十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether, BDE-209)作为目前用量最大的溴代阻燃剂(brominated flame retardants，BFRs)，被广泛应用于塑料制品、建筑材料、电气产品等行业中^[1]。不恰当的拆解处置很容易导致这些产品中的BDE-209释放到环境中，在大气、水、土壤、沉积物甚至鱼类、母乳等环境介质中均检测到其存在^[2-4]。然而，作为持久性有机污染物，BDE-209因其难降解性、致癌性和神经毒性，对生态环境及生物体造成的严重危害日益受到重视^[5]。因此，开发有效、环境友好的处理技术将BDE-209从环境中去除具有重要意义。

释放到环境中的BDE-209可以通过零价铁还原^[6]、光催化氧化^[7]、高级氧化还原^[8]和微生物降解^[9]等方法去除。与其他方法相比，微生物降解作为一种高效、环保和低成本的技术，被认为是一种很有前景的修复策略。研究表明，无论在厌氧还是好氧条件下，微生物都能降解BDE-209^[10]。Gerecke等^[11]发现，BDE-209在厌氧消化池中反应238 d后浓度仅降低了50%，并且最终转化为毒性更大的低溴代联苯醚同系物。与厌氧微生物降解相比，BDE-209可以被好氧微生物迅速矿化成小分子化合物，大大缩短了降解时间且不易产生二次污染^[12]。然而，目前可用于BDE-209好氧降解的微生物资源仍十分有限，因此，需要从环境中分离出更多有效的降解菌株。近年来，关于BDE-209生物降解的研究大多集中于土壤、沉积物等环境介质中的BDE-209的厌氧降解^{[9, 13]}，但可用于水相中BDE-209好氧降解的微生物资源仍十分有限，因此，迫切需要从环境中分离出更多有效的好氧降解菌株，为BDE-209污染环境的生物修复提供技术支持。

有机污染物的微生物降解过程受多种因素的影响，如外加碳源、环境条件、共存有毒物质等。其中，重金属的影响尤为重要，因其毒性可能会影响微生物的生长繁殖，进而影响有机污染物的生物降解效果^[14]。在电子垃圾处理过程中，伴随着BDE-209的释放，Cu、Cd、Pb等多种重金属常同时被释放到环境中^[15]。目前，镉是汽车和化学工业等所产生废弃物中释放最普遍的污染物之一，也是环境中与BDE-209共存最丰富的重金属之一^[16]。因此，研究Cd²⁺对BDE-209微生物降解的影响，对于开展多溴联苯醚-重金属复合污染的研究具有重要意义。

本研究从活性污泥中分离出一株对BDE-209具有良好降解能力的好氧细菌，并通过降解条件的优化和最适外加碳源的选择，以及细胞表面疏水性和降解产物的分析，揭示BDE-209的微生物降解特性及其降解机理，同时也对Cd²⁺浓度对BDE-209微生物降解和细菌生长的影响进行初探，以期为溴代阻燃剂污染环境的生物修复提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品

菌株来源：从合肥市王小郢污水处理厂的活性污泥中分离有效降解菌株。

1.1.2 培养基

液体富集培养基采用的是LB液体培养基^[17]。

固体富集培养基：LB培养基加琼脂20.00 g/L。

无机盐培养基(minimal salt medium, MSM) (g/L)：KH₂PO₄ 2.65，Na₂HPO₄·12H₂O 4.26，MgSO₄·7H₂O 0.20，CaCl₂ 0.02，NaCl 0.50，NH₄Cl 0.50，微量盐溶液2 mL，自然pH。

微量盐溶液(g/L)：CuSO₄·5H₂O 0.03，FeSO₄·7H₂O 2.10，MnSO₄·H₂O 0.06，ZnCl₂ 0.07，CoC1₂·6H₂O 0.19。

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS) (g/L)：KH₂PO₄ 0.24，Na₂HPO₄ 1.44，NaCl 8.00，KCl 0.20，pH 7.40。

