial ingredients. The organic phase of the extract contained rich antagonistic substances, such as lipopeptides (surfactants), phosphate oligopeptides (antibiotics), butirosin, polyketone compounds, lysobactin, cyclic dipeptides, and gramicidin. [Conclusion] B. velezensis W-1 can secrete a variety of antimicrobial substances and has strong inhibitory effects on multiple common pathogenic fungi of plants. Moreover, its fermentation broth can tolerate acid, alkali, and high temperature, demonstrating great potential for application in the biocontrol of Z. bungeanum root rot.
Keywords:
Zanthoxylum bungeanum root rot Fusarium solani antagonistic bacteria optimization of fermentation conditions
花椒根腐病是甘肃陇南花椒种植园最典型的病害之一，已给花椒栽培与种植带来了严重的影响。近年来，许多学者对不同区域的花椒根腐病病原菌进行分离鉴定，确定腐皮镰孢(Fusarium solani)是引起花椒根腐病的优势种群[1-5]。目前农药依然是花椒根腐病防治的重要手段，但过度使用化学农药会造成生态环境污染并影响食品安全，而选择环保安全的生物农药进行替代和补充就显得尤为重要[6]。因此，利用微生物农药防治花椒根腐病是未来花椒农业发展的最有效途径，而生防菌的筛选成为防控花椒根腐病的研究热点。
芽胞杆菌对细菌、真菌和病毒所引起的植物病害均具有很好的抑制作用，是生防菌中应用最广泛的菌种资源[7]。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)作为芽胞杆菌的新种，在其培养中能够产生多种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物，在农作物病虫害防治中应用广泛[8]。国内外已报道许多有关贝莱斯芽胞杆菌的研究及成果，研究最多的是商业化的贝莱斯芽胞杆菌FZB42，与其相关的文章有140多篇[9]。肖倩等[10]报道的贝莱斯芽胞杆菌HMQAU19044和Zheng等[11]研究的贝莱斯芽胞杆菌D61-A分别对黄瓜霜霉病和水稻纹枯病表现出良好的防控效果。2016年贝莱斯芽胞杆菌9912D被批准为新型生物杀菌剂，特别是在高效防治黄瓜灰霉病、苹果腐烂病、棉花枯萎病、番茄灰霉病等病害方面具有重要抑菌作用[12]。2019年贝莱斯芽胞杆菌专利产品进行了登记[13]。2021年农业农村部正式颁发了针对烟草白粉病和黄瓜白粉病的贝莱斯芽胞杆菌CGMCC 14384微生物农药原药和制剂登记证书[14]。此外，贝莱斯芽胞杆菌AH2也已在农业中广泛应用并投入到生产中[15]。由此可见贝莱斯芽胞杆菌具有广阔的应用前景。贝莱斯芽胞杆菌作为生物菌剂或生物农药在防治花椒根腐病中的相关报道较少。因此，筛选针对花椒根腐病的生防菌尤为必要，同时也可为防控花椒根腐病的生物菌剂或生物农药的研发提供新的生物资源。
本研究筛选的贝莱斯芽胞杆菌W-1分离自健康花椒根围土壤中，不仅对花椒根腐病具有良好的拮抗作用，更适宜陇南土壤环境，易在陇南土壤中定殖。为提高该菌的发酵产量，本研究优化发酵条件并对其无菌发酵液的稳定性和抑菌活性物质开展具体研究，以期挖掘出菌株W-1在花椒根腐病防治中的重要应用价值，为该菌的开发和应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料土壤样品来自陇南市武都区马街镇花椒示范基地，距离表层10 cm处的土层。腐皮镰孢(Fusarium solani)分离自陇南花椒根腐病株[4]。植物病原真菌藤仓赤霉菌、禾谷镰孢、梅毒镰孢和层生镰孢由江西师范大学杨慧林惠赠；松针刺盘孢由本实验室保存于4 ℃冰箱备用。
1.1.1 培养基LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，调pH值至7.0；PDA培养基(g/L)：葡萄糖20.0，马铃薯200.0，琼脂18.0；NYBD培养基(g/L)：牛肉浸粉8.0，葡萄糖10.0，酵母浸粉5.0，调pH值至7.0；经过121 ℃灭菌20 min后备用。
CAS (铬天青)检测平板(g/L)：基础培养基，葡萄糖100.0，蛋白胨20.0，七水硫酸镁0.5，氯化钙0.5，琼脂粉20.0，10×缓冲液(已灭菌) 100.0 mL；CAS检测液：铬天青0.06，FeCl3·6H2O 0.002 7，溴化十六烷基三甲铵0.073，调pH值至7.0。
1.1.2 主要试剂和仪器细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技有限公司；PCR产物磁珠法纯化试剂盒，硕美公司；琼脂糖，太阳马；其余试剂均为国产分析纯。体视显微镜，南京鼎诚精密仪器有限公司；不锈钢正压过滤器，上海信步科技有限公司；紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；气浴式摇床，常州高德仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.2 方法 1.2.1 菌株W-1的分离纯化和筛选称取1.0 g土壤样品加入90 mL的无菌水，在气浴式摇床180 r/min、30 ℃培养30 min，梯度稀释至10−6、10−7和10−8，取100 μL分别涂布于LB固体培养基中，32 ℃恒温培养24 h后挑取单菌落进行液体培养。
