2023, Vol. 50扩展功能
文章信息
- 王娜, 徐裴, 唐唯, 刘晶
- WANG Na, XU Pei, TANG Wei, LIU Jing
- 致病疫霉PiSAK1的生物学功能分析
- Biological roles of Phytophthora infestans PiSAK1
- 微生物学通报, 2023, 50(11): 4910-4924
- Microbiology China, 2023, 50(11): 4910-4924
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230255
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文章历史
- 收稿日期: 2023-03-30
- 接受日期: 2023-07-19
- 网络首发日期: 2023-08-29
2. 云南师范大学云南省高校马铃薯生物学重点实验室, 云南 昆明 650500
2. Key Laboratory of Potato Biology in Universities of Yunnan Province, Yunnan Normal University, Kunming 650500, Yunnan, China
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界四大主要粮食作物之一，中国是世界马铃薯主产区之一。马铃薯晚疫病由病原卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans)引起，严重时可导致马铃薯绝收，是马铃薯生产上的毁灭性病害[1]。19世纪中期，马铃薯晚疫病大暴发导致马铃薯产量锐减，大量爱尔兰人因饥饿而流亡他国[2]。近年来，马铃薯晚疫病在世界各马铃薯主产区频繁发生且危害逐年加重，严重威胁全球粮食安全。解析致病疫霉如何侵染寄主植物对防控病原菌的侵染至关重要。近年来，关于致病疫霉侵染机制的研究大多集中在病原菌分泌的效应蛋白方面，效应蛋白能够与植物靶标蛋白结合进而干扰植物免疫[3-5]。然而病原菌在释放效应蛋白进入植物细胞前要先克服一系列的逆境胁迫。例如，病原菌在侵入植物细胞汲取营养前需要维持自身细胞的渗透平衡，抵御植物先天免疫反应(如活性氧迸发等)引发的多种胁迫刺激等。由此可见，研究病原菌如何克服多种外界胁迫刺激对全面解析其致病机理至关重要。
胁迫激活的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinases, MAPKs)，即SAPKs (stress-activated MAPKs, SAPKs)是一类负责传递外界环境胁迫信号的丝裂原活化蛋白激酶，它能够被高渗透压胁迫、热胁迫、氧化胁迫和紫外线辐射等激活[6]。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Hog1、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) Sty1及哺乳动物p38、JNK都属于SAPKs。研究表明，植物致病真菌的SAPKs功能具有差异性和多样性，SAPKs的功能缺失会影响病原菌的生长发育、破坏其多胁迫应答反应、降低其侵染能力等[7-13]。在禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)、梨果黑斑病菌(Alternaria alternata)和结瘤副单孢菌(Parastagonospora nodorum)中都有SAPKs的相关报道，这些病原真菌的SAPKs都能够调节细胞应答高渗透压胁迫，有些还能够应答氧化胁迫、热胁迫等胁迫刺激，但其功能并不完全一致[7-13]。
在分类上，卵菌与真菌的亲缘关系较远，而与褐藻和硅藻的亲缘关系较近[14-15]。卵菌和真菌在细胞壁成分、细胞代谢方式、rRNA序列、侵染方式、菌丝形态和生活史方面都存在差异，表明卵菌和真菌在侵染寄主植物时具有不同的遗传和侵染机制[16-17]。植物致病卵菌主要依靠卵孢子、孢子囊及其释放的游动孢子在寄主植物间传播，如何维持细胞内渗透压的稳定对游动孢子极为重要[18]。目前，有关病原卵菌SAPKs在侵染植物时发挥的生物学功能研究较少[19-20]。Liu等[19]在培养基中添加SAPK所在通路的抑制剂，发现辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的生长被显著抑制，重金属诱导的细胞脂质过氧化及细胞总抗氧化能力受到影响，重金属离子对辣椒疫霉毒力的抑制作用增强。在大豆疫霉(Phytophthora sojae)中也存在一个SAPK即PsSAK1，其基因在游动孢子阶段、休止孢阶段及早期侵染阶段上调表达，同时在氧化胁迫及渗透压胁迫处理后上调表达；将该基因沉默后，游动孢子发育异常且菌株致病力显著下降[20]。虽然大豆疫霉与致病疫霉同属疫霉属，但二者在生长条件、有性生殖方式和寄主范围等方面存在较大差异。
