随着社会经济的快速发展，土壤酸化(pH < 6.5)日益严重，成为土壤退化的重要表现形式，引起了国内外研究者的广泛关注^[1]。目前，全球酸性土壤面积占陆地总面积的30%以上，我国酸性土壤约占领土总面积的22.7%^[2]。土壤酸化不仅降低了土壤肥力，而且削弱了土壤缓冲性能，导致土壤板结、生态系统退化，给我国农业生产和环境保护带来严峻挑战^[2-3]。土壤酸化过程进一步活化了重金属等有害物质，改变了土壤微生物群落结构及多样性，使得土壤酶活性和微生物生态功能受到抑制，从而影响元素的生物地球化学循环^{[2, 4-5]}。氨氧化作用是硝化作用的重要环节，其相关研究对推动氮素循环转化、调节土壤酸碱度、维持生态平衡和促进生态修复具有重要意义。20世纪以来，关于酸性土壤氨氧化过程的认识随着研究的深入发生了显著变化。研究者曾认为酸性土壤中不存在氨氧化过程^[6-7]，而氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)、氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和全程硝化菌(complete ammonia oxidizers, Comammox)的相继发现改变了研究者对氨氧化作用的认知。目前，关于酸性土壤氨氧化作用及其功能微生物对环境变化的响应仍缺乏全面的表述。因此，本文综述AOB、AOA和Comammox的氨氧化作用机制，讨论并总结细胞结构差异、土壤pH、底物浓度等因素对酸性土壤中氨氧化作用及其功能微生物群落结构和活性的影响，以期为补充完善土壤氮素循环机制提供参考。

1 氨氧化代谢途径

氨氧化作用是微生物将NH₃氧化为NO₂⁻的生物化学过程，作为硝化作用的限速步骤，其生态学研究在氮素生物地球化学循环过程中一直备受关注。氨氧化关键酶——氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)只能催化NH₃转化为NH₂OH，土壤pH值降低引起NH₄⁺和NH₃动态失衡，导致底物NH₃匮乏，AOB生长受到限制，因此传统观点认为，酸性土壤难以发生氨氧化作用^[8-9]。随着分子生物学技术的发展和研究的深入，研究者在多种类型酸性土壤中均检测到古菌氨氧化功能基因序列，不仅其丰度远高于细菌，而且在酸性土壤氨氧化过程中发挥主导作用^[9-10]。新发现的Comammox给氨氧化作用研究提供了新视角，并将其驱动NH₃转化为NO₃⁻的代谢过程称为全程硝化^[11]。生态学研究表明，AOB、AOA和Comammox通常共存于土壤生态系统中，但由于3种微生物细胞结构差异较大，而且对环境变化响应不同，导致它们对酸性土壤氨氧化作用的相对贡献也不同^[12-14]。

近年来，现代分子生物学技术的快速发展弥补了传统微生物学研究中大量微生物难以分离培养的不足，也为研究氨氧化微生物多样性、丰度及其生态功能提供了有效手段。例如，可以直接从环境样品中提取DNA或RNA进行amoA基因PCR扩增，再通过高通量测序、变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)和末端限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)分析环境中氨氧化微生物群落组成和多样性^[15]。稳定同位素核酸探针技术(DNA/RNA-based stable isotope probing, DNA/RNA-SIP)、宏基因组学和宏转录组学等方法也可以更全面地揭示氨氧化微生物生态功能和活性^[16-17]。传统分离培养和现代分子生物学技术相结合推动了氨氧化微生物及氨氧化作用的理论研究，丰富了研究内容，拓展了人们对全球氮素循环的认识。

1.1 氨氧化作用

虽然AOB和AOA都能独立完成氨氧化作用，但两者氨氧化功能酶的编码基因结构不同。首先，编码AMO的3个亚基(amoA、amoB、amoC)在AOB基因组中排列顺序是固定的(amoC、amoA、amoB)，在AOA基因组中AMO基因簇排列顺序则多种多样^[18-19]；而且与AOB amoB基因序列的较高可变度相比，amoB基因在AOA基因组中具有高度保守性，甚至可能存在第4种潜在亚基amoX^[20]。其次，AOB和AOA的AMO活性中心金属离子不同，AOB活性中心金属元素是Fe，而AOA活性中心金属元素是Cu^[19-21]。最后，AOA缺乏AOB所具有的编码羟胺氧化还原酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO)和细胞色素C的同源基因，但其具有大量的含Cu蛋白，可在功能上取代HAO和细胞色素C，使得AOA能够顺利完成氨氧化作用^{[18, 21]}。

