2023, Vol. 50扩展功能
文章信息
- 郭南南, 杨传伦, 张心青, 蔡倩倩, 周倩, 张萧萧, 傅英旬, 田杰伟, 马春峰
- GUO Nannan, YANG Chuanlun, ZHANG Xinqing, CAI Qianqian, ZHOU Qian, ZHANG Xiaoxiao, FU Yingxun, TIAN Jiewei, MA Chunfeng
- 苯胺降解菌的筛选、降解特性及其发酵优化
- Screening, degradation characteristics, and fermentation optimization of aniline-degrading strain
- 微生物学通报, 2023, 50(3): 983-996
- Microbiology China, 2023, 50(3): 983-996
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220634
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文章历史
- 收稿日期: 2022-07-08
- 接受日期: 2022-10-17
- 网络首发日期: 2022-12-10
苯胺是农业、制造业、医药用品业、印染业等行业的一种重要的原料与中间体[1-2]。由于苯胺自身的极性，使苯环上的电子密度减弱，从而使苯环的氧化更难。加之其化学性能稳定、生物降解较差、需求量增加等，导致环境中的苯胺持续累积[3]。同时，相关文献报道苯胺能与偶氮苯、硝基苯等物质发生化学反应转化为更为稳定的二次污染物[4-7]，更加重了环境污染现象。苯胺具有生物蓄积性、生物毒性大、致癌、致突变等特点，给人类的身体健康带来很大的威胁[8]。因此，在环境中必须严格控制苯胺的排放。
对苯胺类化合物的处理方法中，相较于物理与化学方法，微生物降解具有成本低、操作简便、处理效果较好及无二次污染的特点[9]，所以该处理方法具有很大的发展潜力[10-14]。目前，研究人员已从环境中分离出能降解苯胺或苯胺衍生物的菌，主要包括芽孢杆菌(Bacillus sp.)[15]、节杆菌(Arthrobar sp.)[16]、食酸丛毛单胞菌(Gomamonas acidovorans)[17]、不动杆菌属(Acinetobacter)[18]、红球菌属(Rhodococcus)[19]、戴尔福特菌属(Delftia)[20]、假单胞菌(Pseudomonas sp.)[21]和希瓦氏菌(Shewanella sp.)[22]等，但其中所涵盖的高效降解菌株并不多，并且只能降解部分苯胺衍生物，底物谱宽的更为稀少。如：Gomamonas acidovorans AN3[17]只能利用苯胺和乙酰苯胺，不能利用其他取代类苯胺；Pseudomonas sp.[23]只能利用苯胺和对氨基苯甲酸，但不能利用其他取代类苯胺化合物。近年来，微生物对苯胺的降解机理与降解相关酶基因的研究也有报道，有研究发现苯胺降解菌中与苯胺降解相关的基因紧密连锁成簇排列[19, 24-25]。微生物降解苯胺的途径主要有好氧降解和厌氧降解两种，即以苯胺为营养基质，在自身特有的降解酶作用下进行生化反应，从中获得生长和代谢所需的能量。
为进一步丰富具有不同降解谱的菌株与基因资源，本研究从长期受苯胺污染的活性污泥中分离具有高效降解苯胺的菌株，并研究其降解特性，采用正交分析法对菌株的发酵进行优化以提高发酵水平，以期为苯胺污染的水体与土壤修复提供材料和方法基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品样品采自山东省滨州市污水处理系统活性污泥。
1.1.2 培养基富集培养基(g/L)：蛋白胨10.0，葡萄糖10.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 1.0，NaCl 5.0，pH 7.0–7.5。无机盐培养基(g/L)[26]：KH2PO4 0.09，K2HPO4 0.22，NaH2PO4 0.26，MgSO4·7H2O 0.23，CaCl2 0.28，FeCl3 0.003，pH 7.0–7.2。选择培养基：上述培养基添加琼脂粉15 g/L，苯胺浓度按需加入，pH 7.0–7.2。种子培养基(g/L)：胰化蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0–7.2。