目前针对植物致病真菌SAPKs的研究较多，其功能具有差异性和多样性，然而植物病原卵菌中相关的研究报道较少。因此，研究病原卵菌如何克服外界不良环境的影响从而成功侵染寄主植物对解析其致病机制意义重大。截至目前鲜见有关致病疫霉中SAPK的报道，其在生长发育、抵抗外界胁迫及侵染寄主植物过程中所发挥的作用并不清楚。因此，探究致病疫霉中SAPK的生物学功能及其在致病过程中所起的作用有助于深入理解其致病机理。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、植物及质粒致病疫霉88069及大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株均由本实验室保存。本氏烟草(Nicotiana benthamiana)及四倍体马铃薯Desiree由本实验室提供，种植于人工恒温气候室中(22 ℃，16 h光照/8 h黑暗)，生长3–6周后备用。质粒pTOR-mRFP由南京农业大学王源超教授惠赠。
1.1.2 培养基黑麦-V8培养基：黑麦60.0 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min，经两层纱布过滤得到黑麦汁(约0.8 L)。黑麦汁0.8 L，V8蔬菜汁0.1 L，碳酸钙1.2 g，蔗糖20.0 g，琼脂20.0 g，pH 7.0，蒸馏水定容1 L。
青豆汁培养基：青豆120.0 g，蒸馏水定容1 L。
1.1.3 主要试剂和仪器ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ，宝日医生物技术(北京)有限公司。恒温培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司；漩涡振荡仪，Scilogex公司。
1.2 生物信息学分析以NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中酿酒酵母、裂殖酵母和大豆疫霉等的SAK1蛋白序列为参考，在线BLAST比对搜索致病疫霉基因组数据库，获得同源蛋白PiSAK1。随后将所得同源蛋白的氨基酸序列与酿酒酵母、裂殖酵母、智人(Homo sapiens)、稻瘟病菌、橡树疫霉(Phytophthora ramorum)、寄生霜霉(Hyaloperonospora parasitica)、辣椒疫霉和大豆疫霉的同源蛋白序列用ClustalW软件(http://www.genome.jp/tools/clustalw)进行多重序列比对并分析其氨基酸保守序列。再利用MEGA 7软件(http://www.megasoftware.net)对上述蛋白进行系统聚类分析。
1.3 PiSAK1在致病疫霉各发育阶段及侵染马铃薯不同时期的表达量测定 1.3.1 致病疫霉不同样品的收集致病疫霉菌株接种于黑麦-V8培养基上并在18 ℃黑暗条件下培养7 d后，用手术刀切取大小约为0.5 cm×0.5 cm的菌块放置于青豆汁培养液中，18 ℃静置培养3.5 d后收获菌丝，−80 ℃保存备用。向黑麦-V8培养基上18 ℃黑暗培养15 d的致病疫霉中加入无菌水并用涂布棒刮洗孢子囊，取部分孢子囊悬浮液于18 ℃、5 000 r/min离心5 min，去除上清后−80 ℃保存备用。将剩余孢子囊悬浮液在10 ℃静置30 min后再在18 ℃静置30 min，经滤布(Miracloth)过滤后得到游动孢子悬浮液。一部分游动孢子悬浮液于18 ℃、5 000 r/min离心5 min后去上清，−80 ℃保存备用；另一部分漩涡振荡仪充分振荡30 s后得到休止孢悬浮液，于相同条件下离心，去上清后−80 ℃保存备用。
摘取温室培养6周的马铃薯叶片并用75%乙醇表面消毒后晾干备用。收集培养15 d的致病疫霉孢子囊制备成悬浮液(5×104个/mL)，按照上述方法再制备成游动孢子悬浮液。采用离体叶片接种法，将10 μL游动孢子悬浮液均匀接种于马铃薯叶片背面，于22 ℃分别保湿培养0、6、12、24和48 h，取样并置于−80 ℃保存备用。
为研究PiSAK1是否受NaCl或H2O2诱导表达，将致病疫霉88069菌株在青豆汁培养液中18 ℃黑暗静置培养3.5 d后，转入含0.3 mol/L NaCl或3 mmol/L H2O2的青豆汁培养液中胁迫培养0.5 h，收集菌丝后吸干水分并置于−80 ℃保存备用。
