据统计，2020年塑料制品的年产量大约3.35亿t，由于以石油为原料合成的传统石化塑料制品的大量使用，对环境造成极大的污染^[1]。这种传统塑料制品是以聚丙烯为主要原料合成的，其在自然环境下很难自发降解为单体形式，通过紫外线照射仅能缓慢分解为小于5 mm的塑料微粒及纤维；而塑料微粒会进入土壤深层，影响土壤环境，导致农作物减产；同时还会漂泊到海洋、河流、湖泊等，微塑料无处不在，而且其危害不可见^[2]。据报道，在中国南海北部的浮游动物中检测到塑料微粒^[3]；而且塑料微粒可以被陆生植物吸收，并影响植物的正常生长^[4]；在人的粪便中也检测到了塑料微粒，其可以通过肺或小肠进入血液、淋巴系统和内脏，导致血栓、肺功能损伤、破坏免疫系统和消化系统，影响人类健康^[5]。传统塑料给人类带来了极大的污染和危害，寻找可降解的塑料原材料是解决日益严重的环境污染问题的重要途径。

目前，人们关注比较多的可降解塑料原料有聚乳酸(poly lactic acid, PLA)、聚丁二酸丁二醇酯(poly butylene succinate, PBS)和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)。PLA是以植物淀粉为底物转化成乳酸聚合而成的一种聚酯，PLA作为可降解原料具有良好的物理特性，可广泛应用于多个行业，如包装行业、医疗等。目前，PLA的不足是其必须以植物淀粉为底物合成，大大限制了PLA的生产^[6]。PBS因其具有力学性能和耐热性，在包装材料、农用材料及生物医学材料行业也可以广泛使用，尤其是PBS具有优良的生物可降解性，能够在自然环境下完全降解，因此，PBS作为传统塑料的替代品，是人们十分关注的原料。但是，PBS的加工主要以石油为主。PHA是一种由微生物细胞内产生的生物聚酯，具有突出的生物相容性和生物降解性，近年来受到人们的广泛关注^[7]。由于PHA由微生物合成，利用生物工程工业化生产，可以降低可降解原料的生产成本。因此，PHA是人们关注的替代传统塑料最理想的可降解塑料原料^[8]。

PHA是细菌体内产生的一种天然生物聚酯，是在碳源过量而氮、磷、硫、镁等元素不足的不平衡条件下产生的。PHA因其单体的分子结构和链长的不同，根据碳原子数量可将PHA分为2类：短链-PHA (scl-PHA)由3−5个碳原子构成；中长链-PHA (mcl-PHA)由6−14个碳原子构成。合成PHA的关键酶是PHA合酶(PhaC)，PHA合酶可根据一级结构和亚基组成分为4类：I型PHA合酶，由60−65 kDa的PhaC单亚基组成，主要催化形成C3−C5的scl-PHA，含有I型PHA合酶的代表性菌株有真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)；Ⅱ型PHA合酶，由60 kDa左右的PhaC单亚基组成，主要催化形成C6−C14的mcl-PHA，常见于假单胞菌属(Pseudomonas)，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；Ⅲ型PHA合酶由PhaC和PhaE两种亚基组成，其中PhaC的分子量为40−53 kDa，PhaE为20−40 kDa，主要催化形成scl-PHA，常见于光合细菌，如紫色硫细菌(purple sulfur bacteria)；Ⅳ型PHA合酶由PhaC和PhaR两种亚基组成，其中PhaC的分子量约为41 kDa，PhaR约为22 kDa，类似于由PhaE和PhaC亚基组成的Ⅲ型PhaC，主要催化合成scl-PHA，常见于芽孢杆菌属(Bacillus)中，如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)^[9]。Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型PHA合酶均对催化形成scl-PHA具有高度专一性，它们的主要区别在于PHA合酶的大小不同，其活性中心的结合位点不同，可以存在于不同的微生物中合成PHA。PHA不仅具有优异的生物相容性和生物降解性等生物学特性，同时具有疏水性、旋光性和热塑性，对人和自然无毒，最终可被自然界中的微生物降解为二氧化碳和水^[7]。据报道，目前发现的自然界中可合成PHA的微生物有60多个属，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属、固氮菌属和根瘤菌属等^[10]。但合成PHA含量较高的只有产碱杆菌属和假单胞菌属等少数微生物^[11]。因此，工业上使用这些菌种以合成聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)、聚羟基丁酸和戊酸的共聚物(poly-β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate, PHBV)和聚羟基己酸酯(polyhydroxyhexanorate, PHHX)，目前国内采用传统微生物发酵法，用真氧产碱杆菌合成PHA，年产量达1 000 t^[12]。同样地，国外学者也做了很多努力实现了PHA的工业化，利用真氧产碱杆菌通过微生物发酵生产PHA^[12]。尽管PHA已经实现半工业化，但是由于其发酵工艺烦琐、使用菌株的底物转化率较低，导致PHA的生产成本较高，难以广泛推广^[13]。

