小麦、玉米和稻谷是我国重要的战略储备粮种，其数量、品质和卫生安全十分重要。研究发现粮食作物在生长和收储期易受各种病原真菌和产毒真菌的侵染，导致粮食减产或真菌毒素污染^[1]。例如，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是小麦及小麦制品中的主要污染毒素，与赤霉病(Fusarium head blight, FHB)的暴发有关，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和串珠镰孢(Fusarium verticillioides)在小麦孕穗期至成熟期感染麦穗会引起FHB，也预示着该地区收获的小麦面临DON毒素超标的风险^[2]。然而镰孢属(Fusarium)引起的病害和毒素污染仅仅代表粮食上少数真菌的特性。粮食上真菌种类繁多，有些物种可以侵染粮食作物引起病害甚至产生真菌毒素污染，还有一些物种对产毒真菌或病原菌具有较强的抑制作用，可作为粮食作物上危害真菌的生物防治剂^[3-4]。

木霉(Trichoderma spp.)是在植物病害生物防治中研究和应用非常广泛的一类生防真菌，普遍存在于土壤、植物种子、叶围等各种环境中，对环境的适应性很强^[5]。研究表明木霉属至少有25个种对病原真菌具有生防作用^[4]，其中一些菌种已经商业化作为生物农药或生物肥料^[6]。目前国内注册登记的木霉生防制剂主要用于果蔬种植且生防效果参差不齐，因此，木霉作为粮食作物病原菌和产毒真菌生防菌剂的开发和应用具有广阔的发展前景。

木霉生防菌剂应用比较广泛的菌株包括非洲哈茨木霉T22、绿色木霉LTR-2、哈茨木霉SH2303和SQR-T-037等，主要用于果蔬的病害防治^[7]。He等^[8]研究了木霉生物防治剂对禾谷镰孢和串珠镰孢引起的玉米茎腐病和穗腐病的防治效果，发现棘孢木霉的生物防治剂能有效抑制玉米茎腐病和穗腐病，在棘孢木霉处理的土壤中生长的玉米茎和穗中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素的积累明显减少。Swain等^[9]研究表明，从树皮中分离的木霉菌株可作为水稻的潜在生物防治剂和生物肥料直接用于水稻种子，能有效控制土传病害的发生并增强水稻种子的发芽率和活力。我国专门针对粮食作物病原菌和产毒真菌生防菌剂开发的研究较少，市面上缺少粮食作物专用的木霉菌生物防治剂，所以有必要寻求更多对粮食作物病原真菌和产毒真菌更有效的木霉菌株加入生物防治的队伍中，为深入探究木霉菌与其他微生物联合作用的抑菌机制、开发用于粮食作物生长过程的复合生防菌剂奠定基础。

本研究采用形态学观察及多基因系统发育分析相结合的方法对粮食籽粒上分离到的木霉菌株进行鉴定，通过木霉菌与粮食籽粒上常见病原真菌及产毒真菌的对峙试验，进行木霉菌生防潜力测定，以期筛选出高效拮抗的木霉菌株，为粮食真菌病害和真菌毒素污染的生物防治提供菌种资源。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究的材料为我国各省粮油质检站及粮库收集到的收获期(从田间收获)及储藏期(粮仓储藏)小麦、稻谷和玉米样品。稻谷样品取自黑龙江、吉林、辽宁、北京、宁夏、四川、重庆、安徽、湖北、湖南、江西、福建和广西这13个地区，共78份样品。小麦样品取自河北、江苏、安徽、山东、河南、山西、内蒙古、湖北、四川、陕西、甘肃和新疆这12个地区，共200份样品。玉米样品取自辽宁和广东，共32份。

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基(g/L)：去皮马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂18.0；玉米粉琼脂(cornmeal dextrose agar, CMD)培养基(g/L)：玉米粉40.0，葡萄糖20.0，琼脂18.0；麦芽提取物琼脂(malt extract agar, MEA)培养基(g/L)：麦芽提取物20.0，琼脂18.0；Nirenberg SNA培养基(g/L)：磷酸二氢钾1.0，硝酸钾1.0，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，葡萄糖0.2，蔗糖0.2，琼脂18.0。

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，宝泰克生物科技公司；2×Taq PCR Mix和DL2000 DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。科研级生物显微镜，Zeiss公司；PCR仪，Biometra公司；凝胶成像分析仪，Bio-Rad公司。