1.3.2 总RNA提取及RT-qPCR分析将上述样品分别用液氮迅速研磨成粉末后，利用TRIzol提取法提取菌丝总RNA。分别用PrimeScript RT Reagent Kit及TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行cDNA的合成及RT-qPCR反应，反应体系、条件参见试剂盒说明书，采用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。所用引物见表 1。
| Primer | Sequence (5′→3′) | Product length (bp) |
| PiSAK1 RT-F/R | CTCCACCGCGTCATCTACTC/AGTGCACGTACTTCATGGCA | 94 |
| PiActA RT-F/R | CGGAGCGTGGTTACTCGTTC/CTTCTCCAGACCCGACGACT | 134 |
| PiSAK1S-F/R | ctcgaggtcgacggtatcgatTTATGCGACTTCCCGAGCTGGT/caagaagtaggcaccccgcggATGAGCTCACAGGACGGCG | 2 049 |
| PiSAK1OE-F/R | ctcgaggtcgacggtatcgatATGAGCTCACAGGACGGCG/ggaggccatgatatcatcgatTGCGACTTCCCGAGCTGGT | 2 046 |
| PiCAT2 RT-F/R | GCGTTTATCGACCACATGGC/TAATGTCTGCGTGCGTCACT | 112 |
| PiGPD1 RT-F/R | TTTGATACCGCCCAACGTCA/CTGATGATCCGCTCCAGGTC | 128 |
| 小写字母表示无缝克隆接头序列；小写字母加下划线表示引入的酶识别位点 Lowercase letters represent seamless cloned splice sequences; Lowercase letters underlined represent introduced restriction endonuclease sites. |
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根据NCBI中公布的PiSAK1基因cDNA序列设计引物，扩增其全长cDNA序列(表 1)。以pTOR-mRFP作为骨架载体，用合适的限制性内切酶酶切后利用无缝克隆连接法(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)连接到pTOR-mRFP载体上，构建PiSAK1的沉默及过表达载体。其中，构建基因沉默载体时，用Cla Ⅰ及Sac Ⅱ双酶切骨架载体将mRFP的序列从pTOR-mRFP载体上切除，再将PiSAK1基因的cDNA序列用相同的酶切后反向连接到酶切后的载体上。构建基因过表达载体时，用Cla Ⅰ单酶切pTOR-mRFP载体，再将PiSAK1的cDNA序列用相同酶切后连接到载体上，使PiSAK1的cDNA序列刚好处于mRFP序列的前端。载体构建成功后转化大肠杆菌，用菌落PCR法筛选出阳性克隆(所用引物见表 1)，挑取阳性克隆送昆明擎科生物科技有限公司测序，提取测序正确菌株的质粒保存备用。随后，利用PEG介导的原生质体转化法将上述质粒导入致病疫霉中，具体操作参考马振川[21]的方法。待转化子长出后，用手术刀切取菌丝块在青豆汁培养液中18 ℃静置培养3.5 d，收集菌丝后吸干水分，液氮研磨至粉末状后提取菌丝总RNA，反转录成cDNA后用于RT-qPCR分析，所用引物见表 1。
1.5 PiSAK1基因沉默、过表达菌株的表型测定 1.5.1 菌落生长及孢子囊产量测定致病疫霉在黑麦-V8培养基上培养7 d后，用直径为5 mm的打孔器在致病疫霉菌落边缘处打孔，并将该菌丝块接种于含黑麦-V8培养基的培养皿中央，18 ℃黑暗条件下培养，培养7 d后测量菌落直径，培养14 d后用无菌水刮洗培养皿并统计孢子囊产量。
1.5.2 胁迫敏感性测定及相关基因表达量检测致病疫霉在黑麦-V8培养基上培养7 d后，用直径为5 mm的打孔器在致病疫霉菌落边缘处打孔并将该菌丝块分别接种于黑麦-V8培养基、含0.3 mol/L NaCl或3 mmol/L H2O2的黑麦-V8培养基上，18 ℃黑暗条件下培养7 d后测量各菌株的菌落直径并计算相对抑制率(relative growth inhibition, RGI)。
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式中：Dc为对照平板上的菌落直径；Ds为胁迫平板上的菌落直径。
为检测胁迫后菌株中相关响应基因的表达情况，将致病疫霉88069菌株在青豆汁培养液中培养3.5 d后，转入含0.3 mol/L NaCl或3 mmol/L H2O2的青豆汁培养液中胁迫培养0.5 h，收集菌丝后吸干水分并参照1.3.2中的方法提取菌丝总RNA并进行RT-qPCR分析，所用引物对为PiGPD1 RT-F/R和PiCAT2 RT-F/R (表 1)。
