2023, Vol. 50
表1(Table 1)
一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析
扩展功能
文章信息
- 陈小红, 王靖芳, 郑欣萍, 林海清, 洪燕萍, 林标声
- CHEN Xiaohong, WANG Jingfang, ZHENG Xinping, LIN Haiqing, HONG Yanping, LIN Biaosheng
- 一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析
- Isolation, identification, gene composition, and fermentation characterization of a Eurotium cristatum strain
- 微生物学通报, 2023, 50(12): 5376-5391
- Microbiology China, 2023, 50(12): 5376-5391
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230405
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文章历史
- 收稿日期: 2023-05-20
- 接受日期: 2023-07-17
- 网络首发日期: 2023-09-05
陈小红, 王靖芳, 郑欣萍, 林海清, 洪燕萍, 林标声. 一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析[J]. 微生物学通报, 2023, 50(12): 5376-5391.
CHEN Xiaohong, WANG Jingfang, ZHENG Xinping, LIN Haiqing, HONG Yanping, LIN Biaosheng. Isolation, identification, gene composition, and fermentation characterization of a Eurotium cristatum strain[J]. Microbiology China, 2023, 50(12): 5376-5391.
一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析
1. 龙岩学院生命科学学院, 福建 龙岩 364012;
2. 龙岩学院 预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室, 福建 龙岩 364012;
3. 龙岩学院生物科技与健康产品工程技术研究中心, 福建 龙岩 364000
2. 龙岩学院 预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室, 福建 龙岩 364012;
3. 龙岩学院生物科技与健康产品工程技术研究中心, 福建 龙岩 364000
摘要: 【背景】 冠突散囊菌LYEC03是从陕西泾阳茯砖茶中分离得到的主要发酵菌株。【目的】 研究冠突散囊菌LYEC03菌株的基因组信息及其发酵枇杷花产品的特性，从分子水平阐明冠突散囊菌的发酵机制。【方法】 应用形态和显微形态观察、ITS序列鉴定、重测序及框架图测序对所分离的菌株LYEC03进行鉴定和基因组信息解析，采用所分离的菌株LYEC03发酵枇杷花，研究冠突散囊菌对枇杷花主要功效成分及抗氧化性能的影响。【结果】 陕西泾阳茯砖茶中分离得到的主要发酵菌株LYEC03确定为冠突散囊菌。菌株LYEC03与参考基因组覆盖率高，含有丰富的纤维素酶、蛋白酶、氧化酶和脂肪酶相关基因；基因组相关整体变异较小，其中假设蛋白、碳水化合物激酶、纤维素酶家族糖基水解酶、位点2蛋白酶家族蛋白、多酚氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等与菌株生长、能量代谢调节、产纤维酶、产蛋白酶和产氧化酶相关的基因发生了变异。菌株LYEC03基因组序列长度30 623 602 bp、GC含量51.70%、编码13 033个基因、编码基因占比55.74%，参与了碳水化合物代谢、氨基酸代谢、外源生物降解代谢、能量代谢、脂质代谢与萜类化合物和聚酮类化合物的代谢等多种物质的代谢途径转化过程。菌株LYEC03生长、主要功效成分含量的变化与总抗氧化活性、2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine, DPPH)自由基清除率和羟自由基清除率3个抗氧化指标变化一致，均呈现先增加后缓慢降低的趋势。【结论】 冠突散囊菌的发酵特性与其基因组纤维素酶、蛋白酶和氧化酶基因的含量丰富密切相关，对冠突散囊菌的基因组信息分析及其发酵特性研究有利于其发酵产品性能的提升，并为其在食品、轻工业及医药等方面的应用提供科学依据。
关键词:
茯砖茶 枇杷花 冠突散囊菌 基因组 发酵 抗氧化
Isolation, identification, gene composition, and fermentation characterization of a Eurotium cristatum strain
1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364012, Fujian, China;
2. Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology, Longyan University, Longyan 364012, Fujian, China;
3. Engineering Technology Research Center of Biotechnology and Health Products, Longyan University, Longyan 364000, Fujian, China
2. Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology, Longyan University, Longyan 364012, Fujian, China;
3. Engineering Technology Research Center of Biotechnology and Health Products, Longyan University, Longyan 364000, Fujian, China
Abstract: [Background] Strain LYEC03 is a major fermentation strain isolated from Fuzhuan tea in Jingyang county, Shaanxi province, China. [Objective] To reveal the genomic information of strain LYEC03 and the fermentation characteristics of the strain for loquat flower products, and clarify the fermentation mechanism of Eurotium cristatum at the molecular level. [Methods] Morphological and microscopic observation, ITS sequence identification, next-generation sequencing, and whole genome sequencing were employed to identify and analyze the genomic information of strain LYEC03. Furthermore, the strain was used to ferment loquat flowers and the effects of the strain on the main functional components and antioxidant properties of loquat flowers were studied. [Results] Strain LYEC03 isolated from Fuzhuan tea in Jingyang, Shaanxi was identified as Eurotium cristatum. The genome of strain LYEC03 had a high coverage of the reference genome and contained abundant genes related to cellulase, protease, oxidase, and lipase. The genes associated with bacterial growth, energy metabolism regulation, fiber production, protease production, and oxidase production had undergone mutations, including hypothetical protein, carbohydrate kinase, cellulase family glycosylhydrolase, site-2 protease family protein, polyphenol oxidase, and glutathione peroxidase. The genome sequence of strain LYEC03 had a length of 30 623 602 bp and the GC content of 57.70%, encoding 13 033 genes, among which 55.74% were coding genes and involved in the carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, xenobiotics biodegradation and metabolism, energy metabolism, lipid metabolism, and metabolism of terpenoids and polyketides. The growth of strain LYEC03 and the content of its main functional components presented consistent trends (first increasing and then slowly decreasing) with the three antioxidant indicators: total antioxidant activity, DPPH free radical scavenging rate, and hydroxyl free radical scavenging rate. [Conclusion] The fermentation characteristics of E. cristatum were related to the rich cellulase, protease, and oxidase genes in its genome. Probing into the genomic information and fermentation characteristics of E. cristatum will provide a basis for improving the fermentation performance and applying the strain in food, light industry, medicine and other fields in the future.