1.1.3 主要试剂和仪器

BDE-209 (纯度 > 99%)、葡萄糖、苯酚、柠檬酸钠，阿拉丁试剂公司；蛋白胨、酵母粉、琼脂，美国Sigma公司；KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂、NaCl、NH₄Cl、NaOH、CuSO₄·5H₂O、FeSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、ZnCl₂、CoC1₂·6H₂O、KCl，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷、正己烷和四氢呋喃，Tedia公司；Cd²⁺标准溶液，国家有色金属研究院。

电子天平、纯水仪和高压蒸汽灭菌锅，上海邦沃仪器设备有限公司；高速冷冻离心机、恒温振荡培养器和紫外分光光度计，上海赫尔普国际贸易有限公司；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BDE-209降解菌的分离纯化

取100 mL活性污泥静置30 min后，取5 mL上清液加入装有50 mL LB液体培养基的150 mL锥形瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下培养72 h后，取2.5 mL培养液加到含5 mg/L BDE-209的MSM中进行振荡培养，培养体系总体积为20 mL。每72 h重复一次上述操作，并逐步提高培养基中BDE-209的初始浓度，其浓度梯度设定为5、10、20、30、40、50、60 mg/L。

取驯化最后1个周期的培养液1 mL，用无菌水将培养液按10倍稀释法作梯度稀释，取0.1 mL稀释后的培养液均匀涂布于含60 mg/L BDE-209的固体LB培养基上，并于30 ℃恒温培养。待培养基上长出单菌落后，挑选具有明显形态特征的单菌落，采用划线分离法将其反复纯化5−7次，并对不同形态的单菌落进行编号。将初筛所得各菌株分别接种于装有50 mL富集培养基的锥形瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下富集培养24 h，取2 mL菌液接种于BDE-209初始浓度为10 mg/L的MSM中进行复筛实验。培养120 h后用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定体系中剩余BDE-209浓度，计算生物降解率，以此为依据挑选降解效果最好的菌株，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行分子生物学鉴定。

1.2.2 菌悬液的制备

将菌株接种于含有50 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下培养24 h后以8 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用适量PBS冲洗菌体2次，收集菌体，用PBS重悬成OD₆₀₀为0.5的菌悬液，用于后续的微生物降解实验。

1.2.3 BDE-209降解条件的优化

采用三因素五水平L₂₅ (5³)的正交实验确定BDE-209的最适微生物降解条件。正交试验设计如表 1所示。将BDE-209溶于二甲基亚砜配制成浓度为10 000 mg/L的母液，取20 μL上述溶液加到已灭菌的MSM中，并接种适量菌悬液，使降解体系总体积为20 mL，BDE-209的初始浓度为10 mg/L。按照表 1中的试验设计进行降解实验，以含相同浓度BDE-209但不接种的MSM为空白对照，降解120 h后取样测定BDE-209的剩余浓度，计算其生物降解率。根据正交试验的结果确定BDE-209的最优降解条件。

1.2.4 不同外加碳源条件下的BDE-209降解实验

在BDE-209初始浓度为10 mg/L的MSM中分别加入酵母粉、葡萄糖、苯酚和柠檬酸钠，使其在降解体系中的浓度均为250 mg/L，以含BDE-209但不外加碳源的MSM作为对照进行微生物降解实验。降解120 h后取样测定BDE-209的剩余浓度，计算BDE-209的生物降解率，并结合菌体生长量确定最适外加碳源的种类。

1.2.5 不同Cd²⁺浓度下的BDE-209降解实验

将Cd²⁺标准溶液加到含10 mg/L BDE-209的MSM中，以葡萄糖为外加碳源，接种2 mL菌悬液，降解体系总体积为20 mL。降解体系中葡萄糖浓度为250 mg/L，在高浓度范围内Cd²⁺浓度分别设置为5、15、30、60和100 mg/L；在低浓度范围内Cd²⁺浓度分别设置为0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mg/L。在30 ℃、150 r/min条件下进行降解实验，以不含Cd²⁺但含有BDE-209的MSM作为对照。降解120 h后取样测定BDE-209的剩余浓度，计算BDE-209的生物降解率，并测定600 nm处体系的吸光度值。

