新疆野果林在我国主要分布在伊犁和塔城地区，有新疆野苹果(Malus sieversii)、野杏(Armeniaca vulgaris)、野生樱桃李(Prunus cerasifera)等野生果木资源60余种，为栽培果树的原始祖先，是天然的果树种质资源基因库，也是我国生物多样性保护中的重要群落类型之一^[1-5]。近年来，受人类活动、气候因素、病虫害等多种因素影响，新疆野果林大面积衰退甚至死亡，生态环境受到毁灭性的危害，造成大量优质种质资源和基因资源的严重损失^[6-7]。苹果腐烂病被称为苹果树的“癌症”，其分布范围广、危害程度高，主要侵害苹果的枝干和果实，使苹果树皮腐烂，果实产量和品质大幅下降，病害严重时会出现毁园现象，且极难防治^[8-10]。随着苹果小吉丁虫在野果林的扩散，苹果腐烂病的发生危害逐年加重^[11]，因此，苹果腐烂病的防治对新疆野果林的保护具有极为重要的意义。通常果园管理不能彻底清除腐烂病病原菌，而化学药剂很难直接杀死病原菌，并且病原菌会产生抗药性，防治效果逐渐降低，而长期依靠化学药剂防治可致果园生态环境恶化，果实品质下降，甚至可能引起食品安全问题^[12-13]，因此，如何安全、高效地防治苹果腐烂病已经成为亟待解决的问题。

植物内生细菌是一类生活在植物组织内且不会对宿主植物造成伤害的微生物，多数情况下它们可以直接或间接地保护和促进宿主植物的正常生长^[14-15]。药用植物内生细菌不仅能产生与寄主植物相同或相似的化合物，还能产生一些新的次级代谢产物，是一类宝贵的内生菌资源库^[16-17]。目前，已有研究从牛至、剑麻、丹参、曼陀罗等药用植物中分离筛选出对苹果腐烂病病原菌有较好抑菌作用的内生细菌^[18-20]。因此，本研究对新疆野果林苹果腐烂病进行分离、筛选及鉴定，同时利用实验室现有药用植物内生细菌筛选对苹果腐烂病病原菌有抑菌效果的功能菌株，以期为新疆野果林苹果腐烂病的生物防治提供研究材料和理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品

腐烂病病枝样本主要采自新疆伊犁新源县野果林和塔城额敏县野果林。

1.1.2 供试菌株

药用植物阿魏(57株)、黑果枸杞(36株)和甘草(83株)的内生细菌共计176株及苹果腐烂病标准菌株(Valsa malicola, Vmc2)均由中国科学院新疆生态与地理研究所极端环境微生物资源与生态功能研究团队提供。苹果腐烂病致病菌Valsa mali (Vm)和Valsa malicola (Vmc1)由本实验分离获得。

1.1.3 培养基和主要试剂、仪器

本实验采用的培养基为PDA和ISP2培养基^[21]。头孢噻肟钠和真菌基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix和50 bp DNA Ladder，北京天根生化科技有限公司。洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱，上海天呈实验仪器制造有限公司；PCR仪和电泳仪，Bio-Rad公司；数字凝胶成像分析系统，柯达公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理

在新疆伊犁新源县野果林和塔城额敏县野果林中，采集具有典型腐烂病病斑的枝条，用枝剪剪成约10−15 cm的小段带回实验室，4 ℃保存备用。

1.2.2 腐烂病病原菌的分离、纯化与保藏

取样本枝条，在超净工作台中切取病健交界处去皮后5 mm×5 mm左右的组织块。将切好的组织块用75%酒精消毒1 min，接着用无菌水漂洗3次后移至准备好的PDA (含头孢噻肟钠100 µL/mL)培养基上，每个平板接5个组织块于25 ℃培养。观察菌落长出后挑取边缘菌丝，进行菌株纯化和将纯化后获得的分离株保存在试管PDA斜面上，放置在4 ℃冰箱中储存备用。

1.2.3 病原菌形态观察

将分离纯化的菌株接种于PDA平板上，置于25 ℃暗培养，观察并记录分离菌株的菌落形态、颜色、质地等性状。

1.2.4 腐烂病病原菌的分子生物学鉴定

用真菌基因组DNA提取试剂盒提取纯化病原菌的DNA。用苹果腐烂病菌属专化型引物对VF/VR和种专化型引物对VmF/VmR、VmcF/VmcR和VpF/VpR进行巢式PCR^[22]，引物序列见表 1。PCR反应体系(25 µL)：模板DNA (50 ng/µL) 1 µL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，ddH₂O补足25 µL。第一轮扩增引物对用VF/VR。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，64.7 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，挑取有特异性条带的PCR扩增产物作为第二轮扩增的模板。第二轮扩增分别以VmF/VmR、VmcF/VmcR和VpF/VpR为引物对。VmF/VmR引物对的PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，64.3 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，34个循环；72 ℃ 10 min。VmcF/VmcR和VpF/VpR引物对的PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55.3 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，34个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用凝胶成像仪观察并记录编号。根据编号找到对应纯化病原菌的DNA，以ITS1/ITS4为引物对进行PCR扩增，扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序并做拼接处理，将获得的序列提交到GenBank数据库，通过BLASTn进行在线比对，完成分离病原菌的初步鉴定。