PHA的工业化还存在很多问题，针对这些问题，人们从多方面尝试解决。利用基因工程手段对现有菌株的代谢途径进行改造，如敲除与PHA合成无关的次代谢通路，提高PHA的代谢通量；另外，可以尝试改变细胞形态及大小，使细胞内积累更多的PHA。筛选相对极端环境下的PHA合成菌，如清华大学的研究团队从新疆咸水湖寻找到2株高度耐盐菌，并对其生长速度和适应性进行改造，由于菌株能适应高盐环境，提高发酵环境的盐浓度后，这种菌在发酵过程中不易染菌、下游提纯工艺简便^[14]。

综上所述，从极端环境筛选新的PHA合成菌并提高PHA的产量是非常有效的方式。因此，本研究从宁夏回族自治区银川市盐碱地的沉积物分离筛选新的能够合成PHA的菌种，为盐碱地生态系统中微生物的挖掘利用奠定基础，同时为合成PHA的微生物菌种资源积累数据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品

样品于2021年2月25日采集自宁夏回族自治区银川市金凤区农场(38°33′05.80″N, 106°13′43.71″E)盐碱地垃圾沉积物；所采集的样品为表层0−15 cm处的沉积物，采用一次性无菌自封袋带回实验室，于4 ℃保存。

1.1.2 培养基

筛选培养基(g/L)：LB培养基补充2%葡萄糖，尼罗蓝溶液使用浓度参考文献[15]；发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，氯化钠10.0，葡萄糖20.0，七水硫酸镁1.0，磷酸氢二钾1.0，磷酸二氢钾1.0，pH 7.0。

1.1.3 主要试剂和仪器

尼罗红、胰蛋白胨、酵母浸粉等生化试剂，北京索莱宝科技有限公司；尼罗蓝，生工生物工程(上海)股份有限公司；LA Taq酶，宝日医生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；所有引物由安徽通用生物公司合成。PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；气相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 菌株的筛选

称取5 g所采集的垃圾沉积物加入50 mL发酵培养基，充分振荡混匀，35 ℃、180 r/min富集培养6−8 h。吸取1 mL富集培养液稀释至10⁻²、10⁻³、10⁻⁴和10⁻⁵，分别均匀涂布于尼罗蓝筛选培养基，35 ℃恒温培养箱中培养，间隔24 h在365 nm紫外灯下观察，挑取淡蓝色菌落或者黄绿色菌落进一步分离纯化保存^[16]。

1.3 PhaC的扩增

由于革兰氏阳性细菌和阴性细菌无通用的PhaC基因引物，因此使用3对引物。第1对引物针对Ⅰ型PhaC (F: 5′-CCYRGATCAACAAG TTCTAC-3′; R: 5′-TTCCAGAACAGMAGGTCG AAGG-3′)；第2对引物针对Ⅱ型PhaC使用假单胞菌属特异性引物(F: 5′-TAGCATATGAGTGA CAAGAACAAAGAAGAC-3′; R: 5′-CAAGGAT CCGAAACTCAGCGTTCGTGC-3′)；第3对引物针对芽孢菌属的Ⅳ型PhaC (F: 5′-CGTGCAA GAGTGGGAAAAAT-3′; R: 5′-TCGCAATATGA TCACGGCTA-3′)。提取NP-2基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：LA Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，10×LA Taq buffer 5 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 8 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL，模板(1 ng/μL) 1 μL，ddH₂O补足50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 105 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，有条带即为PhaC基因阳性菌株，将阳性产物送华大基因公司测序，测序结果通过NCBI数据库进行相似度比对，并用MEGA 6.0构建系统发育树^[17-19]。

1.4 菌株的鉴定

PCR模板制备和体系同1.3，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TCGCAATATGAT CACGGCTA-3′)^[20]，PCR反应体系：LA Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，10×LA Taq buffer 5 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 8 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL，模板(1 ng/μL) 1 μL，ddH₂O补足50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用产物回收试剂盒将产物纯化后送华大基因公司测序。比对测序结果与NCBI模式菌株序列的差异，并用MEGA 6.0构建系统发育树^[21]。