1.5.3 菌株致病性测定收集在黑麦-V8培养基上培养14 d的不同菌株致病疫霉孢子囊并制备成悬浮液，调整其浓度为5×104个/mL，10 ℃及18 ℃依次静置30 min后，取10 μL接种马铃薯Desiree叶片。接种后的叶片于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下保湿培养，4 d后统计病斑面积。
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式中：L和W分别代表病斑的长及宽。
1.5.4 活性氧检测将致病疫霉接种在黑麦-V8培养基上，18 ℃黑暗培养14 d并收集其孢子囊制备成浓度为2×105个/mL的悬浮液，10 ℃及18 ℃依次静置30 min后取10 μL接种本氏烟草叶片，并于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下保湿培养48 h。随后将叶片浸于适量二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色液(浓度为0.1%)中，常温下避光染色8 h。之后放入无水乙醇溶液中煮沸15 min脱色，随后将叶片于50%乙醇溶液中漂洗10 min，置于蒸馏水中漂洗10 s，取出叶片拍照。以野生型菌株接种后活性氧的积累量作为对照，利用ImageJ软件统计接种点活性氧积累量。
1.6 数据处理及分析研究中所有试验均经过至少3次生物学重复，数据使用Date Processing System (DPS)软件进行统计分析，采用单因素方差分析及Tukey’s HSD多重比较检验(P < 0.05)，使用GraphPad Prism 9绘图。
2 结果与分析 2.1 生物信息学分析结果根据酿酒酵母、裂殖酵母、稻瘟病菌和大豆疫霉中SAPKs的相关研究结果结合NCBI数据库中已公布的上述各蛋白的氨基酸序列，在线BLAST比对搜索到致病疫霉中有一个同源蛋白，命名为PiSAK1，蛋白登录号为XP_002902236，该基因全长2 007 bp，无内含子。使用在线分析工具InterProScan结合BLAST比对结果分析蛋白结构域。结果表明，PiSAK1由668个氨基酸组成，其中第51−150位氨基酸为PH结构域，第233−525位氨基酸为Ser/Thr蛋白激酶催化结构域(图 1)。用ExPASy预测该蛋白分子量为75.17 kDa，等电点为5.85。
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| 图 1 PiSAK1蛋白结构域示意图 Figure 1 Schematic diagram of PiSAK1 protein domain. |
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将PiSAK1与酿酒酵母、裂殖酵母、智人、稻瘟病菌、橡树疫霉、寄生霜霉、辣椒疫霉、大豆疫霉中的SAK1同源蛋白进行多重序列比对并分析其氨基酸保守序列(图 2)。结果表明，PH同源结构域仅存在于卵菌中，是卵菌SAPKs所特有的。不同于真菌及人类SAPKs的TGY保守性磷酸化基序，PiSAK1及其他病原卵菌均为TEY保守性磷酸化基序。此外，利用MEGA 7软件(http://www.megasoftware.net)进行系统聚类分析，结果表明不同卵菌的SAPKs聚成一支，而哺乳动物与真菌SAPKs则各自聚成一支(图 3)。
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| 图 2 PiSAK1与其他卵菌、真菌及人类的SAPKs蛋白激酶结构域的比对 Figure 2 Comparison of PiSAK1 with SAPKs protein kinase domains of other oomycetes, fungi, and humans. 利用ClustalW对SAPKs的全长氨基酸序列进行多重序列比对及分析. 星号表示该位点氨基酸完全相同，黑色方框内表示保守性磷酸化基序 Multiple sequence alignment analysis of the full length amino acid sequence of SAPKs using ClustalW. The asterisk indicates that the amino acids at this site are identical, and the black box indicates a conservative phosphorylation motif. |