Keywords:
Fuzhuan tea loquat flowers Eurotium cristatum genome fermentation antioxidant
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶发酵中的优势菌，在一定的条件下可产孢子，形成黄色闭囊壳，俗称“金花”[1]。茯砖茶是一种全发酵茶，属于黑茶，在所有黑茶中加工最为独特，而陕西省泾阳县茯砖茶为“茯茶之源”，茯砖茶以其独特的作用成为了西北各族人民的生活必需品[2]。冠突散囊菌可分泌多种胞外酶，如纤维素酶、蛋白酶、酯酶、果胶酶和多酚氧化酶等，帮助茶叶中物质的转化降解，在满足自身生长需要的同时，形成了茯砖茶独特的色香风味[3]。
冠突散囊菌不仅被应用于发酵黑茶[4]，还被广泛用于发酵红茶以及绿茶等传统茶的研究[5-6]。近年来，有些研究者将其用于发酵杜仲茶、苦丁茶、桑叶茶和荔枝草茶等其他茶类的研究[7-10]，以期提升茶的品质，还有一些研究者甚至将其用于发酵葛根、苦荞和燕麦[11-13]等，以充分发挥冠突散囊菌的发酵特性，生产对人类健康有益的物质。研究表明，冠突散囊菌分泌的多酚氧化酶(polyphenol oxidase)可分解茶叶中的单宁物质，使茶多酚氧化变成茶红素(thearubigin)、茶黄素(theaflavin)以及茶褐素(theabrownine)，使茶叶滋味醇和，减少了苦涩味[14]。冠突散囊菌分泌的蛋白酶(protease)能使茶叶中蛋白质分解形成人体必需的几乎所有氨基酸，冠突散囊菌分泌的阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)可水解茶叶中的阿魏酸酯(ferulate)释放出游离的阿魏酸(ferulic)，而阿魏酸具有多种生物学活性功效[15]。同时，冠突散囊菌发酵生成的儿茶素(catechin)、儿茶素氧化聚合物及其与有机酸形成的络合物，形成了独特的香气、色泽和滋味[16]。此外，冠突散囊菌发酵的一些次级代谢产物具有降脂减肥、抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤和抑菌等多种功效[17-18]，因而具有良好的研究价值和应用潜力。目前，对冠突散囊菌的研究较多聚焦在发酵工艺优化、代谢活性物质分析、产孢机制和抗氧化活性分析等方面[19-21]，但从分子水平上进行发酵机理和抗氧化机理研究较少。
我国是世界上最大的枇杷生产国，产量占世界的2/3以上。枇杷花资源充足，具有多种营养成分和较强的生物活性，如抗氧化、止咳抗炎、抑菌、保肝护肝和抗肿瘤等。枇杷花在我国具有较长的药食两用历史，作为新食品原料，枇杷花的开发利用前景广阔[22]。近年来，以枇杷花茶为主的枇杷花相关专利和产品不断涌现，对枇杷花茶产品品质提升的研究也成为枇杷花研究的一个热点[23-24]。因此，本研究从陕西泾阳茯砖茶中分离其主要的发酵菌株冠突散囊菌，对其进行ITS序列鉴定及基因组测序，揭示该菌的种属亲源关系、基因组变异情况和基因的功能组成。本研究还利用冠突散囊菌的发酵特性来发酵枇杷花，分析冠突散囊菌对枇杷花的主要功效成分及抗氧化性能的影响，以期为从分子水平上揭示冠突散囊菌的发酵机理、提高茯砖茶、绿茶和枇杷花茶等冠突散囊菌发酵产品品质提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品茯砖茶：从市场购买的陕西省泾阳县黑茶。
枇杷花：普通栽培(Eriobotryajaponica Lindl)枇杷花采自福建莆田。
1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖营养琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖25.0，琼脂20.0，pH自然。
1.1.3 主要试剂和仪器TsingKE Master Mix，广州市康润生物制品开发有限公司；DL2000 DNA Marker、RNA提取及反转录试剂、各限制性内切酶、Taq酶等试剂，宝生物工程(大连)有限公司；引物合成，北京奥维森基因科技有限公司；纤维素含量测定试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒，赛默飞世尔科技有限公司。PCR仪和NanoDrop 2000超微量分光光度计，赛默飞世尔科技有限公司；凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司；Qubit4 Fluorometer核酸蛋白荧光定量仪，上海艾研生物科技有限公司。
1.2 菌株的分离和形态特征鉴定称取1 g茯砖茶加100 mL无菌水，28 ℃、120 r/min振荡培养30 min，用稀释涂布平板法分离菌株，挑取长势较好、菌丝粗壮、菌落形态为金黄色的“金花菌”，进行传代纯培养并保种。将纯培养的菌株转接至PDA平板中，28 ℃培养箱中培养3−4 d，观察培养后的菌落形态特征。再取一干净载玻片，滴半滴蒸馏水，以接种针取出菌丝体，分散均匀后盖上盖玻片，于光学显微镜下观察，记录菌丝的形状、大小、颜色等特性。
1.3 菌株的基因组DNA提取、ITS序列PCR扩增和测序比对用真菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的DNA，以提取的DNA为模板采用真菌通用的转录间隔区序列(internal transcribed spacer, ITS)引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR反应，扩增片段长度为600 bp。PCR反应体系(30 µL)：2×TsingKE Master Mix 15.0 µL，Primer F (10 µmol/L) 1.5 µL，Primer R (10 µmol/L) 1.5 µL，DNA模板1.0 µL，ddH2O 11.0 µL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，33个循环；72 ℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，按凝胶回收试剂盒说明进行凝胶回收、纯化，并委托北京奥维森基因科技有限公司完成测序。通过NCBI数据库中的BLASTn程序，将所获得的菌株ITS序列与数据库中相似性最高的10株基因序列进行比对，利用DNAMAN软件构建系统发育树，明确所测序菌株的种类属性[25]。