1.1.3 主要试剂和仪器苯胺，国药集团化学试剂有限公司；快速DNA提取检测试剂盒和多重PCR扩增试剂盒，天根生化科技有限公司。振荡培养箱，上海旻泉仪器有限公司；电热恒温培养箱，上海三发科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；超净工作台，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；光学显微镜，徕卡(Leica)仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 菌种的驯化与筛选取10 mL活性污泥加入90 mL富集培养基中，35 ℃、150 r/min振荡培养2 d。之后以10%的接种量转接再培养，以2–3 d为一个驯化周期，逐步增大苯胺浓度(100、200、400、600、800与1 000 mg/L)。驯化的菌悬液经稀释为不同浓度梯度(10−1、10−2、10−3、10−4、10−5和10−6)后，取100 μL涂布于含500 mg/L与800 mg/L苯胺的选择培养基上。于35 ℃恒温培养箱倒置培养48 h，挑取菌落形态明显不一致的单菌落于相同的平板上分离纯化，获得可耐受高浓度苯胺的单菌落。
1.2.2 分析测定方法将筛选出的对高浓度苯胺不敏感菌株接种至种子培养基中，35 ℃、170 r/min摇床培养至对数生长期(OD600约为0.6)时，以3%的接种量接种至含苯胺的无机盐培养基中进行苯胺降解实验。
1) 苯胺的测定
通过测定实验前后苯胺含量的变化进行苯胺降解能力实验，选择出一株可以高效降解苯胺的菌种。苯胺的浓度测定方法参考文献[27]。苯胺降解率表示菌株对苯胺的降解能力，计算公式为：降解率(%)=(苯胺初始浓度‒苯胺剩余浓度)/苯胺初始浓度×100。
2) 细菌生长的测定
未接种的无机盐培养基作空白对照，采用紫外可见分光光度计测定培养24 h菌液的OD600值，用于间接反映液体培养基中微生物的生长状况。
1.2.3 菌株降解苯胺的性能优化将种子液以3%的接种量接种至含苯胺的无机盐培养基中，通过单因素实验考察不同温度(25、30、35、37、40 ℃)、初始pH (5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、苯胺初始浓度(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg/L)在170 r/min振荡培养24 h条件下降解菌的降解特性，从而获得最适降解条件。
1.2.4 菌株的鉴定1) 形态观察
将分离出的菌株在营养琼脂培养基上进行分离纯化，于35 ℃恒温培养箱倒置培养48 h，观察菌落形态和显微镜下的菌体特征。
2) 分子生物学鉴定
菌株的分子生物学鉴定采用16S rRNA基因进行测序分析，菌株的总DNA提取、16S rRNA基因扩增及序列测定参照文献[28]进行。通过快速DNA提取检测试剂盒提取菌株基因组为模板进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR引物为27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系(25 µL)：27F和1492R引物(20 µmol/L)各0.5 µL，2×PCR Mix 12.5 µL，DNA模板1 µL，ddH2O 10.5 µL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环30次；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至铂尚生物技术(上海)有限公司完成测序。测序结果提交NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov)进行序列比对，选取相似性较高的序列用neighbor-joining法进行分析，采用MEGA 7.0构建系统发育树。
1.2.5 菌株发酵培养基成分优化1) 基础培养基的筛选
将种子液以5%的接种量接种至基础培养基中，37 ℃、170 r/min摇床振荡培养24 h。基础培养基有5种配方。
配方1 (g/L)：葡萄糖10.0，玉米淀粉5.0，豆粕40.0，蛋白胨5.0，硫酸铵5.0，酵母粉5.0，硫酸锰0.4，pH 7.0–7.4。
配方2 (g/L)：葡萄糖15.0，玉米粉20.0，玉米浆干粉10.0，硫酸铵4.0，硫酸锰0.4，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，氯化钙0.2，pH 7.0–7.4。
配方3 (g/L)：葡萄糖10.0，玉米粉15.0，豆粕40.0，氯化铵2.0，硫酸锰0.2，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，氯化钙0.2，pH 7.0–7.4。
配方4 (g/L)：葡萄糖10.0，玉米淀粉15.0，玉米浆干粉5.0，蛋白胨15.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.5，碳酸钙6.0，pH 7.0–7.4。
