2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 薛苗苗, 李会, 曹雪岑, 张晓梅, 王淑丽, 陈立营, 史劲松, 许正宏
- XUE Miaomiao, LI Hui, CAO Xuecen, ZHANG Xiaomei, WANG Shuli, CHEN Liying, SHI Jinsong, XU Zhenghong
- 分枝杆菌LY-1内源性表达元件的筛选及其在降低Cas9蛋白毒性中的应用
- Endogenous expression elements of Mycobacterium sp. LY-1: screening and application in reducing Cas9 toxicity
- 微生物学通报, 2022, 49(8): 3267-3278
- Microbiology China, 2022, 49(8): 3267-3278
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.211121
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文章历史
- 收稿日期: 2021-11-25
- 接受日期: 2022-02-24
- 网络首发日期: 2022-03-31
2. 天津天药药业股份有限公司, 天津 300301;
3. 天津药业研究院股份有限公司, 天津 300301;
4. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122
2. Tianjin Tianyao Pharmaceutical Limited Company, Tianjin 300301, China;
3. Tianjin Pharmaceutical Research Institute Limited Company, Tianjin 300301, China;
4. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
分枝杆菌(Mycobacterium) LY-1可以将天然植物甾醇生物转化为重要甾体药物中间体9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮(9α-OH-AD)，目前已成为工业上的优势生产菌株[1-2]。虽然国内外研究者通过菌株诱变选育、发酵工艺优化等手段，在一定程度上提高了分枝杆菌转化生成甾体药物中间体的合成效率，但仍存在底物投料浓度低、菌株转化效率不高等瓶颈问题，限制其工业化应用[3-6]。因此，利用代谢工程改造技术获得高效生产菌株成为首要研究策略。
目前，分枝杆菌的代谢工程改造主要依靠质粒进行关键酶的增强表达和基因敲除，存在抗生素对菌株生长有抑制作用和两轮交换耗时长的缺点。CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，具有合成简单、使用方便、特异性高的特点，广泛应用于原核生物和真核生物的基因工程改造中[7-8]。由于Cas9蛋白的毒性及低同源重组效率，导致仅有个别分枝杆菌属(如结核分枝杆菌、海洋分枝杆菌和耻垢分枝杆菌)建立了成熟的CRISPR/Cas9基因编辑技术[9]。基于分枝杆菌未能广泛建立CRISPR/Cas9基因编辑技术的原因之一是Cas9蛋白的表达对大多数分枝杆菌有较大的毒性[10]，因此，在分枝杆菌LY-1中构建CRISPR/Cas9系统之前筛选表达元件文库，为调控Cas9蛋白的表达及CRISPR/Cas9系统在分枝杆菌中的构建提供可靠的分子操作元件，具有非常重要的意义。
表达元件是包含启动子[11]、核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)[12]等能够使目的基因表达的元件[13]。在分枝杆菌中，已报道的牛型分枝杆菌Hsp60热休克蛋白基因前的表达元件(hsp60)是应用最广泛的一个强表达元件[14]；大肠杆菌中诱导型表达元件四环素调控表达系统Tet[由脱水四环素(anhydrotetracycline，ATC)诱导]也可以控制和驱动分枝杆菌中基因的表达[15-16]。然而在分枝杆菌LY-1中使用hsp60与Tet启动Cas9表达时，使用强表达元件hsp60高表达Cas9蛋白，直接导致无转化子长出；使用诱导型表达元件Tet时，诱导剂本身对菌株产生较大的毒性。此外，Sun等[17]近年探究了外源表达元件在分枝杆菌中的应用，将2个单启动子联合起来形成双启动子，与合适的RBS结合形成强表达元件，过表达代谢途径中的关键酶，提高了9α-OH-AD的产量。然而分枝杆菌与大肠杆菌的σ70共有序列差异显著，而且表达元件的通用性较差，导致外源表达元件并不能很好地适应分枝杆菌。因此，分枝杆菌中可用的表达元件较少，筛选分枝杆菌内源性表达元件可能会有更好的相容性和通用性[18]。
分枝杆菌LY-1是本研究室自主筛选保藏的用于9α-OH-AD生物合成的生产菌株[19]。前期初步研究发现，分枝杆菌LY-1在Cas9蛋白高表达时几乎无菌体生长。为了降低Cas9蛋白对分枝杆菌LY-1的毒性，本研究筛选分枝杆菌LY-1中的内源性表达元件，以增强型绿色荧光蛋白作为报告基因评价表达元件的表达强度，选取合适的表达元件启动Cas9蛋白的表达，以期为分枝杆菌LY-1中CRISPR/Cas9系统的构建奠定基础，也为异源基因的表达提供调控文件库。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1 (CGMCC 13031)、大肠杆菌JM109及大肠杆菌和分枝杆菌的穿梭质粒pMV261均由本实验室保藏。
1.1.2 主要试剂和仪器QuickCut限制酶、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase，TaKaRa公司；Phanta HS Master Mix、Green Taq Mix和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，诺唯赞生物科技股份有限公司；卡那霉素和EZ-10柱式DNA纯化试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌质粒小提试剂盒、柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，上海捷瑞生物工程有限公司。电转仪和C100 PCR仪，Bio-Rad公司；多功能酶标仪，Molecular Devices公司；紫外分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；激光共聚焦显微镜，Leica公司；流式细胞仪，BD公司。