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| 图 3 PiSAK1与其他卵菌、真菌及人类SAPKs的系统聚类分析 Figure 3 Systematic cluster analysis of PiSAK1 with other oomycete, fungi, and human SAPKs. 括号中为GenBank登录号；分支点上的数字为bootstrap值；标尺0.10是序列差异的分支长度 GenBank accession numbers are shown in parentheses; Bootstrap values are shown at branch points; The scale 0.10 is the branch length of the sequence difference. |
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提取致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后用RT-qPCR技术分别检测PiSAK1在营养菌丝、无性孢子囊、游动孢子、休止孢阶段和侵染马铃薯不同时期的表达量。以PiActA作为内参基因，分别以营养菌丝、侵染马铃薯叶片0 h、胁迫刺激0 h的PiSAK1表达量为对照，结果显示，PiSAK1的表达量在无性孢子囊、游动孢子和休止孢阶段均有显著上调，其中休止孢阶段的表达量达到最高，其次为无性孢子囊和游动孢子，营养菌丝中PiSAK1的表达量最低(图 4A)；致病疫霉侵染马铃薯叶片后PiSAK1的表达量显著升高，并在侵染48 h时达到高峰(图 4B)；0.3 mol/L NaCl和3 mmol/L H2O2胁迫刺激致病疫霉菌丝0.5 h后PiSAK1的表达量均显著升高(图 4C)。PiSAK1在上述多个阶段大量表达，说明PiSAK1在侵染马铃薯及抵御外界高渗透压胁迫、氧化胁迫的过程中均发挥重要作用。
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| 图 4 PiSAK1在各发育阶段及侵染马铃薯叶片不同时期的表达量 Figure 4 Expression of PiSAK1 at various developmental stages and different stages of infected potato leaves. A：PiSAK1在营养菌丝(MY)、无性孢子囊(SP)、游动孢子(ZO)、休止孢(CY)阶段的表达量. B：PiSAK1在侵染马铃薯叶片0、6、12、24和48 h时的表达量. C：致病疫霉菌丝被0.3 mol/L NaCl和3 mmol/L H2O2胁迫刺激0 h (Control)、0.5 h时PiSAK1的表达量. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: Expression of PiSAK1 at vegetative hyphae (MY), asexual sporangia (SP), zoospores (ZO), and resting spores (CY) stages. B: The expression of PiSAK1 in infected potato leaves at 0, 6, 12, and 24 h, and 48 h. C: The expression of PiSAK1 was detected after the hyphae of P. infestans were stressed with 0.3 mol/L NaCl and 3 mmol/L H2O2 for 0 h and 0.5 h. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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从致病疫霉的cDNA中成功克隆到PiSAK1的编码序列，并成功构建PiSAK1基因沉默及过表达载体。将上述载体分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性克隆菌落后送去昆明擎科生物科技有限公司测序，最终分别获得了含正确克隆序列载体的大肠杆菌转化子(图 5A)。提取质粒后利用PEG介导的原生质体转化方法将基因沉默及过表达载体分别导入致病疫霉中，待转化子长出后提取总RNA，经RT-qPCR检测共筛选出3个PiSAK1基因沉默菌株(S2、S3和S8)和3个基因过表达菌株(OE5、OE16和OE35) (图 5B)。其中，3个基因沉默菌株PiSAK1基因表达量为野生型菌株的47%−54%，3个基因过表达菌株PiSAK1基因表达量为野生型菌株的128%−180%。本实验选取了3个PiSAK1基因沉默菌株及一个PiSAK1表达量最高的过表达菌株(OE5)进行后续试验。