AOB和AOA的氨氧化代谢过程也存在较大差异(图 1)。AOB有两种代谢途径，NH₃经AMO氧化为NH₂OH，NH₂OH在HAO催化作用下转化为NO₂⁻ (图 1A中①)或NO(图 1A中②)^[22-24]。当前，途径①已被证明是AOB主要的代谢过程，还需通过体内代谢组学结合转录组学研究证实AOB细胞内NH₂OH经NO转化为NO₂⁻的可行性(图 1A中②)。从图 1可知，AOA细胞内AMO可催化NH₃氧化为NH₂OH或HNO，启动NH₃氧化为NH₂OH的电子来源不同，表明AOA具有多种代谢途径(图 1B中①②③)^{[22, 24]}。Walker等强调了AOA细胞内NO和含Cu蛋白酶在氨氧化和电子传递过程中的重要性^{[19, 25]}；Vajrala等通过¹⁵N示踪试验研究发现NH₂OH是古菌氨氧化作用的直接产物^[26]，因此，以NH₂OH为中间产物的代谢过程(图 1B中②)可能是AOA的主要代谢途径。其次，NO在AOB和AOA氨氧化过程中的具体作用不同，AOB代谢过程中NO经ncyA基因编码的亚硝基蓝蛋白或nirK基因编码的亚硝酸还原酶(copper-dependent nitrite reductase, CuNIR)转化为NO₂⁻ (图 1A中②)，而NO则在AOA细胞内起传递电子的作用(图 1B中②)^{[22, 24, 27]}。最后，AOA在能量传递方面更加高效。AOA细胞内HNO₂经CuNIR还原生成的NO，可作为氧化还原中介体传递电子至AMO启动氨氧化反应，或以HNO为中间体无需电子再循环启动NH₃的氧化；而AOB细胞内电子需经醌池传递至AMO，驱动NH₃氧化成NH₂OH^[21-22]。

amoA作为AOB和AOA的功能标记基因，其基因表达水平和基因丰度调控着AOB和AOA代谢过程及它们对氨氧化作用的相对贡献。金属元素Cu是AOA代谢过程中关键蛋白酶发挥作用的辅助因子，酸性土壤中Cu生物可利用性较高，使得AOA细胞内AMO、CuHAO和CuNIR等含Cu酶的编码基因有效表达^[15]。此外，在有机质丰富的酸性土壤中，AOB细胞内编码HAO酶的hao基因丰度降低，而同时AMO酶的编码基因amoA基因丰度升高，更有助于AOA在酸性土壤中发挥竞争优势^[28]。在pH值为5.11−7.36的稻田土壤中，AOA amoA和AOB amoA基因比值为1.91−1 048^[29]。基于amoA基因的测序分析表明，AOA amoA和AOB amoA基因比值随着pH值(3.2−6.8)的降低而急剧增加，可见AOA amoA基因可在低pH条件下高效表达^[10]。然而，有研究者提出，Comammox的底物NH₃亲和力高于大多数AOB和AOA^[30]，而且偏好低氧环境^[31]，将来有可能挑战AOA在酸性土壤中的主导地位。