1.2 菌株的分离

选择PDA培养基采用梯度稀释平板法对粮食样品中的真菌进行分离。取25 g粮食样品于225 mL的无菌水中充分振荡洗涤制成浓度为10⁻¹的菌悬液，依次将其稀释成浓度为10⁻²和10⁻³的菌悬液。取1 mL菌悬液于无菌培养皿中，将15–30 mL冷却至50 ℃左右已加50 μg/mL氯霉素的PDA培养基倒入含菌悬浮液的培养皿中。25 ℃培养5–7 d后，待菌落长出后统计菌落数并挑取单菌落边缘转移至新的平板上培养，转接3–4次后获得纯化菌株。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 形态特征鉴定

菌落形态观察基于PDA、CMD、MEA和Nirenberg SNA培养基，在25 ℃培养箱中培养7 d，观察菌落生长速度、生长新区的特征、颜色、结构、质地及其变化，确认培养物的气味等。微观形态特征观察使用科研级生物显微镜，观察分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子的形态特征^[10]。

1.3.2 分子鉴定

使用改良的CTAB法提取所获得纯菌株的基因组DNA。然后对菌株的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)进行PCR扩增和测序，然后将基因序列在GenBank中进行BLAST比对，经比对分析筛选出木霉菌株。然后对初步确认为木霉菌株的聚合酶Ⅱ第二大亚基(RNA polymerase Ⅱ subunit B, rpb2)和翻译延长因子1α (translation elongation factor 1-α, tef1)基因进行PCR扩增和测序。其中ITS扩增选择引物对ITS4/ITS1，rpb2基因扩增选择引物对fRPB2-5f/fRPB2-7cr，tef1基因扩增选择引物对EF1-728F/TEF1LLErev (表 1)^[10]。PCR反应体系(25 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA (50 ng/μL) 1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR引物的信息及PCR反应的循环参数见表 1^[11]。

将获得的全部ITS、rpb2和tef1基因序列进行在线同源比对分析，并根据比对结果从GenBank下载与之相关的参考序列。用MEGA 7软件将全部序列比对并矫正后，用MEGA X软件按ITS-rpb2-tef1的顺序首尾相连，菌株Protocrea farinosa CPK3144作为外群。系统发育分析在RaxML软件中进行，选择GTR-GAMMA模型进行计算，采用最大似然(maximum likelihood, ML)法构建系统发育树，系统发育树的每个分支的统计学显著性分析以自展(bootstrap)进行检验，重复次数为1 000次。Bootstrap > 50%的显示在各个进化分支节点上。

1.4 粮食常见危害真菌的拮抗木霉菌株筛选

1.4.1 粮食危害真菌

本试验室前期开展的粮食真菌多样性研究中获得了大量菌株，完成菌种鉴定后对单菌株进行了保藏。根据前人的研究^[12]，选择粮食上分离的常见病原真菌和产毒真菌共10株开展后续对峙试验。具体菌株包括层出镰孢(F. proliferatum) F26、串珠镰孢(F. verticillioides) N49、禾谷镰孢(F. graminearum) E45、黄曲霉(Aspergillus flavus) S17、黑曲霉(Aspergillus niger) S36、链格孢(Alternaria alternata) E2、粉红单端孢(Trichothecium roseum) E427、澳大利亚弯孢(Curvularia australiensis) H34、新月弯孢(Curvularia lunata) N26和卷枝毛霉(Mucor circinelloides) E781。

1.4.2 对峙试验

采用直径6 mm打孔器在已活化培养7 d的上述10种危害真菌菌株和木霉菌株的菌落边缘打取菌块，在距离PDA平板(直径9 cm)边缘约10 mm相对应的两点上分别接种直径6 mm的危害真菌和木霉菌菌块各1片，置于28 ℃暗培养。在3–11 d时采用十字交叉法测定并记录对峙和非对峙条件下危害真菌的菌落生长半径。每组试验3个重复。

木霉菌抑菌率(%)=[(对照病原菌菌落半径‒对峙培养的病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径]×100。

挑取上述对峙培养条件下木霉菌与危害真菌菌落相交处的菌丝体，在显微镜下观察二者相互作用，用显微镜配套镜头Axio Cam MRc5和Zen软件进行拍照和图片处理，进一步明确木霉菌株对粮食危害真菌的抑制作用机制。

1.4.3 数据统计

利用SPSS 19.0进行数据统计，结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析ANOVA对不同木霉菌株的抑菌率进行差异统计分析，并使用Tukey HSD对方差分析结果进行事后检验。