1.4 菌株重测序和分析利用高通量测序技术(high-throughput sequencing)将测序获得的基因组序列与近缘参考基因组进行比对，检测获得菌株的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP)、插入缺失(insertion/deletion, InDel)、结构变异(structure variation, SV)和拷贝数变异(copy number variation, CNV)等遗传变异信息。
在进行文库构建之前，对所提取的菌株基因组DNA进行严格检测，包括DNA纯度(NanoDrop检测、OD260/OD280比值)和DNA完整性及浓度(Qubit4 Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳检测)。样品检测合格后，经基因组DNA片段化处理、构建DNA小片段文库、上机测序，把有效测序数据比对到参考基因组中，获得相应的遗传变异信息进行比对分析[26]。
1.5 菌株基因组框架图的构建及基因组功能注释将获得的菌株基因组采用全基因组鸟枪(whole genome shotgun sequencing, WGS)法构建数据文库，由北京奥维森基因科技有限公司Illumina MiSeq测序平台完成菌株的二代测序，所测定的数据采用spades genome assembler v3.11.1软件进行校正、拼接、组装，构建分离菌株的基因组框架图，再进行菌种基因组功能注释[27]。
1.6 分离菌株接种枇杷花发酵特性分析 1.6.1 发酵过程及主要功效成分测定将分离菌株接种至PDA平板上进行扩大培养，长满至整个平板后加入5 mL无菌生理盐水洗脱，转移至带玻璃株的100 mL生理盐水中，30 ℃、150 r/min摇床培养30 min，孢子浓度达106 CFU/mL时作为发酵菌液备用。取露白期的枇杷花10 g装入250 mL三角瓶中，中高火微波灭菌2 min后加无菌水使发酵物料最终含水量为40%，孢子液按接种量5%接种，28 ℃、180 r/min培养7 d。培养1–7 d每天各取3份先进行平板活菌计数，再进行冷冻干燥，测定其水浸出物、纤维素、总多糖、粗蛋白、氨基酸、总酚、总黄酮苷和总儿茶素的含量变化，求均值。水浸出物采用《GB/T 8305—2013茶水浸出物测定》[28]方法进行测定，纤维素含量采用纤维素含量测定试剂盒测定(微量法)，总多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，粗蛋白含量采用BCA蛋白定量试剂盒测定，氨基酸含量采用茚三酮比色法测定，多酚含量采用福林酚试剂法测定，具体测定均参照肖咪等[29]的方法进行。总黄酮苷的含量采用紫外分光光度法测定，以异鼠李素为对照品，检测波长为372 nm[30]；总儿茶素含量的测定采用酸性介质中香兰素与儿茶素的显色反应进行比色法测定，检测波长为505 nm[31]。
1.6.2 发酵样品的抗氧化性能测定取上述不同发酵时间的冻干样品1 g，用中药粉碎机粉碎后加入20倍乙醇进行回流浸提24 h，4 000 r/min离心10 min收集滤液，滤渣再重复浸提一次，合并2次滤液。将滤液浓度配制成0.1 mg/mL，测定其总抗氧化活性、DPPH自由基清除率和羟自由基清除率，测定时以维生素C (vitamin C, Vc)为阳性对照。其中，总抗氧化活性的测定采用三价铁还原抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)测定，样品测定时以同样达到标准品测定吸光度所需FeSO4·7H2O毫摩尔数表示，单位mmoL/g；2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine, DPPH)自由基清除率采用抗氧化法测定，羟自由基清除率采用Fenton反应原理测定，单位均为%，具体测定均参照陈小红等[32]的方法进行。
2 结果与分析 2.1 茯砖茶发酵菌株的分离鉴定实验从陕西泾阳茯砖茶中共分离得到了13株菌，其中一株编号为LYEC03的菌株菌丝粗壮、生长速度快、纯度高、无污染，选定其作为研究的目的菌株。如图 1所示，所挑选的菌株LYEC03在PDA培养基上菌落呈较规则圆形(图 1A)，质地较致密，有黄色晕圈，边缘淡黄色，中央部分颜色较深，呈现大量黄色具饰菌丝，老后变成褐色，符合冠突散囊菌的基本形态及生物学特征。普通显微镜下观察发现，该菌由金黄色子囊果和无色透明菌丝组成，菌丝有隔，有隔膜和菌核，子囊球形或近球形，混生于具饰菌丝网中(图 1B)。
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| 图 1 菌株LYEC03菌落形态(A)和显微镜下形态(B) Figure 1 Colony morphology (A) and microscopic morphology (1 000×) (B) of strain LYEC03. |
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菌株LYEC03ITS序列扩增的PCR电泳图如图 2所示，符合预期的序列长度，其PCR产物为600 bp左右。NCBI数据库中的BLASTn比对及DNAMAN软件(neighbor-joining，NJ)法构建的系统发育树如图 3所示，结果表明菌株LYEC03与散囊菌属(Eurotium)几个菌株的相似性最高，均为100%。综合前述菌株LYEC03的菌落形态特征和显微特征，将所分离得到的菌株LYEC03确定为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)，俗称“金花菌”。