在培养7 d后的腐皮镰孢PDA培养基中打成直径6 mm的菌饼，放置于新的PDA平板中央，在距菌饼2.0 cm处按照品字形放置无菌滤片，滤片上加入10 μL W-1培养液。以不加培养液的真菌平板作为对照，在30 ℃恒温培养5−7 d，每个处理3次重复，测定抑菌率。抑菌率(%)=[对照组菌落直径(mm)−测试组菌落直径(mm)]/[对照组菌落直径(mm)−6 (mm)]×100[16]。通过抑菌率的测定筛选出菌株W-1。
1.2.2 菌株W-1对病原真菌菌丝的抑制作用将培养7 d的抑菌平板置于放大倍数为150的体视显微镜下，观察腐皮镰孢的菌丝形态，分析菌株W-1对腐皮镰孢菌丝前端生长形态的影响程度。
1.2.3 菌株W-1抑菌谱的测定将供试真菌用打孔器打成6 mm直径的菌饼，放置于PDA平板中央，将W-1培养液接种于以品字形放置在PDA培养基上的无菌滤纸片上，30 ℃恒温培养5−7 d，测定抑菌率，每个处理3次重复。
1.2.4 菌株W-1产嗜铁素和产胞外酶的检测菌株W-1产嗜铁素能力的检测参照梁建根[17]的方法，取5 μL W-1菌液接种于CAS检测平板中，32 ℃恒温培养3 d后测量菌落周围的黄色晕圈直径(mm)。菌株W-1产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶能力的检测均参照郝金辉等[18]的方法，取5 μL W-1菌液分别接种于纤维素酶、几丁质酶和蛋白酶平板中，32 ℃恒温培养3 d后，在纤维素酶平板上加入刚果红染色15 min，NaCl脱色10 min后测量其透明圈的直径。几丁质酶和蛋白酶直接测定其透明圈的直径。
1.2.5 菌株W-1的分子生物学鉴定扩增菌株W-1的16S rRNA基因片段使用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1429R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系(25 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(20 ng/μL) 2 μL，PCR Mix 21 μL。PCR反应条件：96 ℃ 5 min；96 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。通过NCBI中BLAST进行同源序列的比对，筛选相似度高的菌株序列分析其亲缘关系并构建系统发育树[19]。
1.3 响应面法优化菌株W-1的最佳发酵条件 1.3.1 筛选最佳发酵条件单因素试验前期试验证实NYBD培养基为菌株W-1最适生长培养基。比较4项因素对菌株W-1生长量的影响：pH值以1.0为间隔设置2.5−10.5共9个不同的梯度；温度以2 ℃为间隔设置26−34 ℃ 5个不同的梯度；转速以20 r/min为间隔设置140−220 r/min 5个不同的梯度；接种量以2%为间隔设置1%−11%共6个不同的梯度，每个处理重复3次，采用紫外可见分光光度计测定22 h的菌液OD600值，确定液体发酵的最佳单因素条件。
1.3.2 响应面法优化菌株W-1液态发酵的最佳条件根据Box-Benhnken中心组合的试验设计原理，同时结合单因素结果，选取4项因素(pH、温度、转速、接种量)设计响应面的分析试验，响应值是以22 h的OD600值为测定数据，每组试验3次重复。二次回归拟合方程利用Design-Expert 11软件进行分析，获得W-1最佳液态发酵条件。拟合出的最佳条件通过单因素试验筛选结果进行验证[20]。试验因素与水平设计见表 1。
表 1 响应面因素与水平设计
Table 1 Response surface factors and horizontal design
| Factor | −1 | 0 | 1 |
| A: pH | 5.5 | 6.5 | 7.5 |
| B: Temperature (℃) | 28 | 30 | 32 |
| C: Inoculation amount (%) | 3 | 5 | 7 |
| D: Rotational speed (r/min) | 160 | 180 | 200 |
将W-1单菌落接种于NYBD液体培养基中30 ℃、180 r/min培养22 h后，以5% (体积分数)接种于500 mL液体培养基中扩大培养。恒温培养7 d后得到菌株W-1的发酵液。将发酵液用不锈钢正压过滤器过滤(0.22 μm细菌过滤膜)后得到无菌发酵液。
1) pH对发酵液稳定性的测定
将发酵液分别用盐酸溶液(2.0 mol/L)和氢氧化钠溶液(2.0 mol/L)调节pH值至2.0−12.0，以1.0为间隔，调成12个不同的梯度，以未调节pH的发酵液为对照，将不同pH的发酵液放于4 ℃冰箱，24 h后取出发酵液将其pH值调回至6.5，测定对腐皮镰孢的抑菌率。
2) 温度对发酵液稳定性的测定
将10 mL拮抗菌W-1的发酵液分别在40、60、80和100 ℃的水浴锅中加热，分别处理10、30和60 min后，取出样品置于冰上冷却，以未加热处理的发酵液作为对照，测定对腐皮镰孢的抑菌率。
3) 紫外线对发酵液稳定性的测定
取11个无菌培养皿各加入10 mL发酵液，放置于距离紫外灯管(UVC 200−280 nm, 100 μW/cm2) 10−15 cm处的正下方，照射时间为0、1、5、10、15、20、25、30、45、60和75 min，取出不同时间点的发酵液测定对腐皮镰孢的抑菌率。