1.5 PHA定量分析

1.5.1 尼罗红染色法测定PHA含量

尼罗红分子内含有恶嗪环，呈碱性，能够进入细胞特异性识别PHA，可以作为PHA积累阶段快速估计PHA含量的工具^[22]。用DMSO溶解尼罗红固体至浓度为80 μg/mL，染色步骤为：取1 mL培养2 d的菌液，12 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，用ddH₂O涡旋；加入50 μL尼罗红染色液，室温染色30 min；12 000 r/min离心5 min，弃上清；用ddH₂O重悬，重复1次；加入1 mL ddH₂O，酶标仪测定535 nm荧光强度。以PHA标准品作对照，计算PHA含量。

1.5.2 气相色谱法(GC-MS)测定PHA含量

将NP-2菌液按5%的接种量接种发酵培养基在35 ℃、160 r/min条件下培养48 h，12 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，用ddH₂O洗涤2次后冻干，记录菌体干重。

将冻干后的菌体充分研磨，准确称取菌体1 mg，加入氯仿0.1 mL、甲醇0.07 mL、浓硫酸0.03 mL，100 ℃反应4 h，冷却至室温后加入0.2 mL去离子水，涡旋混匀后静置分层，取下层氯仿相加足量无水硫酸镁充分干燥，吸取氯仿相，使用0.22 μm针式过滤器过滤后进行气相检测。进样量1 μL，分流比5:1，载气为氮气，流速为5 mL/min，进样口温度180 ℃，柱温：80 ℃维持1 min，20 ℃/min升温至110 ℃维持15 min，以PHA标准品作对照^[23]。

1.6 菌株合成PHA的发酵条件研究

1.6.1 温度对PHA积累量的影响

在100 mL三角瓶中加入50 mL发酵培养基(pH 7.0)，再加入2.5 mL的NP-2菌液，设定温度分别为25、30、35和40 ℃，在摇床中180 r/min培养48 h，使用气相色谱法对PHA含量进行测定，并记录细胞干重。每个实验组设3个重复。

1.6.2 pH对PHA积累量的影响

发酵培养基使用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节pH值分别为6.5、7.0、7.5和8.0，50 mL的发酵培养基中加入2.5 mL的NP-2菌液，以1.6.1得到的最适培养温度、180 r/min振荡培养48 h，测定细胞干重和PHA含量。每个实验组设3个重复。

1.6.3 摇床转速对PHA积累量的影响

取1.6.2最优pH的发酵培养基50 mL，加入2.5 mL的NP-2菌液，设定摇床转速分别为140、160、180和200 r/min，在最适培养温度下培养48 h，测定细胞干重和PHA含量。每个实验组设3个重复。

1.6.4 接种量对PHA积累量的影响

在1.6.1–1.6.3获得的优化后培养条件下，取发酵培养基50 mL，接种量分别设定为1%、5%、10%和15%，在30 ℃、180 r/min条件下培养48 h，测定细胞干重和PHA含量。每个实验组设3个重复。

2 结果与分析 2.1 菌株的筛选结果

为了筛选PHA合成菌，从宁夏回族自治区银川市盐碱地采集的垃圾沉积物经富集、稀释处理，并将其涂于尼罗蓝筛选平板上培养48 h，在365 nm紫外光下进行观察，有菌落发出黄绿色荧光(图 1)，表明此菌株细胞内积累了PHA。

在PHA合成过程中的关键酶是PhaC，研究者通常通过PCR扩增PhaC来鉴定PHA合成菌。为进一步验证尼罗蓝平板法初步筛选的菌株为PHA合成菌，提取该菌株的DNA为模板，用设计的特异性引物PCR扩增PhaC，使用琼脂糖凝胶电泳检测，在1 700 bp左右观察到单一条带。PCR产物经测序后，使用NCBI数据库对该序列进行相似度分析，使用MEGA 6.0软件的邻近法构建系统发育树(图 2)。将PhaC的序列提交至NCBI数据库，登录号为OP169011。菌株NP-2与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，登录号为WP_214913708.1)处在同一分支，同时将NP-2的PhaC与Pseudomonas fluorescens的PhaC氨基酸序列进行比较(图 3)，发现菌株NP-2的PhaC属于Ⅱ型PhaC。