1.2 全程硝化作用

长期以来，研究者一直认为硝化作用是由氨氧化菌(AOB和AOA)及亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)联合完成。直至2015年，研究者对深油井和水产养殖系统中富集培养物的微生物宏基因组测序分析发现，存在一种微生物，其体内既有编码AMO和HAO的基因，也有编码亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase, NXOR)的基因，能够独立完成硝化作用全过程，将其命名为Comammox^[32-33]，这一突破性发现扩展了研究者对硝化作用的认知，并对完善氮循环机制具有重要意义。氨氧化微生物和全程硝化菌都含有氨氧化关键酶AMO和HAO，但其编码基因的种类、排列顺序和拷贝数均不相同，表明Comammox和AOB、AOA具有不同的氨氧化代谢过程(图 2)^[34-35]。目前已知的Comammox均属于硝化螺菌属谱系Ⅱ (Nitrospira cluster Ⅱ)，根据amoA基因的系统发育进一步分为clade A和clade B两个分支^[32]。研究发现，Comammox可将尿素分解为NH₃以供氨氧化微生物生长，而AOB和AOA氨氧化过程生成大量NO₂⁻，利于对NO₂⁻亲和力低的Comammox驱动亚硝酸盐氧化作用，三者之间可能存在着互利共生关系^[36-37]。在能量利用方面，相较于单独的氨氧化(ΔG°ʹ=−274.7 kJ/mol-NH₃)和亚硝酸盐氧化(ΔG°ʹ=−74.1 kJ/mol-NO₂⁻)，全程硝化(ΔG°ʹ=−348.9 kJ/mol-NH₃)可产生更大的能量^[32]。动力学研究结果显示，Comammox平均表观半饱和常数[K_m=(63±10) nmol/L-NH₃]比绝大多数的AOB和AOA更低，表明其具有更高的NH₃亲和力，可在底物匮乏条件下生长^[30]。然而也有研究指出，氨氧化微生物代谢能量耗损低、生长速率高，有利于以NH₂OH为中间产物的氨氧化过程顺利进行^{[30, 38-39]}。从土壤生态系统中Comammox分布情况及其生化特性的现有研究中可以发现，Comammox参与了酸性土壤硝化过程，但是否为氨氧化作用的优势微生物还有待进一步揭示。全程硝化过程具有代谢途径短、ATP合成效率高等特性，而且Comammox对NH₃亲和力高，今后必将成为全球氮素循环的重点研究课题之一。

2 酸性土壤中氨氧化微生物生态位分化的影响因素

AOB、AOA和Comammox是酸性土壤氨氧化过程的关键组成部分，评估它们对氨氧化作用的相对贡献大小，不仅需要考虑3种微生物细胞结构差异，还应结合土壤pH和底物浓度等环境因素变化^{[10, 40-41]}。本文从微生物内源功能差异和外部环境因素2个方面详细探讨了影响酸性土壤氨氧化微生物生态位分化的因素，明确了AOA在酸性土壤氨氧化代谢过程中的重要作用。

2.1 内源功能差异

AOA在细胞结构、底物亲和力及代谢方式上具有区别于AOB和Comammox的独特性质，因此，在酸性土壤中表现出更大的竞争优势，并能保持较高的功能活性。

2.1.1 独特的细胞结构

古菌具有区别于细菌的独特细胞膜脂质甘油二烷基链甘油四醚化合物(glycerol dialkyl glycerol tetraethers, GDGTs)^[42-43]。这种醚类脂结构结合紧密，使得古菌的单层脂质比细菌的双层脂质更稳定^[44]，不仅显著降低了细胞膜渗透能力^[42]、减少了无效离子循环和能量消耗、使古菌在能量传递方面占据优势^[45]，而且有助于古菌在极端酸性环境中保持更高的化学稳定性^{[42, 44]}。此外，AOA还具有表层蛋白和杂多糖等多样的细胞壁结构，增加了细胞结构的稳定性^[46-47]，为AOA在极端环境中生存并驱动氨氧化作用提供了良好的胞内环境。

2.1.2 pH自我调节机制

古菌细胞膜中的醚键比细菌的酯键耐酸性更强，其GDGTs质子渗透性低，使得酸性环境中质子通过渗透压平衡进入细胞内部更困难^{[42, 44]}。而且AOA通过基因水平转移获得的V型ATP酶更适应极端环境胁迫，可将大量质子泵出细胞外以维持胞内pH稳态，有助于AOA适应极端酸性环境^{[40, 48]}。最近发现的嗜酸性古菌Candidatus Nitrosotalea devanaterra和Picrophilus oshimae的基因组研究表明，古菌中含有多种阳离子转运蛋白^[14]，有助于道南电势抑制H⁺流入，维持细胞内外pH平衡^[48]。