1.2.5 三种药用植物内生细菌对苹果腐烂病病原菌的抑菌效果

采用平板对峙法筛选抗苹果腐烂病病原菌的菌株。用ISP2平板培养基活化3种药用植物内生细菌，活化出的菌株在PDA平板上传代培养。用接种环挑取内生细菌点接在距平板中央2.5 cm处的8个点上，将苹果腐烂病菌接种在PDA平板中央，以仅接病原真菌的平板为空白对照。25 ℃恒温培养5 d后，观察内生细菌的抑菌效果，挑取有抑制作用的内生细菌菌株进行复筛。用接种环挑取内生细菌均匀接在距平板中央2.5 cm处的4条3 cm长的线上，将苹果腐烂病菌接种在PDA平板中央，以仅接种病原真菌的平板为空白对照。25 ℃恒温培养5 d后，测量病原菌生长半径，按公式计算内生细菌的相对抑菌率。抑制率=[(对照菌落直径−0.5 cm)−(处理菌落直径−0.5 cm)]/(对照菌落直径−0.5 cm)×100%。

2 结果与分析 2.1 新疆野果林苹果腐烂病病原菌分离鉴定结果

2.1.1 腐烂病病原菌分离结果

从伊犁野果林中野苹果树、野杏树、野山楂树和野梨树上采集114枝带病斑枝条，从中分离获得171株真菌；从塔城野果林的苹果树上采集25枝带病斑枝条，从中分离获得63株分离株，分离结果如表 2所示。

2.1.2 苹果腐烂病病原菌分子鉴定结果

通过苹果腐烂病种属专化引物对234株分离菌株进行快速检测，挑选出44株有特异性条带的真菌进行ITS基因序列测定，通过BLASTn进行在线比对，完成分离病原菌的初步鉴定。如图 1所示，这44株菌分别属于Valsa、Alternaria、Clavariopsis、Monilinia、Mucor、Rhizopus、Dothiorella、Gibberella、Microsphaeropsis、Peniophora 10个属，其中Valsa占的比例最高，为61.36%，表明本实验所用种属专化引物对苹果腐烂病病原菌具有很高的灵敏性，可以通过该种属专化引物对所分离的病原菌进行快速地筛选，从而缩小鉴定范围。从新源县野果林野苹果枝条中分离出15株Valsa malicola和2株Valsa mali，野梨树树枝上分离出1株Valsa malicola，表明Valsa malicola不仅可以侵染野苹果树，还可以侵染野梨树。在塔城额敏县野果林分离出9株Valsa malicola，表明Valsa malicola已经侵染了额敏县野果林的野苹果树(表 3)。

2.2 三种药用植物内生细菌抗苹果腐烂病病原菌结果分析

2.2.1 阿魏内生细菌抗腐烂病病原菌结果分析

采用平板对峙方法从57株阿魏内生细菌中筛选对苹果腐烂病病原菌有抑菌效果的菌株，共筛选到12株对苹果腐烂病病原菌有抑制作用的菌株，筛选结果如表 4所示。具有抑制作用的菌株分布在Acinetobacter、Bacillus、Micrococcus、Sphingomonas 4个属中。筛选到4株对菌株Vm (Valsa mali)、Vmc1 (Valsa malicola)、Vmc2 (Valsa malicola标准菌株)均有抑制作用的菌株且均为Bacillus。

2.2.2 黑果枸杞内生细菌抗腐烂病病原菌结果分析

从36株黑果枸杞内生细菌中共筛选到10株对苹果腐烂病菌具有抑菌效果的菌株，筛选结果如表 5所示。10株菌株中Bacillus占8株，Bacillus sp. GQ24、GQ26、GQ27、GQ29等4株菌对菌株Vm、Vmc1、Vmc2均有抑制作用，其中菌株Bacillus sp. GQ24的抑菌效果最好，对Vm、Vmc1、Vmc2的抑菌率分别为70.93%、62.26%和77.72%，而Rhodococcus sp. GQ30和Enterobacter sp. GQ13仅对Vmc2具有抑制作用。