配方5 (g/L)：葡萄糖15.0，玉米淀粉15.0，豆粕10.0，蛋白胨5.0，硫酸铵1.0，硫酸镁0.5，硫酸锰0.4，磷酸二氢钾0.2，氯化钠0.1，pH 7.0–7.4。
2) 碳源筛选
在筛选出的基础培养液中，分别以1.0%的葡萄糖、蔗糖作为速效碳源，以1.5%的玉米淀粉、玉米粉与可溶性淀粉作为缓效碳源，取代培养液中的碳源进行筛选实验。
3) 氮源筛选
分别以0.3%的蛋白胨、酵母粉作为速效氮源，以2.0%玉米浆干粉、豆粕作为缓效氮源，取代培养液中的氮源进行筛选实验。
4) 四因素三水平试验
以单因素以及先前对菌株培养条件优化的实验为基础，以单因素实验筛选出的最佳碳源和氮源为变异因素，采用四因素三水平正交试验进行培养基优化实验，从中选出菌株发酵液的最佳培养基配比。
2 结果与分析 2.1 降解菌株的筛选和纯化通过污泥样品的驯化培养，共分离纯化出21株能以苯胺为唯一碳源和氮源的细菌。对菌株进行苯胺降解能力验证实验，发现菌株BA-6可在以苯胺为唯一碳源和氮源的无机盐培养基中生长，48 h对苯胺的降解率达到100%，因此选用该菌株做后续研究。
2.2 菌株BA-6的形态和种属鉴定菌株BA-6在营养琼脂培养基上生长为浅黄色菌落，圆形，边缘整齐，有光泽(图 1)。将菌株BA-6的16S rRNA基因序列提交GenBank数据库，序列登录号为OP024282，与NCBI数据库中的相关序列进行比对并构建系统发育树(图 2)。如图 2所示，菌株BA-6与菌株Microbacterium sp.相似性最高，达100%。根据此结果可鉴定菌株BA-6归属于微杆菌属。
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| 图 1 苯胺降解菌BA-6的形态特征 Figure 1 Morphological characteristics of aniline degrading strain BA-6. |
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| 图 2 苯胺降解菌BA-6系统发育树的构建括号中的序号为菌株登录号；节点上的数值是自展值(%)；刻度0.10代表序列差异度 Figure 2 Phylogenetic tree of aniline degrading strain BA-6. Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in GenBank; The value on the node is the self expanding value (%); The scale 0.10 represents the sequence difference. |
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在苯胺500 mg/L、初始pH 7.0条件下，将培养体系置于不同温度培养24 h，菌株BA-6生物量与苯胺的降解情况如图 3A所示。菌株BA-6能在30–37 ℃范围内对苯胺进行高效降解，降解率高达99%以上；在35‒37 ℃时可将苯胺完全降解，效果最佳。温度大于40 ℃或小于30 ℃时，该菌株对苯胺的降解率均有不同程度的下降。这可能是由于低温或高温能够影响酶活性[29]，从而抑制其对苯胺的降解效果。
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| 图 3 不同温度(A)与初始pH (B)对菌株BA-6生长和降解苯胺的影响 Figure 3 The cell growth and biodegradation of aniline by strain BA-6 under different temperatures (A) and initiative pH (B). |
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在苯胺500 mg/L、35 ℃条件下，将培养体系置于不同pH培养24 h，菌株BA-6生物量与苯胺的降解情况如图 3B所示，该菌株能在pH 6.5–7.5范围内对苯胺进行高效降解，降解率高达95%以上；在pH值为7.0–7.5时降解效果最佳，24 h降解率达到100%；当pH值低于6.5或高于8.0时，菌株对苯胺的降解效果较差，其原因可能是pH影响菌株体内酶的催化活性，过酸或过碱的环境会改变细胞表面电位，甚至改变细胞结构[30]，从而影响菌株BA-6对苯胺的降解率。因此，菌株BA-6降解苯胺的最适pH值为7.0–7.5。