1.2.6 细胞表面疏水性的测定

采用细菌黏附碳氢化合物的方法测定细胞表面疏水性(cell surface hydrophobicity, CSH)^[18]。将培养或降解一段时间后的体系于4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，菌体用PBS洗涤2次并于4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，然后用PBS重悬成OD₆₀₀介于0.53−0.54之间的菌悬液。取8 mL上述菌悬液，分别加入1、2、4、6、8、10、12 mL二甲苯，室温下充分振荡2 min，静置10 min至分层，收集下层水样并在600 nm处测定其吸光度，以确定二甲苯的最适用量。实验以不加二甲苯为空白对照。CSH的计算公式为：

式中：A₀为空白样品的吸光度值，A₁为样品的吸光度值。

1.2.7 扫描电镜的观察

菌体经2.5%戊二醛固定、乙醇脱水、冷冻干燥及表面喷金后，用高分辨率扫描电镜(high resolution scanning electron microscope, HRSEM)观察细胞表面形态。

1.3 分析方法

1.3.1 BDE-209浓度的测定

将降解一定时间后的20 mL培养液用等体积的二氯甲烷和正己烷(1:1)萃取2次，有机相用无水硫酸钠脱水后于40 ℃、120 r/min条件下旋转蒸发浓缩至1 mL，用四氢呋喃洗下内壁黏附物并定容至10 mL，取1 mL经0.22 μm滤膜过滤后保存至棕色进样小瓶中。

HPLC法测定BDE-209浓度的条件为：色谱柱为安捷伦C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流动相为乙腈: 纯水体积比98:2，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为240 nm。

1.3.2 BDE-209降解产物的分析

采用液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)检测并分析降解中间产物，分析条件为：色谱柱为Hypersil Gold C18柱(150 mm×2.1 mm×3 μm)，流动相为乙腈: 水体积比98:2，柱温和流速分别为30 ℃和1 mL/min，进样量和检测波长分别为20 μL和240 nm。梯度洗脱程序为：5% A (0−0.8 min)，5%−50% A (0.8−5 min)，50%−90% A (5−7 min)，90% A (7−9 min)，90%−5% A (9−10 min)，5% A (10−13 min)。离子源在负电喷雾电离(electrospray ionization, ESI^–)下工作，负离子扫描模式，源中的电荷注入检测器(charge injection detector, CID)电压为50 V。

所有实验均设置3个平行，取其平均值作为最终结果。本文数据之间的统计学差异采用SPSS 26.0进行分析，若P < 0.05则认为存在显著性差异。对本文相关实验数据的分析结果均为P < 0.05，表明存在显著性差异。

2 结果与分析 2.1 BDE-209降解菌的筛选与鉴定

通过分离纯化，从活性污泥中筛选得到15株对BDE-209具有一定降解能力的细菌，分别标记为A−O。在含10 mg/L BDE-209的MSM中培养120 h后，各菌株对BDE-209的降解率如图 1所示。其中菌株F对BDE-209的降解能力最好，降解率为57.1%。如图 2A所示，菌落呈乳白色，直径约为2−3 mm，圆形且不透明，表面光滑。在显微镜下观察发现该细菌呈短杆状(图 2B)。

将菌株F的16S rRNA基因序列提交至GenBank (登录号为KC625329.1)进行比对，结果表明，菌株F与硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)相似性最高，达99.93%。基于菌株F的16S rRNA基因序列构建的系统发育树如图 3所示。

2.2 温度、pH、接种量对BDE-209生物降解的影响

温度、pH和接种量都是影响微生物降解的重要因素，为获得菌株F降解BDE-209的最优条件，采用了三因素五水平的正交试验。表 2的结果表明，3个因素对BDE-209生物降解的影响依次为：pH > 接种量 > 温度，其中pH对BDE-209生物降解的影响最大。BDE-209的最优微生物降解条件为：pH 7.0，接种量10%，温度30 ℃。