2.1.3 较高的底物亲和力

Comammox clade A和Betaproteobacteria的AOB具有相似的低亲和力Rh型氨转运蛋白，倾向于在中性或碱性条件下发挥作用^[49]；而Comammox clade B和AOA具有高亲和性Amt型氨转运蛋白^{[14, 34, 50]}，在酸性条件下能够更好地发挥功能优势。Qin等研究发现，Amt氨转运蛋白包括低亲和力和高亲和力的氨转运蛋白，随着NH₃浓度降低，低亲和力转运蛋白表达量下降，而高亲和力转运蛋白表达量则随之增加^{[40, 51]}。除此之外，大多数AOA细胞体积比AOB小10−100倍，因此AOA具有更大的比表面积，在底物利用方面占据竞争优势^{[42, 45]}。

2.1.4 多样的代谢方式

在酸性土壤中，尿素水解曾被认为是AOB应对底物匮乏的一种代谢机制，但最新研究发现，AOA和Comammox不仅能够利用尿素作为能量来源，AOA还可以利用氰酶降解氰酸盐为NH₃，驱动土壤氨氧化过程^{[36, 38, 52]}。

2.2 外部因素影响

土壤环境复杂多变，氨氧化微生物群落组成和多样性还受到pH、底物浓度、温度和重金属含量等外部环境因素影响。

2.2.1 土壤pH

AOB、AOA和Comammox对酸性环境适应能力不同，pH成为氨氧化微生物生态位分化的关键因素^{[12, 53]}。不同酸化程度的菜地土壤(pH值为3.97、4.82、6.07、7.04)，AOA amoA基因丰度比AOB高2−5个数量级，而且AOA和AOB相对丰度随土壤pH值增加分别呈下降和上升的趋势^[54]。土壤pH值为3.2−6.8时，林地土壤中AOA amoA基因丰度和表达活性均随土壤pH值降低而升高；当pH值降至最低时，AOA与AOB的amoA基因表达丰度比值达到最大^[10]。自发现以来，研究者在多种类型酸性土壤中均检测到Comammox，但其amoA基因表达丰度大多低于AOA和AOB，Wang等^[12]和Huang等^[55]研究结果充分支持了这一现象。在连续施肥29年的酸性(pH 4.38−6.52)土壤中，AOA amoA基因表达丰度显著高于Comammox且与硝化活性呈显著正相关，表明AOA是酸性土壤硝化作用的主要贡献者^[12]。王智慧等通过宏基因组测序分析发现，AOA在酸性土壤中的相对丰度(4.839%)高于中性土壤(3.731%)和碱性土壤(0.245%)，约占酸性土壤氨氧化功能微生物总量的82.9% (P < 0.05)，明显高于AOB (5.2%)和Comammox (0.5%)^[13]。这与其他研究者发现AOB、Comammox分别在碱性土壤和中性土壤中占优势地位互为补充，共同阐释了AOB、AOA和Comammox对土壤pH的不同响应^{[7, 13]}。

此外，土壤pH还影响氨氧化微生物群落结构。功能基因amoA系统发育分析表明，酸性土壤和中性弱碱性土壤中AOA的主要功能类群分别为Nitrosotalea (或group1.1a-associated)和Nitrososphaera (或group1.1b)^{[9, 56-57]}。而AOB菌群Nitrosomonas主要在中性土壤或碱性土壤中占主导，Nitrosospira cluster 2则更偏好酸性土壤^[58-59]。李文兴等研究发现，AOA类群Nitrososphaera也可能是酸性土壤氨氧化作用的重要驱动者^[57]，充分体现了酸性土壤氨氧化过程的复杂性和氨氧化微生物的多样性。Comammox群落组成也受到土壤pH的显著影响。森林、草地和农业土壤(pH值为4.37−9.48)中clade A和clade B分别占Comammox种群的71.5%和28.4%^[60]，这一差异在长期施肥的酸性农田土壤中更加明显，clade A与clade B amoA基因表达丰度比值约为1.05−88.41^[12]。但也有研究指出，酸性马尾松林土壤中Comammox主要类群为clade B (64%)，clade A仅占36%^[61]。由于Comammox发现时间较短，存在研究方法不完善、研究内容不充分等问题，因此，酸性土壤中Comammox优势类群及其对氨氧化作用的相对贡献仍需进一步研究揭示。

