淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrheae, NG)又称为淋球菌，主要感染生殖器黏膜，也可以感染眼部、鼻咽部和肛门黏膜。在大约10%−25%未经治疗的女性中，NG可通过生殖道上行感染而诱发盆腔炎(pelvic inflammatory disease, PID)临床综合征，PID患者可能会出现长期和(或)永久性后遗症，如慢性盆腔疼痛、输卵管损伤、子宫内膜炎、异位妊娠和不孕^[1-2]。根据世界卫生组织的估计，全球15−49岁的人群将出现8 700万例新增的淋病感染者^[3]。目前我国淋病发病人数呈现上升趋势，在青少年及中年人群中增长速度较快^[4]。此外，NG的感染还会促进HIV的传播和感染^[5]，随着多重耐药NG菌株的出现^[6]，研发NG保护性疫苗来防治淋病的传播成为迫切的需求。

在NG菌株FA1090中NG1225基因编码的氨基酸序列被注释为PPIase或巨噬细胞感染性增强因子(macrophage infectivity potentiator, MIP)^[7]。在NG和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis, NM)的所有菌株中都有MIP的表达，且氨基酸序列高度保守，是一种锚定在外膜表面的脂蛋白，并具有PPIase活性^[7]。对NM-MIP蛋白的研究发现，NM-MIP血清抗体具有针对不同NM菌株的交叉抗体杀菌活性^[8]，而NG-PPIase作为候选疫苗的研究尚未见报道，因此，NG-PPIase作为候选疫苗抗原的潜力值得进一步研究。

本研究通过生物信息学分析淋病奈瑟菌的PPIase蛋白结构及其抗原表位，构建原核表达系统，并将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，检测其诱导产生特异性抗体的能力，并将收获的抗体与NG全细胞抗原孵育，分别用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测重组蛋白PPIase诱导产生的特异性抗体能否与NG外膜表面结合，以初步评价PPIase作为疫苗和分子诊断靶点的潜在价值。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

9只6−8周无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雌性BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达试验动物有限公司，获得大理大学实验动物伦理委员会批准号2023-PZ-197。

1.1.2 主要试剂和仪器

NG菌株FA1090，美国菌种保藏中心；化学发光检测试剂，上海百赛生物技术股份有限公司；限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ，Fermentas公司；Pfu DNA polymerase，Life Technology公司；Ni-NTA琼脂糖，Invitrogen公司；二抗(羊抗鼠IgG)，Jackson Immuno Research公司；羊抗鼠IgG-FITC抗体，杭州华安生物技术有限公司；小鼠源性His标签抗体，索莱宝公司；大肠杆菌Rosetta(DE3)、pET32a(+)质粒和小鼠源性NG多克隆抗体由本实验室保存和制备。化学发光成像仪，GE公司；超声波细胞破碎仪，新芝生物科技有限公司；连续波长酶标仪，基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 理化性质和结构分析

利用ProtParam tool软件分析PPIase蛋白的理化性质，PONDR软件分析其内在的无序区域，NPC@SOPMA软件分析其二级结构，SMART在线软件分析结构域，Expasy工具中的SWISS-MODEL分析三级结构。

1.2.2 抗原表位分析

1) B细胞抗原表位分析

应用ExPasy-ProtScale软件分析极性、亲水性、柔韧性和表面可及性，并结合ABCpred软件对B细胞表位进行评价。

2) T细胞抗原表位分析

应用SYFPEITHI软件在线分析细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位和辅助性T淋巴细胞(helper T cell, Th)表位。CTL和Th表位分析选择的表位长度分别为9个和15个氨基酸残基。