1.5 菌株W-1抗真菌物质提取选取4种不同的有机溶剂(环己烷、正丁醇、石油醚和乙酸乙酯)作为提取溶剂，将500 mL无菌发酵液与等体积的提取溶剂混合，静置提取48 h，混合液分层后用分液漏斗收取有机相和水相。将提取后的水相和有机相置于旋转蒸发仪中40 ℃减压蒸馏，水相除去其中的有机溶剂，有机相旋转至干燥后用5−10 mL甲醇溶解，将其作为抗菌物质提取物，测定对腐皮镰孢的抑制率，筛选最佳的有机溶剂[21]。
1.6 乙酸乙酯提取有机相中抑菌活性成分分析对乙酸乙酯提取的有机相中抗真菌活性成分进行LC-MS非靶向代谢组分析，以上代谢组分析由北京百迈客生物科技有限公司完成。代谢产物进行Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)数据库和lipid metabolites and pathways strategy (LIPID MAPS)数据库注释[22]。
1.7 数据分析试验数据的统计和分析采用SPSS 17.0和Excel 2007软件。
2 结果与分析 2.1 菌株W-1的分离及形态观察菌株W-1在LB固体培养基上培养36 h后，菌落形态呈圆形，乳白色，不透明(图 1A)，在体视显微镜下观察到单菌落表面干燥且呈褶皱状(图 1B)，在LB固体培养基中易被挑起成黏稠状态，在LB液体培养基中，液体表面会形成一层薄膜，液体内混浊均匀。
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| 图 1 菌株W-1的菌落及形态特征 Figure 1 Colony and morphological characteristics of strain W-1. A：36 h后的菌落形态. B：在体视显微镜下的菌落形态(150×) A: Colony morphology after 36 hours. B: Morphology under stereomicroscope (150×). |
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以培养7 d的病原菌为对照(图 2A)，菌株W-1对腐皮镰孢有明显的拮抗作用，抑菌率为89% (图 2B)，体视显微镜观察到对照腐皮镰孢的菌丝前端呈放射状，菌丝粗细均匀，前端浓密且蓬松、颜色亮白(图 2C)；而被菌株W-1抑制的腐皮镰孢菌丝前端出现扭曲、稀薄、无延伸等畸形现象(图 2D)。这表明菌株W-1对腐皮镰孢菌丝的生长存在明显的抑制作用。
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| 图 2 菌株W-1的抑菌效果及对腐皮镰孢菌丝生长的影响 Figure 2 The bacteriostatic effect of strain W-1 and its influence on the mycelial growth of Fusarium solani. A：培养7 d的腐皮镰孢. B：菌株W-1对腐皮镰孢的抑菌效果. C：正常的腐皮镰孢菌丝前端. D：菌株W-1存在时的腐皮镰孢菌丝前端 A: Fusarium solani after cultured for 7 days. B: The bacteriostatic effect of strain W-1 on Fusarium solani. C: Normal hyphal front end of Fusarium solani. D: The hyphal front end of Fusarium solani with strain W-1. |
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菌株W-1对5种植物病原真菌菌丝的生长均表现出较强的抑制作用，对禾谷镰孢的抑菌率为57%，对梅毒镰孢的抑菌率为77%，对层生镰孢的抑菌率为73%，对松针刺盘孢菌的抑菌率为90%，对藤仓赤霉的抑菌率为83%，其中对松针刺盘孢的抑制作用最强，对禾谷镰孢的抑制作用最弱(图 3)。
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| 图 3 菌株W-1对5种植物病原真菌的抑菌作用 Figure 3 Antimicrobial effect of strain W-1 on five plant pathogenic fungi. A1：禾谷镰孢. A2：菌株W-1对禾谷镰孢的抑菌作用. B1：梅毒镰孢；B2：菌株W-1对梅毒镰孢的抑菌作用. C1：层生镰孢；C2：菌株W-1对层生镰孢的抑菌作用. D1：松针刺盘孢；D2：菌株W-1对松针刺盘孢的抑菌作用. E1：藤仓赤霉菌；E2：菌株W-1对藤仓赤霉的抑菌作用 A1: Fusarium graminearum; A2: Antimicrobial effect of W-1 against Fusarium graminearum. B1: Fusarium syphilis; B2: Antimicrobial effect of strain W-1 against Fusarium syphilis. C1: Fusarium proliferatum; C2: Antimicrobial effect of strain W-1 against Fusarium proliferatum. D1: Colletotrichum fioriniae; D2: Antimicrobial effect of strain W-1 on Colletotrichum fioriniae. E1: Gibberella fujikura; E2: Antimicrobial effect of strain W-1 on Gibberella fujikura. |
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透明圈的大小表明，菌株W-1能够产生大量的蛋白酶(图 4A)和少量的纤维素酶(图 4B)，但未检测到几丁质酶。同时W-1菌落周围产生较大的橘黄色晕圈，且黄色晕圈直径可达82 mm (图 4C)，表明产嗜铁素能力极强。