2.2 菌株的鉴定结果

通过16S rRNA基因的方法对2.1中筛选到的PHA合成阳性菌进行鉴定，以该菌株的DNA为模板，用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测观察到1 500 bp左右有单一条带，与预期的16S rRNA基因片段大小相符。经测序后，将基因序列与NCBI数据库的模式菌株进行BLAST比较分析，用MEGA 6.0构建系统发育树(图 4)，该序列已提交至NCBI数据库，登录号为OP164160。由图 4可知，所筛选菌株与Pseudomonas brassicacearum的相似度最高，且处在同一分支，可以确定该菌为Pseudomonas brassicacearum，并将此菌株命名为NP-2。

2.3 PHA定量分析结果

2.3.1 尼罗红染色技术分析PHA含量

尼罗红染料能够进入细胞内与PHA特异性结合，常用于PHA的定量分析，荧光强度越高，PHA含量越高，颜色的深浅与PHA含量成正比。用发酵培养基摇床培养菌株NP-2，在24、48、72和96 h分别取发酵液，离心收集菌体沉淀、重悬，用尼罗红染色液检测细胞内PHA的积累量，发现不同时间收集的NP-2菌体都能够被尼罗红染色呈红色(图 5A)，说明NP-2能够积累PHA。根据荧光强度量化产生的PHA，通过测定在波长535 nm的荧光强度，该菌株NP-2在48 h时产生的PHA含量最高，为0.404 mg/mL (图 5B)。

2.3.2 GC-MS分析PHA含量

为了进一步准确测定菌株NP-2细胞内PHA的积累量，收集NP-2发酵液的菌体沉淀，以PHA标准品为对照，通过GC-MS分析，菌株NP-2保留时间为4.5 min (图 6)，与PHA标准品一致，证明该菌株NP-2确实产生了PHA，积累量为0.68 mg/mL。

2.4 菌株合成PHA的发酵条件

将纯化后的PHA合成菌NP-2接种到发酵培养基中培养48 h，使用气相色谱法对PHA含量进行测定。以温度为变量的培养实验结果如图 7所示。在30 ℃和35 ℃时NP-2的生长状态较好，在30 ℃时PHA积累量最高，达到3.6 mg/mL，明显高于25 ℃和40 ℃条件下NP-2的PHA积累能力。不同培养温度下PHA的显著性差异表明了温度对NP-2在25 ℃ (P < 0.001)和40 ℃ (P < 0.001)下PHA的积累有着显著性影响，说明NP-2在温度为30–35 ℃的范围内具有较高PHA积累潜力。

以pH为变量的培养试验结果如图 8所示，在不同pH的培养条件下，菌株NP-2的PHA积累能力存在显著的差异。PHA积累量最高的是pH 7.0的培养条件，达到3.4 mg/mL。pH 6.5的条件下NP-2的生长和PHA积累量处于pH 7.5‒8.0之间，数据显著性分析结果(P > 0.05)显示pH值在6.5、7.5和8.0时PHA积累能力不具有显著性影响。在pH 8.0的条件下NP-2的生长和PHA积累量最低，与pH 7.0 (P < 0.001)和7.5 (P < 0.001)时存在显著差异，这一结果说明pH对于NP-2积累PHA的能力具有显著影响。

以摇床转速为变量的培养试验结果如图 9所示，在不同转速的培养条件下，转速180 r/min的培养条件PHA积累量最高，达到3.3 mg/mL。除了在转速140 r/min和转速180 r/min之间(P < 0.05) PHA积累量有着显著性差异，在转速为160 r/min和200 r/min时与180 r/min相比较，数据显著性分析结果(P > 0.05)显示差异不显著。这一结果说明菌株NP-2在转速180 r/min时具有较高合成PHA的潜力。

以接种量为变量的培养试验结果如图 10所示，在不同接种量的培养条件下，5%接种量的培养条件PHA积累量最高，达到4.1 mg/mL。在10%和15%接种量的培养条件下，PHA积累量相近，显著性检测结果(P > 0.05)显示接种量在10%和15%对PHA积累能力不具有显著性影响。在1%接种量条件下PHA积累量最低，与5%接种量(P < 0.001)存在显著性差异，说明NP-2在5%接种量的培养条件下具有较高合成PHA的能力。