2.3.3 不同初始浓度苯胺对菌株BA-6降解率的影响在35 ℃、初始pH 7.5条件下，将培养体系置于不同苯胺浓度培养24 h，测定各体系的剩余苯胺浓度。如图 4所示，当苯胺初始浓度为100–500 mg/L时，菌株BA-6在24 h内可将苯胺完全降解；当苯胺初始浓度为600 mg/L时，24 h降解率可达98%以上；当苯胺初始浓度为1 000 mg/L时，24 h降解率仅为11.0%。随着苯胺浓度的增大，其降解率呈现不同程度的降低，可能原因是随着苯胺浓度的增加，其对菌株生长产生了不同程度的抑制，导致降解率降低。培养至30 h，初始浓度为600、700、800、900和1 000 mg/L的组别降解率分别为100%、100%、65.8%、55.4%和44.4%。培养至48 h，初始浓度为1 000 mg/L的组别降解率为75.3%，其余组剩余苯胺均未检出，降解率达100%。
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| 图 4 菌株BA-6对不同浓度苯胺的24 h降解率 Figure 4 Degradation rates of different concentration of aniline in 24 h by strain BA-6. |
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如图 5所示，在35 ℃、pH 7.5、170 r/min、3%接种量、初始苯胺浓度为580 mg/L的无机盐培养基中，菌株BA-6对苯胺的适应期较短，仅为4 h，菌株生物量在24 h内逐渐增长，20 h时OD600为0.94，降解率已高达93%；当培养24 h后，培养液的OD600为1.0，可将培养液中浓度为580 mg/L的苯胺完全降解。这说明苯胺的降解与菌株生物量成正相关，降解菌的生长量与苯胺残留量的关系对于后续深入研究有着重要的指导意义。
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| 图 5 菌株BA-6的生长量和苯胺残留量随时间变化的关系 Figure 5 The relationship between the biomass of the strain BA-6 and the residual of aniline. |
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在无机盐培养基中170 r/min振荡培养48 h后，通过测定苯胺类化合物含量判断菌株利用底物的能力，菌株BA-6利用不同底物的情况如表 1所示。菌株BA-6能利用300 mg/L的苯胺、邻甲基苯胺、2, 3-二甲基苯胺、邻甲氧基苯胺、对甲氧基苯胺、对乙氧基苯胺、邻氟苯胺、间甲苯胺和2, 4-二甲基苯胺为唯一的碳源、氮源与能源，但难利用对甲苯胺。
| 底物 Substrate |
利用情况 Utilization |
| 苯胺Aniline | ++ |
| 邻氟苯胺2-fluoroaniline | + |
| 间甲苯胺m-toluidine | + |
| 对甲苯胺p-toluidine | – |
| 邻甲基苯胺o-toluidine | + |
| 邻甲氧基苯胺o-anisidine | + |
| 对甲氧基苯胺p-anisidine | + |
| 对乙氧基苯胺4-ethoxyaniline | ++ |
| 2, 3-二甲基苯胺2, 3-dimethylaniline | ++ |
| 2, 4-二甲基苯胺2, 4-dimethylaniline | + |
| ++：很好利用(降解率60%以上)；+：可以利用(降解率10%–60%)；–：难利用(降解率低于10%) ++: Well used (degradation rate above 60%); +: Can be used (degradation rate 10%–60%); –: Difficult to use (degradation rate less than 10%). |
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选择5个配方进行菌株BA-6基础培养基的筛选，种子液接种量为5%，在37 ℃、170 r/min条件下培养24 h。由图 6可知，通过检测各配方发酵液的菌量，最佳基础培养基为配方5，24 h菌量可达到1.46×1010 CFU/mL。因此，后期在此配方的基础上进一步优化配方，即基础配方确定为配方5 (g/L)：葡萄糖15.0，玉米淀粉15.0，豆粕10.0，蛋白胨5.0，硫酸铵1.0，硫酸镁0.5，硫酸锰0.4，磷酸二氢钾0.2，氯化钠0.1，pH 7.0–7.4。
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| 图 6 菌株BA-6基础配方筛选的结果 Figure 6 The results of the basic formula screening of strain BA-6. |
