微生物学通报  2023, Vol. 50 Issue (1): 64−77
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虫草是指寄生于无脊椎动物、少数真菌和植物上的肉座菌目(Hypocreales)真菌，这类真菌富含的多种生物活性物质具有抗菌、抗虫、抗肿瘤和提高机体免疫力的作用，对人类健康和生态系统稳定具有重要意义，具有极高的药用价值和经济价值[1-2]。根据虫草分类系统，虫草隶属于麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草科(Cordycipitaceae)和线虫草科(Ophiocordycipitaceae)及其他分类地位未定的类群[3]。在菌物名录数据库MycoBank (http://www.MycoBank.org)和Index Fungorum (http://www.indexfungorum.org)中可检索到1 300余个虫草分类单元(截至2020年3月)，但我国报道的有效名称不足200个[4]。因此，一直以来针对不同地区虫草物种多样性的调查研究也是虫草相关研究的热点之一。在虫草及其微生境群落中，除虫生真菌外，还分布有其他与虫生真菌共存的真菌类群，这些真菌类群，一方面在虫草的种群分化、环境适宜性、感染机制和活性代谢物质量方面发挥重要作用[5-6]，如研究显示冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)群落中的一些微生物物种与冬虫夏草密切相关，而且可能参与了其子实体的的发育[7-8]。另一方面，这些与虫草共存的真菌类群在与宿主的长期协同进化过程中具有能够产生某些与虫生真菌类似的活性代谢产物，如分离自冬虫夏草上的新菌种蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)和蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepiali)已分别被制成金水宝胶囊和至灵胶囊[9-10]；Min等[11]从冬虫夏草中分离到的淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)具有产虫草素的能力。此外，亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii)中存在可促产优质虫草多糖的内生真菌C-10[12]。由此可见，虫草微生物群落中可能具有很多重要的与虫草相关的真菌资源有待认识和开发利用，同时，加强虫草物种及其相关真菌群落的物种多样性研究可以更好地了解群落内部种群关系，从而获得群落的动态和功能。因此，针对虫草群落中相关真菌物种多样性的系统研究也同样重要。
云南省昆明市西山森林公园地处E102°37′− 102°38′，N24°57′−24°59′，位于滇池西岸，面积约12 km2，最高海拔2 359 m，年平均气温在10−22 ℃之间，年平均降水量1 094.1 mm，年均相对湿度74%[13]。此外，目前西山森林公园保存有亚热带常绿阔叶林、针阔混交林、针叶林、竹林、灌丛和草丛等6个植被类型，由于西山森林公园保存了许多接近天然的植被类型，因而成为滇中地区天然植被的一个缩影[14]。基于西山森林公园适宜的气候特征和独特的地理环境，使得该地区成为研究探讨虫草生物多样性的良好场所。在前期研究中，范琪[15]已做了关于昆明市西山森林公园虫草物种多样性的调查研究，但未见关于该地区虫草真菌区系的报道。本研究于2021年9月对昆明西山森林公园进行野外调查，对采集到的虫草样本利用组织分离法和形态学结合基因系统发育分析的方法对该地区虫生真菌及虫草内生真菌进行分离鉴定，基于α多样性揭示虫生真菌的物种多样性，以期进一步考察昆明市西山森林公园虫生真菌及其内生真菌资源的物种组成，为虫草资源的保护和可持续利用提供参考依据。同时，期望研究结果能够增加我们对虫草群落中相关真菌物种多样性的认识，并为研究这些真菌在虫草形成过程中的作用及其开发利用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样本采集虫草样本于2021年9月采自云南省昆明市西山森林公园自然地貌内植被覆盖良好、环境湿度适中、透光性较好的地带，共采集到45份虫草样本。根据宏观形态特征及采集地对样本进行归类和编号，包括编号为“XY”的虫草样本5份，编号为“XW”的虫草样本5份，编号为“XS”的虫草样本20份，编号为“XB”的虫草样本13份，编号为“BG”的虫草样本2份。所采集的虫草样本用无菌滤纸包好，放入灭菌的收集管和密封袋中进行保鲜，放置4 ℃冰箱内保存。
1.1.2 培养基实验所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[16]。