2.3 外加碳源对BDE-209微生物降解的影响

2.3.1 外加碳源种类的影响

在前述优化条件下研究了酵母粉、葡萄糖、苯酚和柠檬酸钠4种外加碳源对菌株F降解BDE-209的影响，结果如图 4A所示。在外加碳源浓度均相等的条件下，酵母粉和葡萄糖的加入均促进了BDE-209的微生物降解，与对照相比降解率分别提高了13.0%和19.1%，而苯酚和柠檬酸钠却抑制了降解。通过对比菌体生长量的变化发现(图 4B)，葡萄糖对菌株F的生长促进作用比酵母粉对菌株F的生长促进作用更明显。综合考虑降解能力和菌体生长量，应选择葡萄糖作为BDE-209微生物降解的最适外加碳源。

2.3.2 葡萄糖浓度的影响

分别向降解体系中加入不同量的葡萄糖，使其在体系中的浓度分别为50、100、250、500、1 000 mg/L，以考察葡萄糖浓度对BDE-209生物降解的影响，实验以不加葡萄糖为对照，在前述优化条件下进行降解实验，结果如图 4C所示。低浓度的葡萄糖(≤250 mg/L)对降解具有促进作用，而高浓度的葡萄糖(≥500 mg/L)却对BDE-209的降解有显著的抑制作用。当葡萄糖浓度为250 mg/L时降解率达最高，为76.2%。

2.4 Cd²⁺浓度对BDE-209微生物降解的影响

如图 5A所示，BDE-209的生物降解率和菌株F的生长量均随着Cd²⁺浓度的增加呈现出先增大后减小的趋势，当Cd²⁺浓度为5 mg/L时，BDE-209的生物降解受到了轻微的促进作用，降解率最高达74.4%，与对照相比仅提高了3.2%，生长量也达到最大值。然而高浓度的Cd²⁺ (≥15 mg/L)则对BDE-209的生物降解有显著的抑制作用。由于实际环境中Cd²⁺浓度较低，因此本文又考察了浓度在5 mg/L以下的Cd²⁺对BDE-209微生物降解及菌体生长的影响。从图 5B可以看出，低浓度的Cd²⁺ (≤5 mg/L)对BDE-209生物降解和菌株F的生长并未产生明显影响。

2.5 BDE-209初始浓度对菌体CSH的影响

在生物降解过程中，CSH是决定有机污染物能否被吸附到细胞表面并进入细胞内部被降解的重要因素之一。如图 6A所示，CSH在不同BDE-209初始浓度下均呈现出先增大后减小的共同趋势，并在72 h时达到最高值且CSH均保持在66.5%−74.7%，但在72 h之后菌株F的CSH随着时间的推移逐渐降低，在120 h时CSH降至28.7%−38.8%。从图 6A中还可以看出，高浓度BDE-209比低浓度BDE-209对CSH的影响略大。以72 h的CSH为例，在分别含有5、10、20 mg/L BDE-209的降解系统中，与对照相比菌体CSH分别降低了1.3%、3.3%和8.2%。图 6B表明，BDE-209在前72 h内降解率迅速增大，随后降解率的变化不显著，而CSH也是在前72 h内逐渐增大，随后开始减小。由此可见，降解率与CSH之间表现出了正相关性。此外，由图 6C可以看出，菌株F在72 h时进入了生长稳定期，而此时生长量也达到最大。上述结果表明，菌株F的CSH、生长量和BDE-209的生物降解能力三者之间具有很好的相关性。

2.6 BDE-209生物降解路径的推导

为深入解析菌株F对BDE-209的微生物降解机制，采用LC-MS对中间产物进行了分析，共检测到7种主要中间产物，即五溴联苯醚(BDE-99)、四溴联苯醚(BDE-47)、三溴联苯醚(BDE-28)、3-羟基-2′, 4, 4′-三溴联苯醚、2, 3-二羟基-4, 4′-二溴联苯醚、2, 5-二溴苯酚和3-羰基-4-溴-己二酸。基于上述中间产物和相关文献[19-20]，提出了BDE-209生物降解的可能途径(图 7)。首先，BDE-209脱溴形成BDE-99，然后通过邻位脱溴生成BDE-47，接着通过间位脱溴产生BDE-28。随后BDE-28发生羟基化反应，依次生成3-羟基-2′, 4, 4′-三溴联苯醚和2, 3-二羟基-4, 4′-二溴联苯醚。这些羟基化产物再通过二苯醚键的断裂进一步转化为2, 5-二溴苯酚以及开环产物3-羰基-4-溴-己二酸，这些产物最终可能通过三羧酸循环矿化成CO₂和H₂O。