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| 图 4 菌株W-1胞外酶检测及产嗜铁素能力检测 Figure 4 Detection of extracellular enzyme and siderophore production ability of strain W-1. A：产蛋白酶检测. B：产纤维素酶检测. C：产嗜铁素能力检测 A: Detection of protease production. B: Detection of cellulase production. C: Siderophore production capacity test. |
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利用PCR扩增菌株W-1的16S rRNA基因片段，经测序其长度为1 423 bp，将序列提交至GenBank数据库，通过BLAST筛选出高度相似的序列，采用MEGA 7.0软件构建基于16S rRNA基因序列的系统发育树，图 5结果显示：菌株W-1与贝莱斯芽胞杆菌聚为一支，结合形态学特征及序列分析结果，将菌株W-1鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。
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| 图 5 菌株W-1基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree construction based on 16S rRNA gene sequence of strain W-1. The parentheses represent the GenBank login number; Bootstrap times are set to 1 000; The numbers on the branch points indicate the support rate for bootstrap; Ruler represents 0.005 of sequence. 括号内表示GenBank登录号；Bootstrap设置为1 000；分支点上的数字表示bootstrap的支持率；标尺表示0.005%的序列差异 |
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菌株W-1在pH 5.5−9.5之间均能较好地生长，在pH 6.5时OD600值最大为1.79，而且酸碱度接近中性有利于菌株W-1的发酵，最佳pH值为6.5 (图 6A)；当接种量为5%时，OD600值最大为1.77，为最优接种量(图 6B)；不同发酵温度对菌株发酵影响较大，随着发酵温度的升高，在26−30 ℃范围内，OD600值也逐渐升高，30 ℃时OD600值最大为1.84，超过30 ℃发酵液的OD600值随着温度升高而呈下降趋势，不利于其发酵，最佳发酵温度为30 ℃ (图 6C)；不同摇床转速条件下的OD600值存在一定差异，在140−180 r/min范围内，OD600值随着转速的升高不断增加，转速为180 r/min时OD600值最大为1.85，确定180 r/min为菌株W-1发酵培养的最适转速(图 6D)。
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| 图 6 四种不同因素对菌株W-1生长量的影响 Figure 6 Effects of four different factors on the growth of strain W-1. A：pH. B：接种量. C：温度. D：转速 A: pH. B: Inoculation amount. C: Temperature. D: Speed. |
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响应面水平试验设计方案和结果见表 2，利用Design-Expert 11软件对试验数据进行二次多元回归拟合，得到OD600值(Y)对pH (A)、发酵温度(B)、接种量(C)和摇床转速(D)这4个变量的二次多项回归拟合方程为：Y=1.93−0.002 1A−0.004 8B+ 0.002 7C+0.010 1D+0.021 6AB+0.007 5AC+0.001 7AD− 0.005 7BC+0.014 4BD−0.013 7CD−0.250 2A2−0.236 3B2− 0.243 2C2−0.252 8D2 (R2=0.999 4)，由表 3结果可知，模型极显著(P < 0.01)，且失拟项不显著(P < 0.5)，表明此模型不但可信度好且拟合程度较高，预测R2=0.997 2与调整决定系数R2(adj)=0.998 9的差值< 0.2，表明该回归模型的拟合度良好，且模型得到的预测值与试验值相一致，信噪比Adeq precision > 4，表明该回归模型不但响应信号强且可信度高，可用于后续设计菌株W-1液态发酵培养条件。一次项转速(D)、二次项pH(A2)、交互项(AB)、培养温度(B2)、摇床转速(D2)和接种量(C2)对菌株W-1生长量的OD600影响极显著(P < 0.01)，一次项发酵温度(B)、交互项(AC)对菌株W-1生长量(OD600)影响显著(P <0.05)，表明这4个单因素对菌株W-1生长量(OD600)的影响不是简单的线性关系，而是存在交互作用。
表 2 响应面法设计方案和结果
Table 2 Response surface method design scheme and results
| No. | A: pH |