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根据前期筛选出的最佳基础培养基，分别以葡萄糖、蔗糖作为速效碳源，以玉米淀粉、玉米粉与可溶性淀粉作为缓效碳源进行筛选实验，其余培养基组分不变，培养24 h后对发酵液进行稀释涂布计数，确定最佳碳源。图 7A结果表明，碳源为葡萄糖与玉米淀粉时菌量最高，即最佳碳源为葡萄糖与玉米淀粉。
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| 图 7 菌株BA-6碳、氮源单因素试验 Figure 7 Carbon and nitrogen source single factor experiment of strain BA-6. A：菌株BA-6碳源单因素试验. B：菌株BA-6氮源单因素试验 A: Carbon source single factor experiment of strain BA-6. B: Nitrogen source single factor experiment of strain BA-6. |
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根据前期筛选出的最佳基础培养基，分别以蛋白胨、酵母粉作为速效氮源，以玉米浆干粉、豆粕作为缓效氮源进行筛选实验，其余培养基组分不变，培养24 h后对发酵液进行稀释涂布计数，确定最佳氮源。图 7B结果表明，氮源为豆粕与酵母粉时菌量最高，即最佳氮源为豆粕与酵母粉。
2.5.4 正交试验菌量测定按四因素三水平正交方法及菌量的测定进行试验，运用正交分析方法对结果进行分析。如表 2可以看出，各因素影响的主次顺序为：A > C > D > B，即葡萄糖 > 豆粕 > 酵母粉 > 玉米淀粉；菌量最高的水平组合为：A1B2C2D2，即确定最佳发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖10.0，玉米淀粉12.0，豆粕20.0，酵母粉4.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.2，硫酸锰0.4，氯化钠0.1，硫酸铵1.0，pH 7.0–7.4。通过菌株BA-6的发酵优化实验，获得了该菌株的最佳发酵培养基配方，经过摇瓶24 h发酵，活菌量高达3.06×1010 CFU/mL，极大地满足了工业化发酵生产的需求。
| 组别 Group |
A葡萄糖 A Glucose (%) |
B玉米淀粉 B Corn starch (%) |
C豆粕 C Soybean meal (%) |
D酵母粉 D Yeast powder (%) |
菌量 (×1010 CFU/mL) |
| 1 | 1 (1.0) | 1 (1.0) | 1 (1.0) | 1 (0.2) | 1.68 |
| 2 | 1 | 2 (1.2) | 2 (2.0) | 2 (0.4) | 3.06 |
| 3 | 1 | 3 (1.5) | 3 (3.0) | 3 (0.6) | 2.71 |
| 4 | 2 (1.5) | 1 | 2 | 3 | 2.66 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 2.06 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 2.29 |
| 7 | 3 (2.0) | 1 | 3 | 2 | 1.05 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 0.95 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0.98 |
| 均值1 Average 1 | 248 | 180 | 164 | 157 | |
| 均值2 Average 2 | 234 | 202 | 223 | 213 | |
| 均值3 Average 3 | 99 | 199 | 194 | 211 | |
| 极差Range | 149 | 23 | 59 | 56 |
本研究从长期受苯胺污染的污泥中成功分离出一株苯胺降解菌BA-6，其可以利用苯胺作为唯一的碳源、氮源与能源，该菌株对600 mg/L的苯胺日降解率达98%以上，对500 mg/L以下的苯胺日降解率达100%，经鉴定为Microbacterium sp.。现有研究表明，Microbacterium sp.具有较强的代谢活性，在生物修复污染环境方面具有较为突出的应用价值，如Microbacterium sp.可不同程度地降解对硝基苯胺[31]、赤霉烯酮[32]、邻苯二甲酸二丁酯[33]、磺胺类抗生素[34]等。但有关Microbacterium sp.在生物修复受苯胺类化合物污染环境方面的研究鲜有报道。近年来，研究者从环境中分离筛选到不同种类的苯胺降解菌，李大卉[35]从长期受苯胺污染土壤中分离到一株Rhodococcus sp.