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| 图 2 菌株LYEC03的PCR电泳图 Figure 2 PCR electrographic diagram of strain LYEC03. M: DL2000 DNA Marker. |
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| 图 3 菌株LYEC03基于ITS测序的同源进化树 Figure 3 Homologous evolutionary tree of strain LYEC03 based on ITS sequencing. |
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经测定，菌株LYEC03基因组样品质量符合建库要求，为B级。其原始测序数据为：raw base 4 090 943 100 bp、effective rate 99.21%、GC content 49.23%；通过BlueWater运算程序将effective rate与参考基因组进行比对，匹配率(mapping rate)为97.76%、平均测序深度(average depth)为107.23、测序深度为1X的最小覆盖范围(coverage at least)为98.52%、测序深度为4X的最小覆盖范围为98.40%，表明菌株LYEC03所获得的测序数据与参考基因组比对匹配性较好(图 4)。查找测序基因描述文件“gene description”发现菌株LYEC03中含有假设蛋白、碳水化合物激酶、纤维素酶家族糖基水解酶、位点2蛋白酶家族蛋白、丝氨酸蛋白酶、核心启动子结合蛋白(core promoter-binding protein, CPBP)家族膜内金属蛋白酶、糖原/淀粉/α-葡聚糖磷酸化酶、脂肪酶、含patatin样磷脂酶域蛋白3、磷脂酶D家族蛋白、多酚氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸脱氢酶/氧化酶、脱氢酶/氧化酶和含多铜氧化酶结构域的蛋白质原卟啉原氧化酶、细胞色素c氧化酶组装因子(cytochrome c oxidase assembly factor) CtaG、细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、R2样配体结合氧化酶、乙醇酸氧化酶亚基(glycolate oxidase subunit) GlcD、巯基过氧化物酶、L-天冬氨酸氧化酶、2-羟基酸氧化酶等大量与菌株生长、能量代谢调节和产纤维酶、产淀粉酶、产蛋白酶、产脂肪酶、产氧化酶的基因，特别是与氧化酶相关的基因种类较多。
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| 图 4 与参考基因组相比菌株LYEC03的测序深度及累计分布 Figure 4 Sequencing depth and cumulative distribution of LYEC03 strain compared to the reference genome. |
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相较于参考基因组，菌株LYEC03 SNP注释中，其全基因组杂合比率(het rate)为0.044‰，变异总计4 991个(占整个基因组0.017 5%)；InDel注释中，其插入突变(insertion)总和844个、缺失突变(deletion)总和506个，总计1 350个(占0.004 7%)；CNV注释中，增加(duplication number)和减少的拷贝数(deletion number)均为0；SV注释中，大片段的插入(insertion)为0，片段丢失(deletion)为17，倒置(inversion)为29，染色体内部迁移(intra-chromosomal translocation, ITX)为20，染色体间的迁移(inter-chromosomal translocation, CTX)为247，总计375个(占0.001 3%)。其中，突变基因为假设蛋白、碳水化合物激酶、纤维素酶家族糖基水解酶、位点2蛋白酶家族蛋白、多酚氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等与菌株生长、能量代谢调节和产淀粉酶、产氧化酶和产纤维酶有关的基因，分布于JXNT01000001.1、JXNT01000002.1和JXNT01000003.1等8条染色体的多条序列上(图 5、表 1)。
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| 图 5 菌株LYEC03遗传变异Circos图 Figure 5 Circos diagram of genetic variation of strain LYEC03. 由外到内变异类型依次为染色体、SNP、InDel、CNV duplication、CNV deletion、SV insertion、SV deletion、SV invertion、SV ITX、SV CTX The types of variation from outside to inside were chromosome, SNP, InDel, CNV duplication, CNV deletion, SV insertion, SV deletion, SV invertion, SV ITX and SV CTX. |
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表 1 菌株LYEC03部分突变基因在染色体上的分布情况