B: Temperature (℃) | C: Inoculation amount (%) |
D: Rotational speed (r/min) | OD600 | No. | A: pH |
B: Temperature (℃) | C: Inoculation amount (%) | D: Rotational speed (r/min) | OD600 | |
| 1 | 5.5 | 28 | 5 | 180 | 1.475 00 | 16 | 6.5 | 32 | 7 | 180 | 1.438 33 | |
| 2 | 7.5 | 28 | 5 | 180 | 1.423 00 | 17 | 5.5 | 30 | 3 | 180 | 1.438 67 | |
| 3 | 5.5 | 32 | 5 | 180 | 1.425 67 | 18 | 7.5 | 30 | 3 | 180 | 1.430 67 | |
| 4 | 7.5 | 32 | 5 | 180 | 1.460 00 | 19 | 5.5 | 30 | 7 | 180 | 1.431 67 | |
| 5 | 6.5 | 30 | 3 | 160 | 1.434 67 | 20 | 7.5 | 30 | 7 | 180 | 1.453 67 | |
| 6 | 6.5 | 30 | 7 | 160 | 1.465 83 | 21 | 6.5 | 28 | 5 | 160 | 1.465 53 | |
| 7 | 6.5 | 30 | 3 | 200 | 1.434 33 | 22 | 6.5 | 32 | 5 | 160 | 1.432 00 | |
| 8 | 6.5 | 30 | 7 | 200 | 1.410 67 | 23 | 6.5 | 28 | 5 | 200 | 1.425 00 | |
| 9 | 5.5 | 30 | 5 | 160 | 1.445 00 | 24 | 6.5 | 32 | 5 | 200 | 1.449 00 | |
| 10 | 7.5 | 30 | 5 | 160 | 1.431 00 | 25 | 6.5 | 30 | 5 | 180 | 1.924 67 | |
| 11 | 5.5 | 30 | 5 | 200 | 1.420 33 | 26 | 6.5 | 30 | 5 | 180 | 1.936 60 | |
| 12 | 7.5 | 30 | 5 | 200 | 1.413 00 | 27 | 6.5 | 30 | 5 | 180 | 1.936 67 | |
| 13 | 6.5 | 28 | 3 | 180 | 1.451 67 | 28 | 6.5 | 30 | 5 | 180 | 1.928 33 | |
| 14 | 6.5 | 32 | 3 | 180 | 1.445 33 | 29 | 6.5 | 30 | 5 | 180 | 1.931 67 | |
| 15 | 6.5 | 28 | 7 | 180 | 1.467 67 |
表 3 响应面试验回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation of response surface test
| Source of variance | Sum of squares | DF | Mean square | F-value | P-value | Significance |
| Model | 1.01 | 14 | 0.071 8 | 1 791.79 | < 0.000 1 | ** |
| A: pH | 0.000 1 | 1 | 0.000 1 | 1.30 | 0.273 4 | |
| B: Temperature | 0.000 3 | 1 | 0.000 3 | 6.88 | 0.020 0 | * |
| C: Inoculation amount | 0.000 1 | 1 | 0.000 1 | 2.20 | 0.160 5 | |
| D: Rotational | 0.001 2 | 1 | 0.00 12 | 30.79 | < 0.000 1 | ** |
| AB | 0.001 9 | 1 | 0.001 9 | 46.49 | < 0.000 1 | ** |
| AC | 0.000 2 | 1 | 0.000 2 | 5.61 | 0.032 7 | * |
| AD | 0.000 0 | 1 | 0.000 0 | 0.277 5 | 0.606 6 | |
| BC | 0.000 1 | 1 | 0.000 1 | 3.30 | 0.090 8 | |
| BD | 0.000 8 | 1 | 0.000 8 | 20.64 | 0.000 5 | ** |
| CD | 0.000 8 | 1 | 0.000 8 | 18.74 | 0.000 7 | ** |
| A2 | 0.405 9 | 1 | 0.405 9 | 10 127.18 | < 0.000 1 | ** |
| B2 | 0.362 3 | 1 | 0.362 3 | 9 039.51 | < 0.000 1 | ** |
| C2 | 0.383 7 | 1 | 0.383 7 | 9 573.26 | < 0.000 1 | ** |
| D2 | 0.414 6 | 1 | 0.414 6 | 10 344.11 | < 0.000 1 | ** |
| Residual | 0.000 6 | 14 | 0.000 0 | |||
| Lack of fit | 0.000 5 | 10 | 0.000 0 | 1.65 | 0.332 4 | Not significant |
| Pure error | 0.000 1 | 4 | 0.000 0 | |||