2 结果与分析 2.1 木霉菌株的形态鉴定

从粮食样品共分离获得35株木霉，根据菌落特征和显微形态特征观察(表 2和图 1、图 2)，结果表明35个木霉菌株属于8个物种，即非洲哈茨木霉(a69、a77、a78、a80、a90、a91、a92、a93、a98、a115、a124、a141、E708、E873、E874、H23)、类棘孢木霉(a67、a102、a103、a104、a105)、T. amoenum (a126)、近深绿木霉(a131)、T. obovatum (E94、E95)、长枝木霉(E105、E106、E356、E357、E475、E473、D612)、东方木霉(E225、E589)和深绿木霉(E339)。

2.2 木霉菌株分子鉴定及系统发育分析

采用基于3个基因片段的多位点系统发育分析方法，对木霉属菌株进行鉴定(图 3)。最终得到的比对数据集包含35个分离菌株和80个标准菌株(图 3)，包括2 091个碱基(ITS为546，rpb2为666，tef1为879，包括比对间隙)，菌株P. farinosa CPK 3144作为外群。最终确认木霉属的35个菌株分别为非洲哈茨木霉、类棘孢木霉、T. amoenum、近深绿木霉、T. obovatum、长枝木霉、东方木霉和深绿木霉。研究相关分离株的基因序列已经全部提交至GenBank数据库，登录号见表 3。

2.3 木霉菌对粮食危害真菌的抑制作用

2.3.1 不同木霉菌对粮食危害真菌的抑菌效果差异比较

选择代表性木霉属菌株，包括：非洲哈茨木霉7株(a69、a80、a91、a98、a124、E874、H23)，类棘孢木霉1株(a67)，T. amoenum 1株(a126)，近深绿木霉1株(a131)，T. obovatum 1株(E95)，长枝木霉3株(E357、E475、D612)，东方木霉1株(E589)和深绿木霉1株(E339)，共16个菌株作为拮抗菌株，与粮食上分离的10个危害真菌菌株(1.3.1)进行对峙试验。培养第11天时，16个分离株抑菌效果的差异比较见表 4，将对每种危害真菌抑制效果前2名的菌株及其抑菌率进行汇总整理，结果见表 5。对危害菌抑菌效果最明显的木霉菌株的平板对峙效果见图 4。分析可知，16株木霉菌对10种粮食危害真菌均有一定的抑制作用，抑菌率为40%–80%，不同物种或同一物种的不同分离株对同一种危害真菌的抑菌能力不同。非洲哈茨木霉的抑菌效果明显优于其他物种。非洲哈茨木霉a91的抑菌效果最好，其对链格孢E2、层出镰孢F26、禾谷镰孢E45、黄曲霉S17、粉红单端孢霉E427和新月弯孢N26的抑菌率均在70%以上，对串珠镰孢N49、黑曲霉S36和澳大利亚弯孢H34的抑菌率也在65%以上。非洲哈茨木霉a98、a124和E874也有较好的抑菌效果，对除卷枝毛霉E781外的9种危害真菌的抑菌率达55%以上。长枝木霉E475和D612对除黑曲霉S36和澳大利亚弯孢H34外的其余8种危害真菌的抑菌率均在55%以上，也有较好的抑菌效果。试验中，近深绿木霉a131对层出镰孢F26和卷枝毛霉E781的抑菌效果优于其他木霉菌株。

2.3.2 木霉菌对危害真菌抑菌效果的显微观察

由上述分析可知，在对峙培养条件下，当木霉菌的菌丝体和危害真菌的菌丝体相互接触时，由于木霉的菌落生长快，很快将危害真菌的菌丝体覆盖，对危害真菌产生抑制或拮抗作用，使危害真菌的生长明显受到抑制。将对峙生长的平板菌落进行显微观察，由图 5A–5D可以观察到危害真菌的菌丝逐步降解为碎片状，图 5E–5G展示了菌丝降解消融的状况，由图 5H–5J可观察到危害真菌的菌丝隔膜处会逐步发生溶解和断裂情况，图 5K–5M可观察到木霉菌菌丝体通过接触危害真菌的菌丝体并对其缠绕，图 5N–5P展示了木霉菌菌丝体穿透危害真菌的菌丝体并在其菌丝内寄生，图 5A、5E、5H为危害真菌菌丝的正常状态。

3 讨论与结论

木霉是植物病害生物防治中研究和应用非常广泛的一类真菌。因其具有良好的抑菌性能，属内已有部分菌种作为生物农药或者生物肥料商业化，广泛应用于植物病原菌的防治^[13]，但它们的广泛应用仍受田间条件下生物因素(目标植物、病原体、宿主范围和区域分布等)和非生物因素(干旱、温度、湿度、化学残留和土壤肥力等)的影响，防治功效受阻碍^[14]。因此，从粮食籽粒上分离适于粮食种植的生防木霉菌，对其在粮食上产毒真菌和病原真菌生物防治方面的应用和推广具有重要意义。