Table 1 Distribution of partial mutated genes in strain LYEC03 on chromosomes
| 突变类型 Mutation type |
行号 Line No |
基因组序列编号 Genome sequence No. |
功能预测 Function prediction |
功能分类 Functional classification |
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| SNP注释 SNP annotation |
非同义SNP Nonsynonymous SNP |
Line47, Line50 | JXNT01000001.1 | 假设蛋白 Hypothetical protein |
细胞周期控制、细胞分裂和染色体分割 Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning |
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| Line11 | JXNT01000003.1 | 纤维素酶家族糖基水解酶 Cellulase family glycosylhydrolase |
能源生产和转换 Energy production and conversion |
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| 同义SNP Synonymous SNP |
Line367, Line525 | JXNT01000001.1 | 碳水化合物激酶 Carbohydrate kinase |
碳水化合物运输和代谢 Carbohydrate transport and metabolism |
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| Line12 | JXNT01000004.1 | 纤维素酶家族糖基水解酶 Cellulase family glycosylhydrolase |
能源生产和转换 Energy production and conversion |
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| InDel注释 InDel annotation |
非移位插入 Nonframeshift insertion |
Line2438 | JXNT01000002.1 | 位点2蛋白酶家族蛋白 Site-2 protease family protein |
转录、复制、重组和修复 Transcription, replication, recombination and repair |
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| Line6039 | JXNT01000008.1 | |||||
| Line4688 | JXNT01000005.1 | 谷胱甘肽过氧化物酶 Glutathione peroxidase |
辅酶运输和代谢 Coenzyme transport and metabolism |
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| 移码删除 Frameshift deletion |
Line5892 | JXNT01000007.1 | 碳水化合物激酶 Carbohydrate kinase |
碳水化合物运输和代谢 Carbohydrate transport and metabolism |
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| Line5991 | JXNT01000008.1 | 多酚氧化酶 Polyphenol oxidas |
次级代谢产物的生物合成、运输和分解代谢 Carbohydrate transport and metabolism |
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菌株LYEC03通过二代测序获得高质量的基因组序列，该基因组中总碱基数为4 090.943 1 Mb。经过序列拼接得到2 518个scaffold，其中1 144个大于1 200 bp，GC含量为51.70%，序列长度为30 623 602 bp。预测该菌株含有13 033个基因编码区，基因总长度为17 068 197 bp，编码区总长度占全基因组的比例为55.74%。
2.4.2 基因功能注释将菌株LYEC03基因编码序列引入直源同源群集(clusters of orthologous groups, COG)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、基因产物功能数据库(gene ontology, GO)、非冗余蛋白质序列数据库(non-redundant proteins sequence database，NR)和碳水化合物活性酶数据库(carbohydrate-active enzymes database, CAZymes)中进行比对(diamond, E value≤1E−5)，分别注释得到5 689、13 734、23 345、3 726和559个基因。