| Cor total | 1.01 | 28 | ||||
| R2=0.997 2 R2(adj)=0.998 9 Adeq precision=113.585 3 | ||||||
| 0.01 < P < 0.05，表示显著(*)；P < 0.01，表示极显著(**) 0.01 < P < 0.05, indicating significant (*); P < 0.01, indicating extremely significant (**). |
||||||
由图 7的6个响应面可知，其均为光滑且开口向下的曲面，表明在试验设计的4因素3水平范围内能够获得菌株W-1的最大发酵产量。等高线图趋于椭圆形，表明所对应的两因素交互作用对菌株W-1的生长量在所确定因素范围之内。综上所述，各因素对菌株W-1发酵量的影响顺序为：转速 > 温度 > 接种量 > pH，该结果与回归模型方差分析结果相一致。
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| 图 7 各因素交互影响的响应面图 Figure 7 Response surface diagram of the interaction of various factors. A：pH与温度交互对响应面图的影响. B：pH与接种量交互对响应面图的影响. C：温度与接种量交互对响应面图的影响. D：pH与转速交互对响应面图的影响. E：温度与转速交互对响应面图的影响. F：接种量与转速交互对响应面图的影响 A: Effect of pH and temperature interaction on response surface diagram. B: Effect of interaction between pH and inoculum on response surface diagram. C: The influence of temperature and inoculation quantity interaction on response surface diagram. D: Effect of interaction between pH and rotating speed on response surface diagram. E: The influence of temperature and speed interaction on response surface diagram. F: The effect of the interaction between inoculation amount and rotation speed on response surface diagram. |
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如图 8A所示，菌株W-1的发酵液经紫外照射15 min后，抑菌率由65.3%下降至46.2%。在15−75 min范围内抑菌活性下降缓慢，照射75 min后，抑菌率仍有36.9%。如图 8B所示，发酵液在pH 2.0−7.0的酸性环境中抑菌活性稳定，抑菌率在60%以上。在pH 8.0时抑菌活性逐渐下降，在pH 12.0时抑菌率下降至12.3%。如图 8C所示，菌株W-1发酵液的抑菌活性在40−60 ℃范围内稳定性较好，80 ℃处理60 min，其抑菌率由原有的66.1%下降至44.6%；而100 ℃处理60 min后抑菌活性下降显著，由原有的65.7%下降至24.3%，这表明抗菌物质对80 ℃以上的高温比较敏感。综上所述，菌株W-1的发酵液对紫外线照射、碱性环境和80 ℃以上的高温比较敏感。
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| 图 8 菌株W-1的发酵液稳定性测定结果 Figure 8 Determining of fermentation broth stability of strain W-1. A：不同紫外照射时间对发酵液抑菌活性的影响. B：不同pH对发酵液抑菌活性的影响. C：不同处理温度对发酵液抑菌活性的影响 A: The effect of different ultraviolet irradiation time on the antibacterial activity of fermentation broth. B: The effect of different pH on the antibacterial activity of fermentation broth. C: Effect of different treatment temperature on antibacterial activity of fermentation broth. |
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如图 9所示，菌株W-1发酵液的有机溶剂提取物对腐皮镰孢菌菌丝的抑制效果依次为：乙酸乙酯 > 石油醚 > 正丁醇 > 环己烷，因此确定乙酸乙酯为最佳提取溶剂。如图 10所示，乙酸乙酯提取的有机相对腐皮镰孢的抑菌率最高，为97.3%，而乙酸乙酯提取后的余液的抑制率仅为61.2%。结果表明，乙酸乙酯能够将菌株W-1发酵液中的抑菌活性物质提取出来。