经单因素发酵条件优化，在温度为30 ℃、pH为7.0、转速为180 r/min、接种量为5%的条件下，菌株NP-2的PHA积累量为3.78 mg/mL (图 11)，说明温度和pH对Pseudomonas brassicacearum中PHA合成量有直接影响。之前已报道Pseudomonas putida以甘油为底物，通过添加前体物质辛酸钠，PHA的平均产量为4.56 g/L^[24]；从生物柴油污染的沉积物中分离纯化的Pseudomonas mendocina经条件优化后在35 ℃下PHA积累量为2.6 g/L^[25]。从废水样品中分离纯化的Bacillus以葡萄糖为碳源，PHA积累量为3.09 g/L^[26]。与上述研究结果相比，Pseudomonas brassicacearum合成PHA具有一定潜力。

3 讨论与结论

由于正在广泛使用的石油基塑料是环境污染的主要原因，为了彻底改善环境污染问题，PHA因其独特的生物可降解性而在世界范围内备受关注。然而，目前PHA的低产量是制约PHA实现工业化生产的主要原因，所以从极端环境筛选PHA合成菌成为一种趋势。近期，Ling等^[27]从干旱、盐度较大的新疆咸水湖寻找到一株耐盐菌并对其进行改造，使其在开放式条件下能够利用淡水进行发酵合成PHA，大大降低了PHA的生产成本。本试验从宁夏回族自治区银川市盐碱地采集垃圾沉积物，通过尼罗蓝平板分离筛选得到一株能够合成PHA的菌株NP-2，对菌株NP-2通过分子生物学方法鉴定为Pseudomonas brassicacearum。在分子水平推测了Pseudomonas brassicacearum具有合成PHA的潜力，而且假单胞菌属具有良好的生长速率和细胞中PHA含量较高的特点，是实现低成本合成PHA的潜在微生物。

在发酵条件优化实验中，以温度为变量的实验中观察到，不同温度对NP-2的生长和PHA积累水平有着显著影响。NP-2高效积累PHA的温度区间为30–35 ℃，其中30 ℃为PHA积累的最佳温度。在之前的研究中，一株Pseudomonas putida在28 ℃具有较高的PHA积累能力^[28]，地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)和皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)在30 ℃对PHA积累具有较好的效果^[29]。

以pH为变量的实验中观察到，pH对NP-2的生长和PHA积累水平有着显著影响。pH的变化对菌体生长、繁殖及产物积累影响重大，同时不同微生物的最适pH不同，NP-2高效积累PHA的pH值为7.0。在王海飙^[30]的研究中，一株嗜盐单胞菌(Halomonas)在偏碱性的条件下才能积累PHA，而PHA积累最适pH值为9.0。顾进进^[31]的研究中，pH 8.0是芽孢杆菌(Bacillus sp.) PHA积累的最适pH。李庆辉^[32]的报道中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)积累PHA的最适pH值为7.0，与本文研究的Pseudomonas. brassicacearum积累PHA的最适pH一致。

以摇床转速为变量的实验中观察到，菌株NP-2在摇床转速160、180和200 r/min的实验组中PHA积累量相近，显著性检测结果(P > 0.05)显示这几组摇床转速对NP-2积累PHA的能力不具有显著性影响。造成这一现象的原因可能与发酵液中溶解氧的大小有关，在发酵过程中摇床转速越快，溶解氧的溶解速度越快，菌株NP-2的生长和PHA积累水平在摇床转速为160、180、200 r/min时不受较大影响，说明该菌株对于氧浓度的变化有一定的适应性^[28]。

以接种量为变量的实验中观察到，5%接种量的培养条件下PHA积累量最高，在1%与5%接种量时PHA积累量存在显著性差异，导致这一结果的原因可能是1%的接种量相对较小，在48 h时尚未达到PHA积累的对数期；而在10%和15%接种量的培养条件下，PHA积累量与5%接种量相比有所下降，这可能是因为接种量增加导致发酵液溶氧不足，影响菌株生长及PHA合成^[33]。

综上所述，本研究通过对菌株NP-2积累PHA的发酵条件进行探究。实验结果显示，该菌株在温度为30 ℃、pH值为7.0、转速为180 r/min、接种量为5%的条件下，PHA积累量达到3.78 mg/mL，结果表明该菌株具有较高的PHA积累和环境适应能力。因此，进一步利用基因工程技术在菌株遗传和代谢调控等基因重组方面深入探究假单胞菌属合成产量更高、具有更优性能的PHA是目前研究的主要方面^[34]。本研究在盐碱地土壤垃圾沉积物中分离筛选合成PHA的细菌属于假单胞菌属，具有PhaC和产生PHA的能力，为进一步发掘利用盐碱地环境中的微生物菌种和培养获得高产PHA菌株积累了数据。