1.1.3 引物设计及合成研究所用引物使用CE Design软件设计，引物名称及序列如表 1所示，引物均由亦欣生物科技无锡有限公司合成。
| 引物Primers | 引物序列Primer sequences (5′→3′) |
| 261-P04810-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGTCAAACGACAGTTTCAGTGGCG |
| 261-P04810-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccTTAGATTGCCTTCCCACGTGTC |
| 261-P10585-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGAATTAACTTGGCAACTGGACAAG |
| 261-P10585-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccCTGGAATCCATTTCTTCGGTCA |
| 261-P10665-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGCCGCGCTGGGCACCTTC |
| 261-P10665-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccCCCCACTAACTCCTCACAAAACTAG |
| 261-P10760-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCCCGCCTTTGCGCAGGTA |
| 261-P10760-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGCGCCGACCACCTCCTGC |
| 261-P10825-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGAACGCATCGATTTCTTTACTGTAA |
| 261-P00068-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGACGCCGATGTAGTTCACTTCA |
| 261-P04700-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCGCCGGGTTCGATTCACG |
| 261-P04700-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGGCAGTCAGAGTATCGCGGT |
| 261-P04825-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCCAGGCGGGCCGCTGTGT |
| 261-P04825-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccTGCGCTCAACGCACTTCG |
| 261-P04895-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGATAGACCTGAGTTCTCACCTGGTT |
| 261-P04895-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGCAGACCGCGTTACCTTCAC |
| 261-P10590-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCCGTGGATTTACTCACCGGTA |
| 261-P10590-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccCAGAATCTCATCTCGCCCGA |
| 261-P10970-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaTCACAAAATGTTTGCGTGACCG |
| 261-P10970-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGTGCCGGTCTTCTCTGGCTA |
| 261-P11010-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGGGCGCGTCTTGGCGTTT |
| 261-P11010-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGTTCTGAATAACATTTCTGAAATTCCC |
| 261-P25915-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCAACGGGCATGGGCGGTA |
| 261-P25915-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGGGATCTCGTTTCTCAGGCC |
| 261-P25925-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCGTGACCTGGAACAAAGCAGT |
| 261-P25925-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccTTGCTTGTGGCACGGGAC |
| 261-P04690-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGTTCGGCGAATGCGGACC |
| 261-P04690-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGACGGGAATCCTACCTTGTGTG |
| 261-P26180-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaAGCCAGCAATGCTTGAAACAA |
| 261-P26180-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGAAGCCAGGCTAGAACACGTTT |
| 261-P09240-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCGGCGGCTGGGGCCCCAC |
| 261-P09240-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGTCGGCTCCTTTGATCGGG |
| 261-P26490-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCCTAGACAGAGATTAGAACACGTTACG |
| 261-P26490-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccGGCTGGACCCTTTCTTCACTC |
| 261-P07820-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaGGGGCGGTCCCTGCCAGT |
| 261-P07820-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccAGGACCACCTCCGAAGATGTC |
| 261-P06810-EGFP-F | taccagatctttaaatctagaCCGACCAGGCAAAACAGCT |
| 261-P06810-EGFP-R | gcccttgctcaccatggatccTTGTCCCGCGGCGTTGCG |
| 261-hsp60-EGFP-F | ggccaagacaattgcggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGG |
| 261-hsp60-EGFP-R | gacatcgataagcttgaattcTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC |
| 261-P10760-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccCCCGCCTTTGCGCAGGTA |
| 261-P10760-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGCGCCGACCACCTCCTGC |
| 261-P06810-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccCCGACCAGGCAAAACAGCT |
| 261-P06810-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcTTGTCCCGCGGCGTTGCG |
| 261-P25915-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccCAACGGGCATGGGCGGTA |
| 261-P25915-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGGGATCTCGTTTCTCAGGCC |
| 261-P10970-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccTCACAAAATGTTTGCGTGACCG |
| 261-P10970-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGTGCCGGTCTTCTCTGGCTA |
| 261-P00068-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccATCCGCACCGGCGGTGCG |
| 261-P00068-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGACGCCGATGTAGTTCACTTCA |
| 261-P26490-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccCCTAGACAGAGATTAGAACACGTTACG |
| 261-P26490-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGGCTGGACCCTTTCTTCACTC |
| 261-P09240-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccCGGCGGCTGGGGCCCCAC |
| 261-P09240-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGTCGGCTCCTTTGATCGGG |
| 261-P26180-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccAGCCAGCAATGCTTGAAACAA |
| 261-P26180-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcGAAGCCAGGCTAGAACACGTTT |
| 261-P07820-Casf-F | ccgtggcgcggccgcggtaccGGGGCGGTCCCTGCCAGT |
| 261-P07820-Casf-R | gtacttcttgtccatgaattcAGGACCACCTCCGAAGATGTC |
分枝杆菌LY-1种子培养基(g/L)：酵母粉15.0，硝酸钠5.4，磷酸氢二铵0.6，甘油2.0，用于分枝杆菌种子液的培养；分枝杆菌LY-1感受态培养基(g/L)：酵母粉15.0，硝酸钠5.4，磷酸氢二铵0.6，吐温-80 1.0，甘油2.0，甘氨酸20.0，玻璃珠10.0，用于分枝杆菌感受态的制备；LB液体培养基(g/L)：酵母粉5.0，氯化钠10.0，蛋白胨10.0，用于大肠杆菌的培养；LB固体培养基(g/L)：酵母粉5.0，氯化钠10.0，蛋白胨10.0，琼脂粉20.0，用于大肠杆菌及分枝杆菌的平板培养。
大肠杆菌使用LB培养基在37 ℃、220 r/min回旋式摇床中振荡培养，分枝杆菌使用分枝杆菌种子培养基在30 ℃、120 r/min往复式摇床中振荡培养。