木霉属内不同物种的生防功能与代谢产物都不相同^[15]，在研究木霉菌株生防潜力之前需对其进行准确的分类鉴定，以免造成混淆以及在制剂生产过程中产生不必要的干扰^[16]。根据近几年文献报道，木霉属的物种鉴定通常选择ITS、rpb2和tef1等基因片段，结合数据库已有的标准序列片段进行分析，可区分其种内与种间序列差异，避免部分种的错误鉴定^{[10, 17]}。本研究通过对小麦、稻谷和玉米籽粒上木霉菌进行分离培养，筛选出35株木霉，通过形态学和ITS-rpb2-tef1多基因联合构建系统发育树，对分离株进行鉴定，确定粮食籽粒上分到的木霉菌为8个种。说明木霉菌株可以定殖于粮食籽粒上，但数量较少，并不是优势真菌，这与Pitt等^[18]的报道一致。

国内外大量的研究结果表明，木霉的抑菌作用具有广谱性及多种拮抗机制并存等优势^[19]。本试验同时针对粮食上常见的10种危害真菌(包括产毒真菌和病原真菌)，采用对峙培养法进行拮抗潜力的测定，发现粮食上分离的木霉属菌株对这10种危害真菌均具有抑制作用。由于不同的病原菌菌丝生长能力与产孢时间不同，同一木霉菌株对不同危害真菌的抑菌效果不同，而不同的木霉菌物种或同一物种的不同分离株对于同一种真菌的抑菌效果也不同^[20]。Sharma等^[21]研究了哈茨木霉ThHP-3对4种病原真菌的拮抗机理，发现木霉在与不同宿主相互作用的不同阶段表现出不同的转录组学反应，证实木霉菌株对病原真菌的拮抗作用具有宿主特异性。本次测试的8种木霉中，非洲哈茨木霉和长枝木霉对于粮食上危害真菌的总体抑菌效果较好，抑菌谱广。其中非洲哈茨木霉a91对9种危害菌的抑菌率达到65%以上，而同一菌种不同菌株的抑菌效果存在较大差异，抑菌率相差5%–20%，这与前人的研究结果^[20]一致。分离株获取的粮食籽粒来源不同，生存环境及共生菌群不同，可能会影响菌株的代谢途径，进而影响其抑菌效果。

通过对木霉菌菌丝与危害菌菌丝交界处显微观察发现，有些木霉菌株和危害真菌的菌丝会发生缠绕、穿透入侵的现象，与文献报道中提到的重寄生现象^[22]一致，有些木霉菌株的菌丝会使危害真菌的菌丝发生融断或消解。产生这一现象的原因可能是木霉在代谢过程中产生了抑制病原菌的拮抗性物质，如木霉素、胶霉素、绿木霉素、抗菌肽等，从而造成了危害真菌菌丝的断裂解体^[23]。根据文献报道，非洲哈茨木霉对于多种植物病原菌均具有抑制作用^[24]。Khruengsai等^[25]研究发现非洲哈茨木霉产生的挥发性化合物对尖孢镰孢(F. oxysporum)和层出镰孢具有很强的抗菌活性，我们筛查的抑菌效果最佳的非洲哈茨木霉菌株在显微镜下能观察到明显的菌丝缠绕和菌丝溶解的结构，推测其具有多重抑菌机制，具体哪种机制发挥主要作用还有待进一步研究确定。

本研究发现个别木霉菌株的抑菌效果明显且抑菌谱广，具有开发粮食产毒真菌和病原菌生物防菌剂的潜力。木霉可通过种子处理，或通过菌丝体制剂、分生孢子制剂和厚垣孢子制剂施拌到土壤中，发挥抑制病原菌的作用^[14]。但在实际生产过程中，抑菌效果及以何种抑制机制为主还有待于深入研究。此外，实际生产环境情况复杂，木霉的定殖能力和生存能力会受到影响，其生防效果存在不稳定性，不同木霉菌株的组合或与其他微生物群体构建复合菌群有助于提高菌株目标生防的生存能力和稳定性^[26]，这也是我们今后研究关注的重点问题。木霉绝大多数对人类无害，但有些种类能够感染人类造成木霉病，所以筛选到的木霉菌株的安全性问题也需进行确认^[27]。