1.2.3 原核表达系统的构建及其表达、纯化和鉴定

以NG标准株FA1090的基因组DNA为模板，PCR扩增PPIase酶活性区域基因，上游引物序列为(5’-ACAAGGCCATGGCTGATATCGG ATCCAAAGCAGATGCAAAAGCCAATAAAGAAAAAGGC-3’)，下游引物序列为(5’-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGTTCACTTTTTTGATATCCACCTGATCCGG-3’)。PCR反应体系(50 μL)：10×Pfu Buffer 5 μL，Pfu DNA Polymerase (5 U/μL) 1 μL，dNTP Mix (10 mmol/L each) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(20–50 ng/μL) 1 μL，RNase-free ddH₂O 40 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将PCR扩增的目的基因连接到pET32a(+)质粒中，并转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，再经PCR筛选出阳性重组质粒菌株，并经双酶切和测序鉴定正确后，用于蛋白的诱导表达。将含重组质粒的宿主菌于37 ℃、180−220 r/min培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度0.5 mmol/L，30 ℃继续振荡培养3 h，8 000 r/min离心3 min收集菌体后，使用功率200 W超声(工作3 s，暂停5 s，总时间10 min)破碎菌体，采用Ni-NTA柱层析法纯化蛋白，分别以不同浓度咪唑洗脱，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测其纯度。将纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE后电转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，分别用小鼠源性NG多克隆抗体和His标签抗体作为一抗，羊抗鼠IgG作为二抗进行Western blotting检测其免疫反应性。

1.2.4 小鼠的免疫及免疫血清中的IgG抗体效价的测定

将BALB/c小鼠随机分为3组，每组3只小鼠，将纯化的PPIase重组蛋白50 μg与等量弗氏佐剂混匀乳化，分2次免疫BALB/c小鼠，每次免疫间隔2周。阳性对照组和阴性对照组分别免疫相同剂量的NG全菌抗原和PBS。末次免疫后1周收获免疫血清。用超声裂解的NG全菌抗原包被96孔酶标板，采用ELISA间接法测定小鼠免疫血清IgG抗体效价，P/N值(待测孔A₄₅₀值/阴性对照孔A₄₅₀值)≥2.1为阳性。

1.2.5 PPIase血清抗体与NG外膜表面结合情况的分析

1) 全细胞抗原ELISA试验

NG全细胞抗原使用75%乙醇进行制备，用PBS洗下NG菌苔，洗涤2次后重悬细菌，加入适量无水乙醇至终浓度为75%，室温静置30 min，用PBS洗涤2次再重悬细菌，调节NG浓度至1.0×10⁷ CFU/mL，每孔加100 μL制备好的NG全细胞抗原，37 ℃包板过夜后，使用磷酸盐吐温缓冲液(phosphate Tween buffer, PBST)洗涤3次，用ELISA间接法测定血清抗体与NG全细胞表面抗原的结合能力。

2) IFA试验

将NG标准菌株FA1090的浓度调至1.0×10⁶ CFU/mL，取10 μL菌悬液涂布到载玻片上，经固定后滴加20 μL上述PPIase重组蛋白免疫血清作为一抗(1:100)，阳性对照加入NG全菌抗原的免疫血清，阴性对照加入免疫PBS的免疫血清。37 ℃孵育2 h后用PBS洗涤3次，每次3 min，再加入1:500稀释的IgG-FITC荧光标记的羊抗鼠二抗20 μL，37 ℃孵育1 h后用PBS洗涤5次，每次3 min。最后用90%甘油封片后置于荧光显微镜观察抗体与NG全细胞表面抗原的结合情况。

1.2.6 统计学分析

抗体效价以−log₁₀表示，各组数据均用x±SD表示，并用SPSS统计学软件中的两独立样本t检验分析各组数据之间的统计学意义，P < 0.05说明差异具有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 理化性质和结构分析的结果

该蛋白含有272个氨基酸残基，α螺旋(alpha helix, Hh)占39.34%、无规则卷曲(random coil, Cc)占30.51%、延伸链(extended strand, Ee)占20.59%、β折叠(beta turn, Tt)占9.56% (图 1A)；N端27−72 aa区域存在连续的无序性区段(图 1B)。SMART软件分析结果显示该蛋白包含1个信号肽(1−26 aa)、1个N端的FK506结合蛋白(FK506 binding protein, FKBP)结构域(第35−155 aa)和1个C端的FKBP结构域(第160−250 aa) (图 1C)。PPIase蛋白质的三级结构分析结果发现该蛋白结构比较松散，可形成同源二聚体结构，通过2个单体N端的α1和α2螺旋的侧链之间的疏水作用结合在一起形成一种对称的非典型反向平行螺旋体结构(图 1D)。