2.2.2 底物浓度

作为氨氧化作用的直接底物，NH₃浓度会直接影响土壤氨氧化微生物活性和氨氧化速率。目前，Comammox的研究大多集中在淡水^[62]、沉积物^[63]、饮用水和废水处理系统^[64-65]等中性或偏碱性水生生态系统中^{[33, 66]}，酸性环境尤其是酸性土壤Comammox和氨氧化菌对底物的竞争作用尚不明确，但底物亲和力在AOA和AOB竞争中起着至关重要的作用。酸性土壤中过量的H⁺使NH₃转化为NH₄⁺，导致底物NH₃浓度降低，AOA细胞内Amt高亲和力转运蛋白有效表达，使得AOA底物亲和力更高，成为低浓度NH₃酸性土壤中氨氧化作用的重要驱动者^[40]；而AOB则因底物亲和力较低而无法在低浓度NH₃酸性土壤中正常生长代谢，更适合在高NH₃条件下发挥作用^{[18, 67]}。有研究发现，AOA氨氧化活性受抑制的最低底物浓度为2−20 μmol/L-NH₃，而AOB正常代谢的底物抑制浓度较高，为39−4 500 μmol/L-NH₃^[67]。AOA在低、中和高底物浓度下均可生长，但在高底物浓度环境中硝化潜力较弱；当底物浓度降低时，AOA硝化潜势升高，AOA/AOB比值也较高^{[41, 55]}。Lu等发现茶园土壤(pH值为3.75)和森林土壤(pH值为5.40)中NH₃浓度为纳摩尔水平，不足以支持AOB驱动氨氧化，而AOA amoA基因丰度与NO₃⁻浓度呈显著正相关^[68]，表明AOA是这两种酸性土壤氨氧化作用的主要贡献者。苏瑜等发现，湿地土壤(pH 6.03)中高浓度氨氮(32.58 mg/kg)抑制了AOA活性，AOB主导了该生境中氨氧化作用，而低氨氮含量(5.09 mg/kg)的农田土壤(pH 4.42)氨氧化作用则由AOA主导^[69]，进一步证明了底物浓度显著影响了氨氧化微生物生态位分异及其对氨氧化作用的相对贡献。

我国酸性土壤中有机质含量丰富，有机质矿化可持续产生低浓度NH₃，不但可以满足氨氧化微生物生长需求，也是氨氧化作用底物NH₃的主要来源^[70-71]。与AOB相比，AOA更加适应有机质矿化缓慢释放NH₃的过程，而且矿化微生物可与AOA紧密结合，将矿化产生的NH₃直接转运到AOA细胞内减少能量消耗，有助于AOA在酸性条件下发挥功能优势^[67]。

2.2.3 其他因素

氨氧化微生物生态位分异及其对氨氧化作用的贡献大小不仅取决于土壤pH和底物浓度，还受到温度、土地利用方式、重金属含量等其他因素的间接影响。

温度是影响氨氧化作用及其功能微生物的环境因子之一，通过改变底物有效性和酶活性间接影响氨氧化微生物的活性、群落结构和丰度。AOB大多为中温菌，其适宜生长温度为20−30 ℃；AOA具有结构紧密的甘油四醚脂结构，细胞膜稳定，膜流动性和质子渗透能力弱，受温度影响较小，因此能在更广的温度范围内保持活性并驱动氨氧化作用^[72-74]。Zeng等通过微宇宙培养试验探讨了不同温度(15、25、35 ℃)对湖泊沉积物中AOA和AOB丰度的影响，发现AOA amoA基因丰度与温度呈正相关，而AOB的amoA基因丰度与温度呈负相关^[73]。AOA广泛存在于酸化程度不同(pH值为2.5−7.0)的陆地温泉(38−97 ℃)中，但高温热泉中(> 80 ℃)未检测到AOB的存在^[74]。虽然AOA在高温条件下不会大量繁殖，但温度升高会加速其代谢过程，使得AOA在极端温度条件下仍可保持较高的功能活性^[75]。例如，腾冲地热田(温度50−90 ℃、pH值为1.8−9.3)中AOA相对丰度和活性与温度呈正相关，而且NO₂⁻含量呈指数增加，表明AOA主导了该高温生境的氨氧化作用^[75]。