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| 图 9 不同有机溶剂提取相对腐皮镰孢菌丝的抑菌效果 Figure 9 The antimicrobial effect of different organic solvent extract phase on Fusarium solani. A1：腐皮镰孢的对照；A2：菌株W-1发酵液对腐皮镰孢的抑菌效果. B1：环己烷提取有机相对腐皮镰孢的抑菌效果；B2：环己烷提取水相对腐皮镰孢的抑菌效果. C1：正丁醇提取有机相对腐皮镰孢的抑菌效果；C2：正丁醇发酵水相对腐皮镰孢的抑菌效果. D1：石油醚提取有机相对腐皮镰孢的抑菌效果；D2：石油醚提取水相对腐皮镰孢的抑菌效果. E1：乙酸乙酯提取有机相对腐皮镰孢的抑菌效果；E2：乙酸乙酯提取水相对腐皮镰孢的抑菌效果 A1: Control of Fusarium solani; A2: Antibacterial effect of strain W-1 fermentation broth on Fusarium solani. B1: Antimicrobial effect of cyclohexane extraction on Fusarium solani; B2: The antibacterial effect of cyclohexane extract aqueous phase on Fusarium solani. C1: The antibacterial effect of organic extracts of n-butanol on Fusarium solani; C2: Antibacterial effect of n-butanol extract aqueous phase on Fusarium solani. D1: Inhibition of petroleum ether extract on Fusarium solani; D2: Antibacterial effect of petroleum extract aqueous phase on Fusarium solani. E1: The organic phase extracted with ethyl acetate has antibacterial effect on Fusarium solani; E2: Antimicrobial effect of ethyl acetate extract aqueous phase on Fusarium solani. |
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| 图 10 不同有机溶剂提取相对腐皮镰孢抑制率的测定 Figure 10 Determination of relative inhibition rate extracted with different organic solvents on Fusarium solani. |
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LC-MS检测结果如图 11和图 12所示，菌株W-1发酵液的乙酸乙酯提取物样本中共检测到11.015个峰，其中注释到5.177个代谢物。KEGG数据库注释结果如图 13所示，获取到主要的代谢途径，主要集中在色氨酸代谢，葡萄糖苷酸生物合成，吲哚生物碱的生物合成，异喹啉生物碱生物合成，托烷-哌啶和吡啶生物碱的生物合成，鸟氨酸赖氨酸和烟酸的生物碱，莽草酸途径生物碱的生物合成，花生四烯酸代谢，苯基丙酸的生物合成，12、14和16元大环内酯的生物合成，类固醇激素生物合成，ABC转运系统，蛋白质消化和吸收，以及类胡萝卜素生物合成，以上代谢物和代谢途径为后期研究菌株W-1的抑菌机制提供了重要的信息。LIPID MAPS数据库注释结果如图 14所示，富集到的代谢物包括脂质的6大类，分别为孕烯醇酮脂类(prenol lipids, PR)、脂肪酸类(fatty acids, FA)、聚酮类(polyketides, PK)、鞘脂类(sphingolipids, SP)、固醇脂类(sterol lipids, ST)和甘油磷脂类(glycerophospholipids, GP)，其中脂肪酸类(fatty acids, FA)的脂肪酸和共轭物(fatty acids and conjugates)次代谢产物所包含的代谢物数目最大。代谢产物中与抑菌相关的活性物质如表 4所示，负离子模式下检测出4种抑菌活性物质，分别为rhizocticin D、butirosin A、macrobiotic-A和surfactin，其中丰度最高的为macrobiotic-A，高达2 032.659 005。在正离子模式下检测到5种抑菌活性物质，分别为bacilysin、cyclo (Tyr-Ala)、7-o-succinyl macrolactin A、surfactin A和gramicidin S，其中丰度最高的为surfactin A，高达775 637.811 7。以上结果推测菌株W-1是通过产生多种拮抗物质来抑制腐皮镰孢的生长，是一种十分具有生物防治潜力的优势菌种。
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| 图 11 正离子模式 Figure 11 Positive ion mode. |
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| 图 12 负离子模式 Figure 12 Negative ion mode. |
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| 图 13 KEGG数据库分类汇总 Figure 13 Summary of KEGG database classification. 横坐标表示对应通路注释到的代谢物数量与所有注释到KGEE的代谢物数量的比值 The abscissa represents the ratio of the number of metabolites annotated to the corresponding pathway to the number of metabolites annotated to KGEE. |