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| 图 5 大肠杆菌转化子鉴定及基因沉默菌株的PiSAK1表达量检测 Figure 5 Identification of Escherichia coli transformants and detection of PiSAK1 expression of gene silencing strains. A：大肠杆菌转化子菌落PCR鉴定. SAK1-S及SAK1-OE分别为基因沉默转化子和基因过表达转化子. M：DNA Marker；‒：阴性对照；+：阳性对照；1−15：不同大肠杆菌转化子. B：野生型及基因沉默菌株PiSAK1表达量检测. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: PCR identification of E. coli transformants. SAK1-S and SAK1-OE represent gene silencing transformants and gene overexpression transformants, respectively. M: DNA Marker; ‒: Negative control; +: Positive control; 1−15: Different transformants. B: PiSAK1 expression of wild type and gene silencing strains. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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将野生型致病疫霉菌株88069及PiSAK1基因沉默菌株、过表达菌株分别接种于黑麦-V8培养基上，待菌株生长7 d及14 d时分别测量菌落直径及孢子囊产量。试验结果表明，3个基因沉默菌株的菌落直径显著小于野生型菌株，其菌丝与野生型相比较稀薄；基因沉默菌株的孢子囊产量均显著下降，产量约为野生型菌株的10%−41% (图 6)。过表达菌株的菌落大小、形态与野生型菌株无明显差异，而过表达菌株的孢子囊产量则显著高于野生型菌株，为野生型菌株的221% (图 6)。以上结果说明，PiSAK1基因参与了病原菌的菌丝生长及孢子囊产生。
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| 图 6 PiSAK1基因沉默菌株的生长及孢子囊产量测定 Figure 6 Determination of growth and sporangium yield of PiSAK1 gene silencing strains. A：各菌株在黑麦-V8培养基上培养7 d的菌落生长状况. 标尺：1 cm. B：各菌株在黑麦-V8培养基下培养7 d后的菌落直径统计. C：各菌株在黑麦-V8培养基上培养14 d时的孢子囊产量. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: Colony growth status of each strain cultured on Rye-V8 medium for 7 days. Scale bars: 1 cm. B: The colony diameter statistics of each strain after 7 days of cultivation on Rye-V8 medium. C: The sporangium yield of each strain cultured on Rye-V8 medium for 14 days. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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为检测PiSAK1基因沉默、过表达后菌株对渗透压及氧化胁迫的敏感性，将野生型菌株、基因沉默菌株及过表达菌株分别接种于黑麦-V8培养基、含0.3 mol/L NaCl或3 mmol/L H2O2的黑麦-V8培养基上，培养7 d后统计各菌株的相对抑制率。结果显示，3个基因沉默菌株对NaCl及H2O2胁迫的敏感性均显著增强，基因沉默菌株的生长分别被抑制了65%−73%、38%−64%，抑制率显著高于野生型菌株(54%、20%) (图 7A、7B)。上述结果说明，PiSAK1基因在致病疫霉调控细胞渗透压平衡以及氧化胁迫应答方面发挥重要作用。