，在48 h时可将500 mg/L苯胺几乎完全降解。Liu等[36]从活性污泥中分离出一株能够使用苯胺或乙酰苯胺作为唯一碳、氮和能量来源的细菌Delftia sp. AN3，能够在苯胺浓度高达5 000 mg/L的条件下生长，培养7 d后可完全去除。Jiang等[37]报道了一株假单胞菌JA1，该菌在最佳条件下(pH 7.0, 25 ℃)，24 h可将800 mg/L的苯胺几乎完全降解。菌株Dietzia natronolimnaea JQ-AN在含有乙酸钠的培养基中培养120 h，可将300 mg/L的苯胺降解87%[38]。Erwinia sp. HSA6在24 h下可将500 mg/L苯胺完全降解[39]。综上所述，国内外已分离出来能够降解苯胺的菌株不在少数，而且降解特性各有不同。与以往报道的苯胺降解菌不同，本研究分离的菌株Microbacterium sp. BA-6将成为环境治理与修复中降解苯胺的新资源，具有一定的研究开发与应用潜力。
本研究分离筛选出的苯胺降解菌BA-6，其高效降解的温度范围是30–37 ℃，高效降解pH值范围是6.5–7.5，降解率95%以上，表明菌株BA-6有较强的环境调节能力，对温度、pH有较广泛的适应范围，显示出较好的环境生存能力及对污染环境的清除能力，具有较好的生物修复潜力。相较于刁刻等[20]、李大卉[35]与Li等[39]的研究结果，菌株BA-6对苯胺的降解效果更为高效。与Jin等[38]、张逸飞等[40]的研究结果相比，菌株BA-6可以苯胺作为唯一的碳氮源，对氮源的选择无较多要求。另外，实际应用中常常是多种有机污染物共存，因此，考察菌株BA-6对各种取代苯胺类化合物的降解能力就显得尤为重要。虽然对于菌株利用苯胺类化合物已有很多报道，但是大多数菌只能利用范围较窄的底物，如李云翔等[19]筛选出的红球菌属(Rhodococcus sp.)能利用苯胺、邻甲基苯胺、对甲基苯胺和2, 5-二氯苯胺，不能利用间甲基苯胺、2, 4-二甲基苯胺；Fujii等[41]的研究表明，Acinetobacter sp. YAA能利用苯胺和邻甲基苯胺，不能利用间甲基苯胺和对甲基苯胺；Fukumori等[42]与Liang等[43]的研究表明，Pseudomonas putida UCC22与Delftia tsuruhatensis AD9只能利用苯胺、间甲基苯胺和对甲基苯胺，不能利用邻甲基苯胺。然而本研究底物广谱性利用实验表明，菌株BA-6的底物谱相对较宽，除了苯胺还能利用邻甲基苯胺、2, 3-二甲基苯胺、邻甲氧基苯胺、对甲氧基苯胺、对乙氧基苯胺、邻氟苯胺、间甲苯胺和2, 4-二甲基苯胺，但难利用对甲苯胺，相关研究证实了这几种苯胺降解菌的底物谱不同，暗示菌株中负责降解苯胺的基因簇可能有不同程度的差异，从而导致菌株降解苯胺具有不同的分子机制。本研究为环境中苯胺的去除提供了优良菌种，丰富了苯胺降解菌的底物降解谱，后续可以继续研究其降解基因，或可通过遗传工程手段改良苯胺降解菌。
同时，本研究对苯胺降解菌BA-6的发酵培养基进行优化设计，以获得更高的发酵水平。有文献指出微生物的接种量对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要的作用[44]。强婧等[45]研究表明，在降解过程中，降解率受菌体投加量的影响较大，但投菌量达到一定量时降解率比较接近。李静等[46]指出接种量对底物降解率的影响较少，而对菌体生长量的变化影响较大。接种量过低时，菌体生物量增长较慢导致其底物降解率不高；接种量过高时，由于体系中菌体大量增殖导致溶解氧消耗过快，使菌体较早进入衰退期，影响底物降解。最佳接种量的选择则综合考虑菌体生长及对底物的降解情况而定。陈涛等[47]研究认为，微生物接种量越大越有利于底物降解，底物的残留率随着接种量的增大而减小。因此，对不同菌种而言，接种量与菌种的降解率呈现不一样的关系，但研究者一致认为，微生物接种量应达到一定的量才能更好地发挥降解性能，这也说明降解菌的发酵水平对污水处理行业起着重要的影响。本研究通过单因素和正交试验对培养基组分进行了优化，获得一种最优发酵配方，其活菌量达到3.06×1010 CFU/mL。此优化的发酵培养基为今后苯胺降解菌剂的开发利用奠定了基础，可大大节约生产成本，为其工业化应用提供了研究基础。
综上所述，本研究筛选的菌株BA-6为环境中苯胺的去除提供优良菌种，具有高效降解苯胺的能力，对600 mg/L的苯胺24 h降解率达98%以上，其高效降解的温度范围是30–37 ℃，pH值范围是6.5–7.5，降解率达95%以上。该菌株的底物降解谱较广，可利用多种苯胺类化合物，丰富了苯胺降解菌的底物降解谱。同时通过发酵培养基优化获得了高活菌量配方，在一定程度上为苯胺降解菌的工业化应用奠定了基础。
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