1.2 方法 1.2.1 菌株的分离和保藏新鲜虫草样本用无菌水洗涤以除去表面杂质后，按以下步骤进行表面消毒：75%酒精浸泡1−2 min，30%过氧化氢溶液浸泡1−2 min，再以无菌水反复冲洗2−3次，用无菌滤纸吸干表面水分，放置无菌培养皿中备用，最后一次洗涤的无菌水取200 μL涂布分离培养基，25 ℃培养1−2周无菌落生长则说明表面消毒成功[17]。根据野生虫草形态的不同，编号为“XY”和“XW”的虫草样本子座肉质且菌核生长状态良好，采取组织分离法用无菌手术刀取菌核内部5 mm大小的组织接种至含50 mg/L萘啶酮酸钠的PDA培养基中；编号为“XS” “XB” “BG”的虫草样本表面有大量孢子。虫生真菌可直接取野生材料表面的孢子粉“Z”字形画线接种至分离培养基上培养分离，内生真菌的分离是取其经表面消毒的菌核内部组织接种，于25 ℃恒温培养。待组织边缘长出真菌菌落，根据菌落形态颜色等特征挑取单菌落接种于PDA培养基上，25 ℃恒温培养纯化并去重复，将纯化所得菌株每株接种10支至PDA斜面，4 ℃保存，详细记录每株菌的分离源及其在PDA培养基中的形态、颜色和长势等信息，从而建立云南西山森林公园虫草及其内生真菌菌种库。
1.2.2 菌株的鉴定虫草物种采用形态特征观察和internal transcribed spacer (ITS)结合nrSSU、nrLSU、translation elongation factor-1α (tef-1α)、rpb1、rpb2基因系统发育分析的方法进行虫草物种的鉴定。形态学观察[18]包括宏观结构观察和微观结构观察，DNA的提取及PCR扩增参考文献[19]，所用引物见表 1。对于所分离得到的虫草内生真菌主要基于菌落形态观察及ITS基因系统发育分析进行鉴定，DNA提取以及序列扩增参考侯晓强等[20]的方法。PCR扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳检测，将条带明亮且无杂带的样品送至擎科生物科技(上海)有限公司进行测序。根据测序结果，所得序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，下载相似性较高的同源序列，用MEGA-X[21]软件基于EF-1α基因序列进行虫生真菌系统发育分析，基于ITS基因序列比对并构建虫草内生真菌的系统发育树(最大似然树)，以确定物种分类地位。
| Gene | Primer name | Primer sequence (5′→3′) | Length (bp) |
| nrSSU | nrSSU-CoF | TCTCAAAGATTAAGCCATGC | 1 800 |
| nrSSU-CoR | TCACCAACGGAGACCTTG | ||
| nrLSU | LR5 | ATCCTGAGGGAAACTTC | 900−1 200 |
| LR0R | GTACCCGCTGAACTTAAGC | ||
| ITS | ITS5 | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG | 600 |
| ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||
| tef-1α | EF1α-EF | GCTCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | 900−1 200 |
| EF1α-ER | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||
| rpb1 | RPB1-5'F | CAYCCWGGYTTYATCAAGAA | 900−1 200 |
| RPB1-5'R | CCNGCDATNTCRTTRTCCATRTA | ||
| rpb2 | RPB2-5'F | CCCATRGCTTGTYYRCCCAT | 900−1 200 |
| RPB2-5'R | GAYGAYMGWGATCAYTTYGG |
物种多样性分析基于α多样性分析研究样地虫生真菌的数量特征、物种丰富度指数和生态优势度指数，用Excel软件进行统计分析[22]。
生态优势度：
式中：Ni为某物种个体数；N为所有物种个体数量总和。