其中在COG注释中，数量最多的几个类别分别是仅通用功能预测(general function prediction only) 742个、碳水化合物运输和代谢(carbohydrate transport and metabolism) 539个、氨基酸运输和代谢(amino acid transport and metabolism) 513个、脂质运输和代谢(lipid transport and metabolism) 463个、翻译、核糖体结构与生物发生(translation, ribosomal structure and biogenesis) 457个和能量产生和转化(energy production and conversion) 420个；此外，次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)注释到基因数也较多，达325个(图 6)。KEGG注释中，数量最多的代谢通路类别分别是：全局与概述图谱(global and overview maps) 4 078个、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism) 894个、氨基酸代谢(amino acid metabolism) 850个、外源生物降解代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism) 719个、能量代谢(energy metabolism) 670个、脂质代谢(lipid metabolism) 588个和萜类化合物和聚酮类化合物的代谢(metabolism of terpenoids and polyketides) 405个(图 7)。这表明菌株LYEC03参与碳水化合物、氨基酸、脂类和能量代谢比较活跃，且将一些外源性的化学物质进行了生物降解，转化生成了一些萜类或者聚酮类的次级代谢产物。
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| 图 6 菌株LYEC03的COG数据库注释 Figure 6 COG database annotation of strain LYEC03. |
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| 图 7 菌株LYEC03 KEGG数据库注释 Figure 7 KEGG database annotation of strain LYEC03. |
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菌株LYEC03发酵枇杷花不同发酵时间样品的“金花菌”数量如图 8所示，接种1 d后菌株开始大量生长，出现了明显的菌丝；接种第3天开始出现孢子，接种4 d后孢子数最多、最密，平板活菌计数菌株数量达到峰值(5.45×106 CFU/g)；随后菌株数量增长放缓，孢子变少。
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| 图 8 不同发酵时间样品的活菌数 Figure 8 Live bacterial count of samples at different fermentation time. |
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不同发酵时间样品主要功效成分含量变化如图 9所示。结果表明，样品中含量最高的为纤维素(295.80 mg/mL)，随着发酵的进行，样品中的纤维素含量逐渐开始降低，其趋势为先迅速下降而后平缓。水浸出物中含有蛋白质、氨基酸和多酚等各类丰富物质，是茶叶类饮料感官与风味物质评定的重要指标[33]。未发酵前，样品中的水浸出物含量为365.52 mg/mL，发酵前期，随着发酵时间的延长，“金花菌”菌株开始生长，分泌大量的纤维素酶、蛋白酶，将枇杷花样品中的纤维素、蛋白质等成分降解，生成了可溶性糖、氨基酸、多酚等物质，样品中的水溶性物质明显增加，至第4天达到峰值为523.12 mg/mL；发酵后期，“金花菌”产生孢子，菌株数量达到峰值需要消耗大量的能量，水浸出物可为菌株提供大量的C源和N源，其含量略微降低。样品中总多糖、粗蛋白的含量表现出先下降后平缓的趋势，总酚和氨基酸的含量表现为先上升后缓慢下降的趋势，且峰值均在发酵第4天。推测原因可能是发酵前期，“金花菌”菌株生长较为缓慢，用于维持菌株生长的多糖、粗蛋白减少较为缓慢，菌株酶解样品中的纤维、蛋白、多糖等大分子物质转化生成了总酚、氨基酸，但由于菌株数量较低，因此总酚、氨基酸增长缓慢；发酵第4天，菌株大量生长需要消耗能量，多糖、粗蛋白含量明显降低，达到峰值分别为25.56 mg/mL和11.62 mg/mL，总酚、氨基酸增长也达到峰值，分别为34.81 mg/mL和6.86 mg/mL；发酵后期菌株生长平稳，多糖、粗蛋白的消耗也表现为缓慢下降。与纤维素含量相比，蛋白质含量的降低相对更为缓慢，原因可能是菌株生长过程中分泌了大量的酶，特别是后期菌丝体分泌的酶含量更多造成测定的蛋白含量略微上升，发酵后期样品中的多糖、蛋白含量相对不足，总酚、氨基酸可能作为C源和N源被菌株消耗，因而含量缓慢下降。
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| 图 9 不同发酵时间样品的主要功效成分含量 Figure 9 Content of main functional components in samples at different fermentation times. A：纤维素和水浸出物. B：总多糖、粗蛋白、氨基酸和总酚. C：总黄酮苷、总儿茶素. A: Cellulose and water extracts. B: Total polysaccharides, crude protein, amino acids, and total phenol. C: Total flavonoid glycosides, total catechins. |