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| 图 14 LIPID MAPS数据库分类汇总 Figure 14 Summary of LIPID MAPS database classification. 横坐标表示对应分类注释到的代谢物数量与所有注释到LIPID MAPS的代谢物数量的比值 The abscissa represents the ratio of the number of metabolites annotated in the corresponding classification to the number of metabolites annotated in all LIPID MAPS. |
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表 4 菌株W-1发酵产物中检测到的抑菌活性物质
Table 4 Bacteriostatic substances detected in the strain W-1 fermentation products
| 代谢物 Metabolite (ID) PP |
代谢物 Metabolites |
代谢物丰度 Metabolite abundance |
| neg_3182 | 聚酮类化合物Macrolactin-A[23] | 2 032.659 005 |
| pos_5060 | 聚酮类化合物7-o-succinyl macrolactin A[24] | 5 510.821 967 |
| pos_3418 | 环二肽Cyclo (Tyr-Ala)[25] | 132.503 287 8 |
| pos_6944 | 短杆菌肽S Gramicidin S[26] | 522.431 152 8 |
| pos_3098 | 溶菌杆素Bacilysin[27] | 309.497 846 6 |
| neg_1137 | 磷酸寡肽抗生素Rhizocticin D[28] | 51.485 015 75 |
| pos_6886 | 表面活性素A Surfactin A[29] | 775 637.811 7 |
| neg_1648 | 丁酰苷菌素Butirosin[30] | 55.956 298 83 |
| neg_3751 | 表面活性素Surfactin[11] | 1 088.490 227 |
贝莱斯芽胞杆菌作为拮抗菌株的功能逐渐被研究者认识并分离鉴定，但国内对其研究起步较晚，用于防治花椒根腐病的生防菌种类和数量较少，已有的菌株满足不了人们对生防制剂的需求。目前有李姝江等[31]筛选出的蜡样芽胞杆菌与本团队前期试验中筛选出的绿色木霉和哈茨木霉[32]及贝莱斯芽胞杆菌T-1[30]表现出对花椒根腐病良好的拮抗作用。贝莱斯芽胞杆菌易受环境因素的影响，筛选适宜陇南土壤环境下的优良菌株仍需深入研究。
本研究分离的拮抗菌株W-1鉴定为贝莱斯芽胞杆菌，防效达到89%，其效果优于陈志垚等[33]分离的贝莱斯芽胞杆菌BKS104。另外检测到菌株W-1可产生大量的蛋白酶，蛋白酶是贝莱斯芽胞杆菌产生的主要抑菌蛋白之一。而且菌株W-1产嗜铁素能力极强，嗜铁素作为铁载体，通过和土壤中的病原菌竞争铁而抑制病原体的生长，从而起到降低植物病害的效果。嗜铁素被认为是一种新型生物活性物质，具有开发和利用价值，已在植物病原菌的防治中逐渐应用[34]。
微生物发酵是获得大量次级代谢产物的基础，菌株代谢产物的产率受到不同发酵条件的影响[35]。响应面法优化拮抗菌的发酵条件不仅能够提高菌的发酵浓度，且发酵液中还能产生更多的抑菌活性物质。优化后菌株W-1的发酵浓度OD600值比优化前提高了2.6倍，这为深入挖掘该菌的拮抗作用提供了参考，同时提升了该菌的防控效果。不同菌株其最佳发酵条件存在较大差异。菌株W-1培养的最适pH和温度与多数芽胞杆菌相近，这表明该菌在常规酸碱环境和温度条件下具备良好的生长能力。然而过高的转速不利于菌株W-1的发酵培养，这可能与发酵液中自溶酶的释放速度有关，转速越高释放速度越快，造成菌体自溶[36]。接种量也是影响发酵效率的重要因素之一，菌株W-1优化后发酵的最佳接种量为5%。这与兰成忠等[37]研究的贝莱斯芽胞杆菌FJ17-4的接种量12.5%和黎燕珊等[38]研究的贝莱斯芽胞杆菌HC-8的接种量0.1%的结果差异较大，但与杨可等[39]研究的贝莱斯芽胞杆菌TCS001的接种量是3%结果接近。贝莱斯芽胞杆菌对病原菌具有抑制作用的主要原因是能够合成次级代谢产物，包括脂肽类物质、抑菌蛋白、细菌素和聚酮化合物等[40]。为更好地利用拮抗菌W-1发酵液中产生的次级代谢产物，本研究确定乙酸乙酯为菌株W-1发酵液中抑菌活性物质提取的最佳溶剂，并在乙酸乙酯的提取有机相中检测到多种抑菌活性物质，其中丰度最高的是聚酮类化合物和表面活性素。贝莱斯芽胞杆菌主要是通过分泌聚酮类化合物、脂肽类抗生素和抗菌蛋白等物质发挥抑菌作用[41]。短杆菌肽S、溶菌杆素和环二肽均具有明确的生物活性且对多种农作物病原真菌有抑菌作用[42]。以上研究成果与欧婷等[22]通过LC-MS方法分析获得的贝莱斯芽胞杆菌SWUJ1发酵液中的抑菌活性物质相似，进一步证实了菌株W-1的抑菌能力。
菌株W-1对花椒根腐病病原菌和其他多种植物病原真菌均具有良好的抑制作用，表现出较好的广谱抑菌活性。该菌发酵液的抑菌活性受到pH、温度、紫外照射的影响，在常规条件下稳定性良好，在极端环境下抑菌活性会发生变化，能够适应大田可变的环境条件，具备防治花椒根腐病等土传病害的潜力，也具有潜在开发为生物农药的价值，为花椒根腐病的生物防治提供了新的生物防治资源。在后续研究中仍需深入探讨菌株W-1防治花椒根腐病的抑菌物质及其稳定性，这对研制出功能型、绿色高效微生物农药具有重要指导价值。
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