2 结果与分析 2.1 西山森林公园虫生真菌物种多样性从昆明市西山森林公园共采集到45份天然虫草样本，经分离鉴定得到30株虫生真菌，结合《真菌鉴定手册》[23]中相关真菌的分类检索表，利用形态特征观察(图 1)结合EF-1α基因系统发育分析(图 2)鉴定出该地区虫生真菌分属于2科5属12种(表 2)，包括虫草科(Cordycipitaceae)的冠鳞翅虫草(Samsoniella cristata)、茧生虫草(Cordyceps cocoonihabita)、环链虫草(Cordyceps cateniannulata)和细脚虫草(Cordyceps tenuipes)，以及Cordyceps lepidopterorum、拟球孢白僵(Beauveria pseudobassiana)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、Beauveria asiatica、Beauveria varroae和线虫草科(Ophiocordycipitaceae)的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)；此外，还有2种为疑似新物种，分属于鳞翅虫草属(Samsoniella)和弯颈霉属(Tolypocladium) (表 2)。同时，基于物种丰富度指数、生态优势度指数对昆明市西山森林公园采集到的虫草物种进行多样性分析显示，昆明市西山森林公园虫草物种多样性较高，优势种属现象明显，优势科为虫草科，优势属为虫草属，其检出菌株数占虫生真菌菌株总数的74% (图 3)，优势种为环链虫草(生态优势度=0.241 380) (表 2)。虫草寄主涉及鳞翅目、鞘翅目和膜翅目等动物，其中以鳞翅目为主。
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| 图 1 部分虫生真菌无性分离菌株菌落形态特征 Figure 1 The characteristics and microscopic features of some entomogenous fungi strains. A1−A8：野生虫草样本. B1−B20：菌落形态. C1−C10：产孢结构. 标尺=10 μm/20 μm A1−A8: Wild material. B1−B20: Colony on PDA. C1−C10: Conidiogenous structures. Bars=10 μm/20 μm. |
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| 图 2 基于EF1-α基因序列构建的虫生真菌系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of entomogenous fungi based on EF1-α gene sequence. 括号内序号为该菌株GenBank登录号；内部节点数字为支持度，用于代表该分支结构的可靠程度. 下同 The serial number in bracket is the GenBank accession number of the strain; The number of internal nodes is support value, which represents the reliability of the branch structure. The same below. |
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| Species | Genus | Family | Richness S value | Ecological dominance |
| Samsoniella cristata | Samsoniella | Cordycipitaceae | 1 | 0.000 000 |
| Samsoniella sp. | 1 | 0.000 000 | ||
| Cordyceps cocoonihabita | Cordyceps | 3 | 0.006 897 | |
| Cordyceps cateniannulata | 15 | 0.241 380 | ||
| Cordyceps lepidopterorum | 1 | 0.000 000 | ||
| Cordyceps tenuipes | 3 | 0.006 897 | ||
| Beauveria pseudobassiana | Beauveria | 1 | 0.000 000 | |
| Beauveria bassiana | 1 | 0.000 000 | ||
| Beauveria varroae | 1 | 0.000 000 | ||
| Beauveria asiatica | 1 | 0.000 000 | ||
| Purpureocillium lilacinum | Purpureocillium | Ophiocordycipitaceae | 1 | 0.000 000 |
| Tolypocladium sp. | Tolypocladium | 1 | 0.000 000 | |
| 各物种丰富度值等于各物种数 The richness value of each species is equal to the number of each species. |