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在各大类物质具体组分分析中，本文重点研究了黄酮苷和儿茶素的组成及变化。黄酮类化合物是枇杷花的主要活性物质之一，含量较为丰富[34]。黄酮类化合物主要以黄酮苷的形式存在于发酵样品中，含量16.52 mg/mL；随着发酵时间的延长，样品中总黄酮苷的含量逐步下降。黄酮苷通过配糖化作用以黄酮醇与糖基连接而成，其在微生物分泌的胞外酶与热作用下容易发生水解释放糖基，从而加速其氧化分解，能起到降低茶汤苦涩味的作用。儿茶素是茶叶中一类重要的品质成分和功能成分，是茶类发酵样品中多酚类物质的主要组成部分[35]，但儿茶素在多酚氧化酶或过氧化酶的作用下很快会被氧化成各种儿茶素的单体(如茶黄素、茶红素和茶褐素等)，也能起到降低茶汤苦味从而改善茶汤滋味的作用。发酵开始，“金花菌”菌株分解底物生成儿茶素为主体的多酚类物质，儿茶素生成的速度超过了氧化分解的速度，因而总儿茶素含量呈微量上升的趋势，至第2天达到峰值为7.23 mg/mL；而后儿茶素氧化分解的速度加快，总儿茶素含量呈下降趋势。
2.5.3 不同发酵时间样品的抗氧化能力测定不同发酵时间样品总抗氧化活性、DPPH自由基清除率和羟自由基清除率的变化如图 10所示。结果表明，随着发酵时间的延长，枇杷花样品3个抗氧化能力指标均呈现先增加后缓慢降低的趋势，且均在发酵第4天达到峰值，分别为10.56 mmoL/g、90.89%和76.68%，均与阳性对照Vc测定数值接近。
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| 图 10 不同发酵时间样品的抗氧化能力 Figure 10 Antioxidant capacity of samples at different fermentation times. A：总抗氧化活性. B：DPPH自由基清除率、羟自由基清除率 A: Total antioxidant activity. B: DPPH free radical clearance rate, hydroxyl free radical clearance rate. |
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近年来，生物技术的发展日新月异，高通量测序技术已成为微生物基因组成和功能研究的重要工具，目前从传统发酵食品中分离得到的许多微生物菌株都进行了基因组测序，如从酱油卤水发酵中分离的葡萄球菌(Staphylococcus sp.) AL1[36]，从食醋中分离得到的葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.) SXCC-11[37]，从福建武平“红菌豆腐”中分离得到的粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)[25]。通过对这些微生物菌株基因组核苷酸序列的测定和基因组功能解析，有利于从分子水平上探究微生物菌株的发酵特性。本研究从陕西泾阳茯砖茶中分离得到其主要的发酵菌株LYEC03，经形态学观察、ITS序列鉴定及基因组测序，确定该菌株为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。菌株LYEC03重测序表明其与参考基因组覆盖率高，整体变异较小，但其中假设蛋白、碳水化合物激酶、纤维素酶家族糖基水解酶、位点2蛋白酶家族蛋白、多酚氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等与菌株生长、能量代谢调节、产纤维酶、产蛋白酶和产氧化酶相关的基因发生变异，表明分离的LYEC03菌株可能增强了其产纤维酶、产蛋白酶和产氧化酶能力。二代基因组框架图测序及编码基因蛋白的功能注释表明，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、外源生物降解代谢、能量代谢、脂质代谢与萜类化合物和聚酮类化合物的代谢等注释得到的基因数目较多，表明LYEC03菌株参与碳水化合物、氨基酸、脂类和能量代谢较为活跃，其生长过程中能分泌大量的淀粉酶、氧化酶和纤维酶将一些外源性的化学物质进行生物降解，如催化淀粉转化为单糖、催化多酚类化合物质氧化，进而生成了一些萜类、聚酮类的次级代谢产物。
冠突散囊菌(金花菌)被视为茯砖茶品质的重要因素，意味着该菌与茯砖茶相关品质成分有着不可分割的联系。研究表明，无论是原料相对单一的传统茯砖茶还是类型多样、品质各异的冠突散囊菌发酵物，其在接种冠突散囊菌发酵制备过程中，可溶性浸出物、氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白及茶多酚和儿茶素等物质成分的含量变化均随着优势真菌“金花”菌群的演变而表现出不同程度的规律性[38]。然而，冠突散囊菌发酵不同底物其各大类的营养物质变化不一，品质差异较大，因而需要从更深层次探究其底物代谢的机制才能为进一步证实冠突散囊菌发酵物品质形成机理提供理论依据。本研究中，LYEC03菌株发酵枇杷花主要功效成分及抗氧化能力测定表明，其菌株生长能分泌大量的纤维素酶、蛋白酶，随着发酵时间的延长，样品中的纤维、蛋白质成分降解，生成了可溶性糖、氨基酸和多酚等物质，增加了样品中水浸出物的含量，降低了总黄酮苷和总儿茶素的含量，减少了茶汤的苦涩味，还能提升样品的抗氧化活性，为后续枇杷花茶产品的制备，风味、色泽的改善，以及产品品质的提升提供了一个参考方案和理论依据。LYEC03菌株总抗氧化活性、DPPH自由基清除率和羟自由基清除率3个抗氧化指标均呈现先增加后缓慢降低的趋势，与菌株生长、主要功效成分含量的变化一致，再次验证了LYEC03菌株具有较强的产纤维酶、产蛋白酶和产氧化酶的能力[39]。
总之，本研究对茯砖茶主要发酵菌株进行分离鉴定、基因组成及发酵特性分析，证实了冠突散囊菌的发酵特性与其基因组中含有丰富的纤维素酶、蛋白酶、氧化酶和脂肪酶基因相关，特别是其产氧化酶基因的种类较多，有利于样品中的一些物质如多酚进一步氧化进而提升抗氧化活性。本研究揭示了冠突散囊菌的发酵本质，为其发酵相关茶产品在分子水平上相关基因、代谢过程的调控提供了理论基础，也为冠突散囊菌在食品、轻工业以及医药等方面的开发利用提供了科学依据。
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