2.2.3 甘草内生细菌抗腐烂病病原菌结果分析

从83株甘草内生细菌中共筛选出70株具抑菌效果的菌株，筛选结果如表 6所示。有55株对Vm、Vmc1、Vmc2均有抑制作用，分布在Bacillus、Brevibacterium、Pantoea、Achromobacter、Dietzia、Microbacterium、Micromonospora、Mycobacterium 8个属中，其中Bacillus所占比例最高，为80% (图 2)。虽然Bacillus所占比例最高，但Brevibacterium和Pantoea的平均相对抑菌率均高于Bacillus。菌株Brevibacterium sp. GC56对Vm和Vmc2的抑菌效果最强，相对抑菌率分别为77.96%和85.27%；菌株Pantoea sp. GC40对Vmc1的抑菌效果最强，相对抑菌率为73.18%，同时也是唯一相对抑菌率均在70%以上的菌株。相较于阿魏和黑果枸杞内生细菌菌株筛选结果，甘草内生细菌的抑菌效果更佳且拮抗菌株的种类更多，表明甘草中蕴含着较为丰富的抗苹果腐烂病病原菌的微生物资源。

3 讨论与结论 3.1 新疆野果林苹果腐烂病病原菌分离、鉴定结果讨论

本研究对采自伊犁新源县和塔城额敏县139枝带病斑枝条进行分离获得234株分离菌株，经筛选鉴定出27株苹果腐烂病病原菌，有25株为Valsa malicola，初步认为Valsa malicola为2个野果林苹果腐烂病的优势种。Seifollahi等^[23]从欧洲酸樱桃、山楂树、李子树等6种果树中均分离出Valsa malicola，表明Valsa malicola的寄主具有多样性。目前已从新源县野梨树上分离出Valsa malicola，因此对苹果腐烂病的防治不仅仅局限在对苹果树上，其他树种同样也需要预防该病害的发生。

受环境条件和寄主植物等因素的影响，完全依靠传统的形态学鉴定方法很难准确鉴定出各种腐烂病菌的种类^[24]，因此，本实验采用苹果腐烂病种属专化引物对所分离的真菌进行快速筛选，最后通过ITS序列分析完成腐烂病菌的分子鉴定。臧睿以分离苹果腐烂病出现频率较高的菌为对照，以此检验所设计苹果腐烂病种属专化引物的特异性^[22]，而本实验的鉴定结果表明该苹果腐烂病种属专化引物在实际应用中还是会受到Alternaria和其他菌属的干扰。虽然本实验采用的种属专化引物并未完全达到对苹果腐烂病的专一特异性，但该方法在一定程度上降低了鉴定的成本，同时保证了数据的准确性，在快速筛选鉴定苹果腐烂病上具有一定的参考价值。

3.2 三种药用植物内生细菌抗菌活性结果讨论

本研究采用平板对峙法从176株药用植物内生细菌中筛选出92株具有抑菌效果的菌株，其中63株对3株苹果腐烂病均有抑制作用，而这些菌株大多数为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。植物内生芽孢杆菌在植物中广泛存在，具有能促进宿主植物生长、抗病虫害和抗逆等作用，在生物防治、环境修复、医药等方面也具有应用潜力^[25]。除芽孢杆菌外，菌株Brevibacterium sp. GC50、GC55、GC56和Pantoea sp. GC40均具有较高的抑菌活性，而这些菌属在番茄枯萎病的防治上同样发挥着作用^[26-27]。因此，本实验筛选出的拮抗菌株不仅在新疆野果林苹果腐烂病的生物防治上有很大的应用前景，同时也丰富了生物防治的菌种资源，为药用植物内生细菌的开发利用奠定了基础。另外，我们实验室已从百里香、藜、牛至等药用植物中筛选出对苹果腐烂病病原菌具有较好抑菌效果的内生细菌。百里香内生细菌Streptomyces polyantibioticus T4SB028对Valsa malicola和Valsa mali的抑菌率分别为64.20%和70.55%^[28]，藜内生细菌Bacillus siamensis S1-20对Valsa mali的抑菌率为73.33%^[29]。从牛至中分离的Streptomyces sp. EGI 125对Valsa mali的抑菌率最高达81.90%，但在牛至中具有抑菌功能的内生细菌仅分布在Bacillus和Streptomyces这2个属中^[19]。本实验从甘草中筛选出对腐烂病病原菌有抑制作用的菌株分布在Bacillus、Brevibacterium、Pantoea、Achromobacter、Dietzia、Microbacterium、Micromonospora、Mycobacterium这8个属中，其中Brevibacterium sp. GC56对Valsa mali和Valsa malicola的相对抑菌率分别为77.96%和85.27%，因此，经比较以上研究报道及本文3种植物，甘草内生细菌对苹果腐烂病病原菌的总体抑菌效果更好。研究表明，从甘草植物中检测出的化学成分多达400余种，黄酮类和三萜类化合物为其主要成分^[30]，而药用植物内生菌能够合成和宿主植物相同或相似的化合物^[31]，因此推测甘草内生细菌具有较好的抑菌效果，可能与甘草中某种化学成分有关，本实验筛选的有抑菌效果的药用植物内生细菌的具体抑菌机制还需要进一步探究。