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| 图 7 PiSAK1参与渗透压胁迫及氧化胁迫应答 Figure 7 PiSAK1 is involved in osmotic pressure stress and oxidative stress response. A：0.3 mol/L NaCl胁迫下培养7 d后各菌株的相对抑制率. B：3 mmol/L H2O2胁迫下培养7 d后各菌株的相对抑制率. C：0.3 mol/L NaCl胁迫0.5 h后各菌株中PiGPD1的相对表达量. D：3 mmol/L H2O2胁迫0.5 h后各菌株中PiCAT2的相对表达量. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: The relative growth inhibition rates of each strain after 7 days of cultivation under 0.3 mol/L NaCl stress. B: The relative growth inhibition rates of each strain after 7 days of cultivation under 3 mmol/L H2O2 stress. C: The relative expression level of PiGPD1 in each strain after 0.5 h of 0.3 mol/L NaCl stress. D: The relative expression level of PiCAT2 in each strain after 0.5 h of 3 mmol/L H2O2 stress. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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细胞在受到高渗透压胁迫时会在细胞内合成并积累甘油等小分子可溶性物质，而甘油-3-磷酸脱氢酶1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, GPD1)基因就是甘油合成过程中的关键基因[22]。有研究报道，致病疫霉过氧化氢酶PiCAT2在细胞遭受氧化胁迫等非生物胁迫时起重要作用[23]。为进一步探究PiSAK1基因沉默、过表达对渗透压平衡及氧化胁迫应答相关基因的影响，本研究检测了PiSAK1基因沉默、过表达菌株在0.3 mol/L NaCl和3 mmol/L H2O2胁迫0.5 h后PiGPD1及PiCAT2的表达情况。试验结果表明，基因沉默菌株中PiGPD1及PiCAT2的表达被抑制，其表达量显著低于野生型菌株；而基因过表达菌株中PiGPD1及PiCAT2的表达量则显著高于野生型菌株(图 7C、7D)。这说明，沉默PiSAK1导致PiGPD1及PiCAT2表达量降低，进而使病原菌抵抗高渗透压胁迫和氧化胁迫的能力显著降低，而过表达PiSAK1则相反。该结果表明，PiSAK1通过影响PiGPD1及PiCAT2的表达量来调控病原菌对高渗透压胁迫和氧化胁迫的应答。
2.6 PiSAK1与病原菌致病力紧密相关将野生型菌株、基因沉默及过表达菌株在黑麦-V8培养基上培养14 d，分别收集各菌株的孢子囊制备成孢子囊悬浮。采用离体叶片接种法接种马铃薯Desiree叶片，4 d后测定叶片的病斑面积。结果表明，3个基因沉默菌株对马铃薯的致病性显著降低，基因沉默菌株引起的病斑面积相较野生型菌株减少54%−84%；基因过表达菌株的病斑面积则显著大于野生型菌株，其病斑面积相较野生型菌株增大31% (图 8)。该结果说明，PiSAK1基因的表达量与致病疫霉的致病能力相关，该基因在病原菌侵染马铃薯过程中发挥正调控作用。
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| 图 8 各菌株对马铃薯的致病力测定 Figure 8 Determination of pathogenicity of various strains to potatoes. A：各菌株孢子囊悬浮液侵染马铃薯Desiree叶片4 d后的发病情况. 标尺：1 cm. B：叶片病斑面积统计. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: Pathogenic status of Desiree leaves infected with sporangium of different strains for 4 days. Bar: 1 cm. B: Statistics of lesion area. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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病原菌侵染植物时，植物的先天免疫首先被激活，而活性氧迸发就是植物的先天防御反应之一。植物在病原菌侵染位点附近的细胞内积累大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，进而通过ROS降低病原菌的存活率。为了分析PiSAK1沉默、过表达菌株侵染植物时清除活性氧的能力，本研究利用DAB染色法对侵染叶片进行染色并观察侵染位点附近活性氧的积累情况。结果显示，PiSAK1沉默菌株侵染点附近的活性氧积累显著多于野生型菌株，而过表达菌株则刚好相反(图 9)。上述结果说明，沉默PiSAK1破坏了病原菌清除活性氧的能力，而过表达PiSAK1则提高了病原菌清除活性氧的能力。因此推测，PiSAK1通过调控病原菌侵染植物时清除活性氧的能力，进而影响病原菌的致病性。
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| 图 9 各菌株侵染位点处活性氧的测定 Figure 9 Determination of reactive oxygen species at the infection sites of each strain. A：各菌株孢子囊悬浮液侵染本氏烟叶片48 h后DAB染色情况. B：DAB染色后接种部位ROS积累量统计. 标记不同小写字母的组间差异显著(P < 0.05) A: DAB staining of Nicotiana benthamiana leaves infected with different strains for 48 h. B: Statistics of ROS accumulation at the inoculation site after DAB staining. Significantly different groups marked with different lowercase letters (P < 0.05). |
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致病疫霉是引起世界范围内马铃薯晚疫病大面积传播的首要原因，每年由马铃薯晚疫病引起的产量损失和管理成本高达100亿美元[24]。致病疫霉在侵染马铃薯的过程中会受到各种不利条件的刺激，病原菌如何克服外界不利影响并成功侵染马铃薯这一机制至今仍未被完全揭示。全面解析这一科学问题对研究病原菌的侵染机制、开发新的杀菌剂作用靶标意义重大。
SAPKs是一类胁迫激活的MAPK，在细胞抵御外界不良环境维持细胞内环境稳态方面有重要作用[25]。植物致病真菌SAPKs的相关研究比卵菌多，其功能具有差异性和多样性。前人研究报道显示，破坏SAPKs的功能会阻碍病原菌的生长发育、影响病原菌对外界不良环境的适应性以及减弱病原菌的致病力等[7-13]。有关植物病原卵菌中SAPKs的报道较少，本研究从致病疫霉中找到了一个SAPK，即PiSAK1。系统聚类分析表明，致病疫霉的SAPK与其他卵菌的SAPKs聚成一支，而与哺乳动物及真菌的SAPKs相距较远。本研究发现，在致病疫霉休止孢阶段、侵染马铃薯早期以及NaCl、H2O2胁迫刺激后PiSAK1的表达量均显著升高，说明PiSAK1在侵染马铃薯、调控高渗透压胁迫及氧化胁迫应答过程中起到重要作用。本研究进一步构建了PiSAK1基因沉默及过表达菌株，研究结果表明，PiSAK1沉默后菌株生长受限、无性孢子囊产量显著下降；而PiSAK1过表达菌株的生长与野生型菌株无显著差异，其无性孢子囊产量则显著高于野生型。此外，PiSAK1基因沉默菌株对NaCl及H2O2的敏感性显著增强，沉默菌株中PiGPD1及PiCAT2的表达被抑制，而PiSAK1过表达菌株则刚好相反。该结果提示PiSAK1在菌株生长发育、无性孢子囊形成及调控细胞胁迫应答方面发挥重要作用。致病性检测及活性氧清除能力检测结果表明，PiSAK1的表达量与病原菌的致病性、清除活性氧的能力紧密相关，沉默PiSAK1导致病原菌的致病性及清除活性氧的能力均显著降低，而过表达菌株则相反，说明该基因正调控病原菌的致病性。结合以上结果推断，PiSAK1的功能缺失影响了病原菌无性孢子囊、游动孢子及休止孢内的渗透压平衡，且病原菌无法很好地抵御植物的免疫屏障——活性氧暴发，因此病原菌无法正常侵染马铃薯，导致其侵染能力显著降低。
本研究从致病疫霉中找到了一个胁迫激活的丝裂原活化蛋白激酶，即PiSAK1。初步研究结果表明，PiSAK1对致病疫霉的生长发育、无性孢子囊产生、渗透压调节、氧化胁迫应答和病原菌致病性至关重要。该结果为后续开发新的杀菌剂作用靶标、选育马铃薯抗病新品种奠定了理论基础。
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