3 讨论与结论

BDE-209是一类广泛存在于环境中的有机污染物，本研究发现所筛选的菌株F能够利用BDE-209为唯一碳源生长，并在有氧条件下有效降解BDE-209，在未优化降解条件的情况下降解率即可达到57.1%。与其他研究相比^{[19, 21]}，菌株F对BDE-209表现出较强的降解能力。

正交试验结果表明，环境pH、培养温度和接种量对BDE-209的微生物降解有着重要影响。一方面，pH值的变化会引起细胞膜电位的变化，改变营养离子在细胞膜上的转运，从而影响细菌的生长^[22]。另一方面，过酸或过碱性环境会抑制降解酶的活性^[23]，导致菌株F对污染物的降解能力下降。除pH值外，接种量也是影响BDE-209降解的一个重要因素，接种量过低时，微生物的生长和降解酶的合成均会受到抑制，从而影响BDE-209的降解效率。温度虽然是3个因素中影响最小的，然而过低或过高的温度依然会影响微生物的生长及降解酶的分泌，从而影响BDE-209的生物降解。丁娟等^[24]研究了白腐真菌对BDE-209的降解，在30 ℃、150 r/min条件下培养10 d后，BDE-209的降解率达到43.0%。Tang等^[25]发现，短短芽孢杆菌在30 ℃、130 r/min条件下培养7 d，对BDE-209的降解率仅有44.0%。与国内外相关研究相比，菌株F具有降解效率较高、降解周期短等优点。

实验发现，当无机盐培养基中葡萄糖浓度分别为50、100、250 mg/L时，与对照相比，BDE-209的降解率有显著提高，然而在无机盐培养基中不添加葡萄糖时，BDE-209仍然有57.2%的降解率，这一现象表明菌株F对BDE-209的代谢并不是共代谢。在生长代谢中，对于难降解的有机污染物，可以通过添加外加碳源的方法来增强细胞活性，加快其繁殖速度，缩短对污染物的适应期，改善降解效果^[26]。通过研究4种外加碳源(酵母粉、葡萄糖、柠檬酸钠和苯酚)对BDE-209生物降解的影响，发现酵母粉和较低浓度的葡萄糖对降解均有显著的促进作用，其中250 mg/L葡萄糖对BDE-209的降解和菌株的生长促进作用更明显。葡萄糖能够改善菌株的生长条件，促进降解酶的分泌，增强降解效果。然而，葡萄糖浓度过高时微生物会大量利用容易分解的葡萄糖而较少利用难分解的目标污染物，从而抑制了目标污染物的降解^[27]。据报道^[28]，加入适宜浓度的葡萄糖不仅会促进菌株对BDE-209的利用，还能改变菌株生长代谢过程中的某些膜通道，使菌株更有效地降解BDE-209。因此，葡萄糖可作为菌株F降解BDE-209的最适外加碳源。这与常晶晶等^[29]的研究结果相似。

除BDE-209外，重金属也是伴随着电子垃圾拆解过程进入环境的另一种主要污染物。本文研究了不同浓度Cd²⁺对BDE-209生物降解和细菌生长的影响，发现在0.05−5.00 mg/L的低浓度范围内，共存的Cd²⁺对BDE-209的生物降解和细菌生长量的影响均不显著，表明菌株F对低浓度的Cd²⁺具有一定的耐受性。然而实验也表明，在5−100 mg/L的高浓度范围内，5 mg/L的Cd²⁺可以轻微促进BDE-209的生物降解和菌株F的生长，可能是由于低浓度的Cd²⁺可以在转录和复制过程中调节相关酶的基因，促进相关酶的活性^[30]。Baldrian^[31]也发现，Cd²⁺提高了白腐真菌合成的Lac酶的活性，从而促进了BDE-209的降解。然而在较高的Cd²⁺水平(15−100 mg/L)下，由于Cd²⁺对菌株F的毒性作用，BDE-209的生物降解受到显著抑制。