2.2 抗原表位分析结果

2.2.1 B细胞抗原表位分析结果

经ExPasy-ProtScale分析，阈值15以上极性较强的肽段包括第21−27、63−81、89−103、114−145、156−179、209−217和263−268肽段(图 2A)，阈值0以上亲水性较强的肽段包括第20−37、39−46、61−81、87−103、110−146、153−179、183−191、209−217、226−239和250−268肽段(图 2B)，阈值0.44以上柔韧性较好的肽段是第29−34、41−52、59−77、89−101、125−134、139−196、199−208、210−240和250−268肽段(图 2C)，阈值6.5以上表面可及性较好的肽段是第20−36、38−47、117−134、137−150、157−166和184−192肽段(图 2D)。

将ABCpred软件预测的结果(表 1)与ExPasy-ProtScale分析的结果综合分析，发现极性、亲水性、柔韧性和表面可及性均较好的优势B细胞表位有5个肽段，分别是113−128、149−164、158−173、209−217和228−243肽段。

2.2.2 T细胞抗原表位分析结果

在去除PPIase蛋白信号肽的26个氨基酸残基后，对其余的246个氨基酸残基用SYFPEITHI软件分别分析其CTL和Th表位。通常CTL表位最佳长度为9个氨基酸残基，因此带有246个氨基酸残基的PPIase蛋白可拆分出的线性的CTL表位有236个，按SYFPEITHI的分析策略，具有可信度的表位至少占80%，其中得分最高的前2%是最佳的优势表位，同理可推断出最佳的Th表位。结果发现9个最佳的优势CTL表位(表 2)和18个优势Th表位(表 3)。

2.3 原核表达系统的构建及其表达、纯化和鉴定的结果

为了确保重组蛋白的可溶性表达，在克隆PPIase基因时，选择去除了编码N端信号肽、连续无序区段的碱基，并选择了具有PPIase酶活性区段的抗原性序列，对121−272位的氨基酸残基的编码基因进行了克隆。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约456 bp处出现预期的电泳条带(图 3A)，测序结果正确，表明PPIase原核表达系统构建成功。经IPTG诱导表达重组蛋白主要以可溶性形式大量表达于上清中，出现相对分子量约为34 kDa的蛋白条带。pET32a(+)空质粒带有18 kDa左右的融合蛋白标签，而目标蛋白的分子量约为16 kDa，因而出现明显蛋白条带的分子量与预期融合蛋白大小相符。对重组蛋白采用镍柱亲和层析法进行纯化，用500 mmol/L咪唑洗脱可以得到纯度较高的重组蛋白(图 3B)。Western blotting结果显示，重组蛋白PPIase能与NG多克隆抗血清发生特异性结合，在约34 kDa处出现了特异性条带，说明表达产物具有良好的免疫反应原性(图 3C)。

2.4 小鼠免疫血清中IgG抗体效价的检测结果

重组PPIase蛋白免疫BALB/c小鼠后可刺激免疫系统产生效价较高的IgG抗体，与免疫NG全菌抗原的阳性对照组相比较，差异无统计学意义(P > 0.05) (表 4)。

2.5 PPIase血清抗体与NG外膜表面结合的检测结果

2.5.1 全细胞抗原ELISA试验的检测结果

PPIase免疫血清可以特异性地与NG全细胞表面抗原结合，与免疫NG全菌抗原的阳性对照组血清相比较，差异无统计学意义(P > 0.05) (表 5)。

2.5.2 IFA试验检测的结果

PPIase重组蛋白和阳性对照组免疫血清均能特异性地结合在NG表面，在NG表面出现FITC的荧光信号(图 4)。

3 讨论与结论

在NG候选疫苗的研究中，可诱导产生抗体杀菌效应的候选疫苗靶点通常是暴露在细菌表面高度保守的蛋白^[9]，对NG疫苗的长期研究表明，NG的脂寡糖、不透明蛋白和Ⅳ型菌毛等表面抗原容易发生变异而不宜作为候选疫苗靶点^[10]。孔蛋白作为NG表面的一种主要外膜蛋白，其能以宿主的线粒体为靶点调节细胞凋亡来促进NG的感染^[11]，从而使机体无法产生有效的免疫保护作用。虽然NG疫苗的研究经历了数个世纪的时间，但至今尚无成功的疫苗用于淋病的预防。

在沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila, LP)和锥虫(Trypanosoma)等病原体中都发现了具有PPIase活性的同源MIP蛋白，被鉴定为多种致病菌的毒力相关蛋白^[12-13]。这些病原体的MIP蛋白属于FKBP家族，具有PPIase酶活性，能够将肽基-脯氨酸键从顺式转化为反式，有助于蛋白质的折叠、稳定性和活性^[14]。有研究发现，作为一种胞内寄生菌，嗜肺军团菌的MIP可促进其在肺泡巨噬细胞和血液单核细胞的存活与繁殖^[15]。同时，在淋病奈瑟菌中发现的PPIase蛋白也可能在NG的持续性感染中发挥作用，其PPIase酶活性可以被雷帕霉素和他克莫司所抑制^[7]。由于雷帕霉素和他克莫司可抑制人T细胞增殖，所以不适宜作为上述细菌的抗菌药物。在针对CT和奈瑟菌MIP蛋白PPIase酶活抑制剂的筛选研究中发现哌啶酸衍生物PipN3和PipN4可影响CT在HeLa细胞中的发育周期，抑制NG在中性粒细胞中的生存以及抑制NM在上皮细胞的黏附、侵袭和存活^[16]。因此，PipN3和PipN4作为PPIase酶活抑制剂有望成为耐药的CT、LP、NG和NM的有效抗菌剂而用于临床治疗。同样地，对淋病奈瑟菌的PPIase蛋白诱导所产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞，可能在通过识别或结合暴露在膜表面的淋病奈瑟菌PPIase蛋白而发挥阻止NG黏附上皮细胞的作用之外，还可能通过抑制其PPIase酶活性从而影响其在中性粒细胞内的存活。

进一步分析本研究结果可发现，NG-PPIase的5个优势B细胞优势表位中有4个位于C端的FKBP结构域，27个T细胞优势表位中有15个同样位于C端的FKBP结构域，且PPIase蛋白是以N端的α螺旋锚定到细菌外膜上的二聚体结构，而N端的大部分序列是在胞内的部分，只有C端的FKBP结构域是充分暴露在细菌外膜的区域。因此，本研究中去除了N端包括1个信号肽序列、1个连续的无序性区段和部分FKBP_N结构域序列的编码基因，选择了包含完整PPIase酶活区域的FKBP_C结构域序列的编码基因进行了成功地克隆，并实现了该蛋白在原核系统中大量可溶性表达。重组的PPIase蛋白诱导小鼠产生IgG抗体效价与NG全菌抗原免疫组相比无显著性差异，表明其具有良好的免疫原性，可诱导机体产生效价较高的抗体。此外，以NG全细胞为靶细胞，经全细胞ELISA和IFA试验均证实重组PPIase蛋白的免疫血清可以与NG靶细胞在表面发生特异性结合。在从大量外膜蛋白中筛选候选疫苗的研究中，这种通过检测外膜蛋白诱导产生的免疫血清与相应细菌表面分子的结合情况来初步、快捷地鉴定其是否可能作为候选疫苗的方法具有一定的借鉴价值。研究结果表明，PPIase蛋白具有作为候选疫苗的潜在价值，该研究结果还可为进一步探索PPIase蛋白的致病机制以及NG的分子诊断靶点和药物靶点提供研究基础，同时PPIase蛋白在体内所产生的免疫应答对NG的PPIase酶活性的影响以及其对NG在中性粒细胞内存活的影响也值得进一步研究。