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| 图 3 西山森林公园虫生真菌不同属的物种数(A)和样本数(B)占比 Figure 3 The proportion of species (A) and specimens (B) in different genera of entomogenous fungi in Xishan Forest Park. |
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利用形态特征观察(图 4)和构建ITS基因系统发育树(图 5)分析显示分离鉴定得到67株虫草内生真菌，分属于13科14属，包括毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、盘菌属(Peziza)、曲霉属(Aspergillus)、鬼伞属(Coprinellus)、间座壳属(Diaporthe)、被孢霉属(Mortierella)、螺旋聚孢霉属(Clonostachys)、黑团孢霉属(Periconia)、Psathyrella、节菱孢霉属(Arthrinium)和丛赤壳属(Nectria)。其中，木霉属(28%)和镰刀菌属(19%)为此次研究中的优势菌属(表 3)。
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| 图 4 虫草内生真菌无性分离菌株菌落形态特征 Figure 4 The conidiogenous structures of endophytic fungi. |
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| 图 5 基于ITS序列构建的虫草内生真菌系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of endophytic fungi based on ITS sequence. |
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| Family | Genus | Number of isolates |
Percentage (%) |
| Mucoraceae | Mucor | 7 | 10 |
| Mucedinaceae | Trichoderma | 19 | 28 |
| Trichocomaceae | Penicillium | 2 | 3 |
| Tuberculariaceae | Fusarium | 13 | 19 |
| Pezizaceae | Peziza | 1 | 2 |
| Aspergillaceae | Aspergillus | 6 | 9 |
| Psathyrellaceae | Coprinellus | 8 | 12 |
| Psathyrella | 1 | 2 | |
| Diaporthaceae | Diaporthe | 1 | 2 |
| Mortierellaceae | Mortierella | 4 | 6 |
| Bionectriaceae | Clonostachysachys | 2 | 3 |
| Periconiaceae | Periconia | 1 | 2 |
| Apiosporaceae | Arthrinium | 1 | 1 |
| Nectriaceae | Nectria | 1 | 1 |
| Total | 67 | 100 |
本研究共采集45份虫草样本，鉴定出12种虫生真菌，含2个潜在新物种，结果表明，昆明市西山森林公园中蕴藏着丰富的虫生真菌类群，其物种多样性较高。本次调查的采样范围依据西山森林公园地貌从南向北进行，涉及未被人类活动干扰的样地及已被开发的自然保护区样地，以便详细探寻西山森林公园的虫生真菌物种的丰富度及多样性。昆明市西山森林公园里人类活动频繁，但主要集中于几条观光线路、山间石阶、已开发的景点(三清阁、太华寺、华亭寺、龙门等名胜)。此外，昆明市西山森林公园山中山势陡峭，除罗汉崖外均为繁茂的原始次生林[24]，因此，山中茂密的植被覆盖区域很少有人涉足，加之观光公众环保意识强烈，以及本区植物受到当地政府较好的保护，植被接近自然状态，森林生态系统多样、生物物种趋于稳定、生态结构复杂、昆虫种类繁多，有利于虫生真菌维持物种多样性[25]。