酸性土壤在全球广泛分布，多种多样的土地利用方式导致土壤理化性质发生改变，从而对氨氧化微生物丰度、群落组成和活性也产生了较大影响。氨氧化微生物类群对土地利用方式的响应也不同。He等通过qPCR方法探究了5种类型土壤(农田、草地、灌木林、过渡地和林地，pH值为4.99−6.50)中的氨氧化微生物丰度，发现农田土壤中AOB丰度显著高于其他类型土壤，而农田土壤中AOA和Comammox amoA基因表达量则显著低于其他类型土壤^[76]。森林和农田土壤中氨氧化作用主要由AOA group1.1a-associated驱动完成，AOB Nirtosospira cluster 1和Nirtosospira cluster 2的相对丰度则分别在退耕还林土壤和耕地农田中最高^{[72, 77]}。氨氧化微生物在茶园土壤(pH值为3.6−6.3)中底物半饱和常数比森林土壤(pH值为3.2−6.8)更低，可快速达到底物饱和状态，具有更高的硝化活性^[78-79]。

人类活动导致土壤重金属污染愈加严重的同时，也间接影响了土壤氨氧化活性及氨氧化微生物群落组成^[80-81]。AOA具有独特的细胞膜结构和金属抗性基因，能够制约重金属离子透过细胞膜，缓解重金属胁迫，功能活性较AOB和Comammox更加稳定^{[25, 42, 44]}。随着土壤Cu含量(0−800、0−1 600、0−2 400 mg/kg)增加，我国17种典型土壤(pH值为4.93−8.90)潜在氨氧化速率逐渐降低^[80]。在重金属(Cu、Zn、Cd、Cr)含量丰富的铁矿区内，AOA和AOB丰度与氨氧化潜势均有明显相关性(r=0.672，P < 0.01；r=0.541，P < 0.05)，AOA的相关性更显著^[81]。此外，Cu浓度升高可能诱导AOA细胞内Cu抗性基因copC和copD高效表达，不仅能够将Cu转运至细胞外，还可将其螯合物固定在细胞内，减轻重金属的毒害作用^[25]。

3 结论与展望

氨氧化微生物是土壤氮素循环的重要组成部分。人类活动和气候条件变化导致土壤酸化加剧，不仅严重影响了土壤生态系统的结构与功能，还改变了土壤氨氧化作用。探究酸性土壤氨氧化过程中影响AOB、AOA和Comammox相对丰度、群落结构和活性的关键因素，分析其相对贡献，对完善酸性土壤氨氧化作用机制具有重要意义。与AOB和Comammox相比，AOA具有独特的细胞结构、pH自我调节机制、多样的代谢方式和较高的底物亲和力等特性，在酸性土壤氨氧化过程中具有更大的竞争优势，发挥着主导作用。

氨氧化代谢机制及其微生物群落结构具有多样性和复杂性，相关研究虽已证实AOB、AOA和Comammox均参与酸性土壤氨氧化过程，AOA是氨氧化作用的重要驱动者。然而，因AOB和AOA具有多种代谢途径，两者在酸性土壤中的主要代谢途径尚不明确。此外，Comammox发现时间短，酸性土壤中Comammox活性、群落结构和作用机制等相关研究不充分，尚不能完全推断出Comammox对酸性土壤氨氧化作用的相对贡献。因此，在今后的研究中，可利用微生物富集培养结合现代分子生物学技术，进一步揭示AOB、AOA和Comammox的代谢过程差异，对完善酸性土壤氨氧化作用机制具有十分重要的意义：(1) 进一步明确酸性土壤中AOA代谢途径及其影响机制，探究如何提升其氨氧化速率；(2) 与氨氧化微生物相比，全程硝化菌具有哪些竞争优势，在哪些生境中主导氨氧化作用；(3) 明确酸性土壤中占据优势地位的Comammox类群及其作用机理。