在微生物降解过程中，有机物附着在细胞表面是微生物去除疏水性有机污染物全过程的第一步^[32]，CSH是决定BDE-209能否被吸附到细胞表面并进一步被降解的重要因素。据报道^[18]，当CSH > 70%时，细胞具有高疏水性；当CSH < 70%时，细胞是低疏水性的。菌株F在降解BDE-209的第72 h时CSH达到最大值为74.7%，由此可见，菌株F的细胞表面具有较高疏水性，有利于菌体对BDE-209的吸附与降解；而第72 h后CSH的逐渐降低可能是因为在降解后期营养缺乏而使得细胞活性降低和膜结构发生改变，从而导致疏水区被破坏^[18]。Liu等^[33]在利用铜绿假单胞菌降解BDE-209的研究中发现，第72 h时菌体的CSH达到52.1%，随后CSH也呈下降趋势。Tang等^[34]研究发现铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)的CSH最高可达58.2%。因此，本研究筛选得到的菌株F具有更高的CSH，有利于BDE-209被细胞表面吸附并降解。

在5−20 mg/L BDE-209浓度范围内，菌株F均能较好地生长。随着BDE-209浓度增大至20 mg/L，菌株F的生长受到了一定程度的抑制，然而菌株F对20 mg/L BDE-209的降解率在72 h时仍然达到了70.8%，表明该菌株对较高浓度的BDE-209具有较好的耐受力。与其他研究^[35-36]相比，菌株F明显缩短了BDE-209生物降解的时间，提高了降解效率。此外，实验结果显示，在降解的前72 h内，菌株F的CSH和生长量均逐渐增大并在72 h时达到最大，而降解率也是逐渐增大的，并在72 h后变化逐渐趋于平缓。这一现象表明，细胞膜的疏水性与菌株对BDE-209的生物降解能力具有正相关性，而细胞的良好生长状态有利于降解酶的合成，从而有利于BDE-209的降解。

还原脱溴是BDE-209生物降解过程中的一个重要步骤^[37]。本研究检测到几种脱溴产物，如BDE-99、BDE-47和BDE-28，发现溴的去除容易发生在邻位和间位。此外，羟基化反应也是卤代芳香族化合物生物降解的关键过程之一^[38]。Lu等^[39]利用蜡状芽孢杆菌降解BDE-209，发现在降解过程中主要发生脱溴和羟基化反应。Wang等^[19]发现BDE-209在葡萄球菌的作用下主要发生了脱溴、羟基化和开环反应，并最终矿化成小分子化合物。本文基于中间产物的分析，发现菌株F降解BDE-209的过程中包含了4种代谢机制，即脱溴、羟基化、二苯醚键断裂和开环，其中开环产物3-羰基-4-溴-己二酸鲜有报道。本研究表明，菌株F能够同时实现BDE-209的还原脱溴和氧化分解。

综上所述，本研究从活性污泥中分离出一株BDE-209高效好氧降解细菌F。在优化的条件下(pH 7.0、30 ℃、10%接种量、250 mg/L葡萄糖)，对10 mg/L BDE-209降解率最高可达76.2%。外加碳源对BDE-209的微生物降解具有显著影响。与高浓度Cd²⁺对BDE-209生物降解和菌体生长的显著影响相比，低浓度Cd²⁺的影响并不明显。菌株F较高的CSH有利于BDE-209被细胞表面吸附而进一步被降解。此外，BDE-209在生物降解过程中发生了脱溴、羟基化、二苯醚断裂和开环等过程。本研究分离的菌株F对BDE-209具有良好的生物降解能力，研究结果为BDE-209污染环境的生物修复提供了科学依据。