在前期关于云南省虫草物种多样性的研究报道中，赵志远等[26]通过对云南省弥渡县太极山广义虫草属物种多样性调查研究，发现该地区虫草物种隶属于2科5属，其中还包含3种疑似新种，优势属为虫草属和白僵菌属，优势种为蛹虫草(Cordyceps militaris)、细脚虫草和球孢白僵菌；同时，在大理巍山地区虫草物种多样性调查中研究发现该地区虫草物种隶属于2科5属20种，其中有7种为疑似新物种，优势属为虫草属，优势种为蛹虫草[27]。范琪[15]对昆明地区不同海拔、不同生境进行的虫草物种多样性调查研究，共发现了41个虫草物种，含19个隶属于3科8属的新物种，其中优势属为虫草属和线虫草属，优势种为高原线虫草(Ophiocordyceps highlandensis)、垂头虫草(Ophiocordyceps nutans)、细脚虫草和蛹虫草。本研究发现昆明西山森林公园的虫生真菌隶属于2科5属12种，优势属同样为虫草属，其检出菌株数占虫生真菌菌株总数的74%。由此进一步表明虫草属为世界广布属[28]。在种水平，本研究所获优势物种为环链虫草，其生态优势度为0.241 380，表明不同地区虫草物种的分布及数量存在一定差异。环链虫草是森林生态系统中的优势虫生真菌，其适应性广、生活能力强，易于培养，孢子丰富且易于扩散，因此可用于生物防治[29]。在本次调查中，只发现2种线虫草物种无性型，这可能与线虫草寄主昆虫较为专一且侵染多发生于温度与湿度较高地区有关[30]。此外，本研究中发现的茧生虫草、环链虫草、细脚虫草、拟球孢白僵菌和球孢白僵菌与前期昆明虫草物种多样性调查研究中关于西山森林公园的调查[15]一致，而冠鳞翅虫草、C. lepidopterorum、B. asiatica、B. varroae、淡紫紫孢菌及2种疑似新种为本研究首次发现，进一步丰富了西山地区虫草真菌资源数据库。
3.2 虫草真菌区系中内生真菌的多样性及应用潜力自然环境中，内生菌类群丰富多样，其多样性体现在宿主多样性、物种多样性及分布多样性[31]。其中虫草作为一类特殊微生境，在其生长过程中以虫生真菌为主并伴随其他真菌类群生长，如高通量测序显示冬虫夏草[32]、高原线虫草[33]、蛹虫草[34]及其微生境中都分布有丰富的内生真菌类群。本研究通过纯培养分离的手段对西山森林公园虫草物种内生真菌进行分离鉴定得到67株属于13科14属的虫草内生真菌，其中主要以木霉属(28%)、镰刀菌属(19%)和毛霉属(10%)为优势内生真菌属，与张永杰等[35]研究相一致。这表明内生真菌与虫生真菌在特殊生境下形成共生，具有菌群多样性。其中木霉属和镰刀菌属在土壤及植物体内广泛分布，对植物生长、抗逆与活性化合物产生等方面起着重要的作用。如研究显示名贵中药三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)葫芦状块根中的镰刀菌属菌株可以上调根茎叶各部th-exp基因的表达[36]；分布于杜仲皮中的镰刀菌属与杜仲活性成分松脂醇二葡萄糖苷及绿原酸含量呈正关联[37]。木霉属是土壤中主要的植物促生真菌，能显著改变根际土壤化学，调节土壤微生物群落，提高土壤生物量[38]；Zhai等[39]研究发现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)通过上调青蒿素生物合成关键酶基因提高了黄花蒿叶片中青蒿素浓度。此外，研究显示分布于丹参根际的可培养优势种卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、土曲霉(Aspergillus terreus)和歧皱青霉(Penicillium steckii)等已被证实都能产indole acetic acid (IAA)，并对隐丹参酮和丹参酮IIA合成的促进效果比较显著[40]。这些来自药用植物且与药用植物的生长、代谢活动密不可分的内生真菌在本研究中主要分离自不同的虫草样本中，这些虫草内生菌类群在与宿主的长期协同进化过程中可能对虫生真菌的感染定殖、生长发育及活性代谢产物形成等方面可能发挥着重要作用，而且已有研究报道显示分布于蛹虫草微生物群落中的内生细菌Stenotrophomonas maltophilia与蛹虫草共培养后会抑制蛹虫草菌丝的生长和虫草素的生成[41]，分离自天然蝉花虫草(Cordyceps cicadae)中的内生细菌与蝉花虫草共培养后改变了蝉花虫草中的腺苷和核苷含量[42]。这表明在虫草真菌群落中除虫生真菌外，虫草内生真菌也是一群种类和资源丰富的物种，这类真菌可能会对虫草的生长发育及活性化合物的分泌产生一定的影响。本研究通过纯培养分离的手段从不同虫草样本中获得类群丰富的内生真菌菌株，为后期研究验证虫草微生物群落中内生真菌物种与虫草生长发育和活性代谢物相关性研究提供了参考菌株。
4 结论本研究通过纯培养分离的方法，从采自昆明市西山森林公园的天然虫草物种中得到30株分属于2科5属12种的虫生真菌，以及67株分属于13科14属的内生真菌，研究结果证实西山森林公园分布有丰富多样的虫草物种，而且不同的虫草物种有不同种类的内生真菌与其共存。虫草及其内生真菌作为一类新兴的微生物资源，虫草物种的多样性及特殊的生存环境和代谢途径赋予了其代谢产物丰富多样的可能性，是挖掘新颖活性化合物的潜在来源。通过对虫草真菌区系的系统研究不仅有利于进一步挖掘虫草真菌的生态学功能，而且可以提高资源的应用潜力，并为进行开发利用提供依据。
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表1(Table 1)