1.2 方法 1.2.1 构建基于EGFP的表达元件报告系统以pMV261质粒为模板，采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶对模板上hsp60表达元件后的多克隆位点进行双酶切，获得线性化的pMV261质粒。以实验室保藏的pTK-EGFP质粒为模板，利用引物261-hsp60-EGFP-F和261-hsp60-EGFP-R扩增增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因。由于引物中携带用于重组克隆的同源臂，因此采用同源重组单片段一步连接酶将线性化pMV261质粒与绿色荧光蛋白基因连接，获得重组质粒pMV261-hsp60-EGFP，送至苏州金唯智生物技术有限公司进行测序验证。接着将重组质粒电转入分枝杆菌LY-1的感受态细胞中，涂布于终浓度为50 µg/mL的Kanr抗性平板上，30 ℃静置培养4−5 d，待菌体长出。挑取单菌落于分枝杆菌种子培养基中培养，使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对表达了增强型绿色荧光蛋白的菌株进行荧光测定。
1.2.2 分枝杆菌的基因操作分枝杆菌的质粒转化使用电击转化法。分枝杆菌基因组的提取使用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒。
1.2.3 分枝杆菌表达元件的筛选及插入经文献调研发现，与分枝杆菌LY-1 16S rRNA基因相似性呈100%的分枝杆菌VKM Ac-1817D，其全基因组以植物甾醇为底物做了转录组水平分析[20]，结果显示有3个区域的基因表达上调最明显，分别在分枝杆菌VKM Ac-1817D全基因组的1.1×106、2.3×106和5.5×106 bp处。原核生物基因的高转录表明该基因上游可能存在高强度的表达元件，所以本研究对分枝杆菌VKM Ac-1817D基因组这3个区域±0.5×106 bp内的基因上游进行了表达元件的搜索。研究室前期还对分枝杆菌LY-1甾醇代谢关键酶基因做了转录水平分析[4]，发现在以植物甾醇为底物时，有5个表达明显上调的关键酶基因，分别为基因fadA5、kstD3、kshB、kshA2和hsdB，因此将表达元件区域的筛选定位于这5个关键酶基因上游处。
筛选得到的表达元件区域利用启动子预测评分网站BDGP (https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)选择原核生物，评分不低于0.8的条件进行预测，最终从中筛选出23个评分在0.8及以上的表达元件核心基因序列。以预测得到的表达核心基因序列上游延伸10−60 bp，下游延伸至起始密码子ATG前，以其整体作为分枝杆菌内源性表达元件，这样既保证预测的启动子元件能够启动转录，又可以利用基因本身搭配启动子的RBS序列启动翻译。提取分枝杆菌LY-1的基因组作为PCR模板，设计引物扩增筛选得到的23个分枝杆菌内源性表达元件基因片段。报告系统质粒pMV261-hsp60-EGFP采用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切进行质粒线性化，切胶回收目的片段以去除hsp60表达元件基因序列，然后将扩增好的分枝杆菌内源性表达元件与线性化的质粒同源重组连接，构建不同启动子调控增强型绿色荧光蛋白表达的重组质粒(图 1)。
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| 图 1 内源性表达元件重组质粒构建图 Figure 1 Construction process of recombinant plasmid with endogenous expression element. "PX" is the name of the expression element. |
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将构建好的重组质粒电转入分枝杆菌LY-1中，挑取阳性菌落于分枝杆菌LY-1的种子培养基中培养，获得23株重组菌，然后重组菌按1%的接种量接种于分枝杆菌种子培养基中，培养至对数生长期(OD600在1.0−2.0)，每组实验设置3个平行。以pMV261空质粒为空白对照，hsp60作为标准高强度表达元件，待菌体生长至OD600为1.5时取样，经PBS洗涤重悬、细玻璃珠振荡5 min，再静置2 min后取100 μL加样至96孔板中，酶标仪测波长600 nm处的吸光值及在485 nm激发波长、535 nm发射波长处的荧光值，以单位吸光度下的荧光强度大小作为判定表达元件强弱的标准，实现分枝杆菌内源性表达元件的强度测定。
1.2.5 构建含Cas9蛋白的重组质粒采用穿梭质粒pMV261作为载体，密码子偏好性分析及密码子优化Cas9基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成至质粒pMV261的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，密码子优化的Cas9基因以Casf表示，以此来区分密码子未优化的Cas9[21]。选择质粒上的Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点进行质粒线性化，PCR扩增P10760、P06810、P25915强表达元件序列，P10970、P00068、P26490中等表达元件和P09240、P26180、P07820弱表达元件序列，重组质粒构建方法同1.2.1。
2 结果与分析 2.1 基于EGFP表达元件报告系统的构建以EGFP为报告基因，按照1.2.1中的方法在大肠杆菌JM109中构建重组质粒pMV261- hsp60-EGFP。将重组质粒pMV261-hsp60-EGFP电转入分枝杆菌LY-1中获得重组菌株。以带有空白质粒pMV261的分枝杆菌LY-1为对照，利用流式细胞仪和激光共聚焦观察重组菌中的荧光显示情况。如图 2所示，与对照相比，在激光共聚焦显微镜下观察，重组菌株显示出绿色荧光；流式细胞仪检测结果也显示，重组菌有明显的绿色荧光菌落(图 3)。这些均表明绿色荧光蛋白在分枝杆菌LY-1中成功表达，可以将其作为报告基因验证表达元件的强度。
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| 图 2 分枝杆菌LY-1 (pMV261-hsp60-EGFP)菌株的激光共聚焦结果 Figure 2 Laser confocal results of Mycobacterium sp. LY-1 (pMV261-hsp60-EGFP) strain. A：空白对照(pMV261)；B：重组菌(pMV261-hsp60-EGFP) A: Blank control (pMV261); B: Recombinant (pMV261-hsp60-EGFP). |
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| 图 3 分枝杆菌LY-1 (pMV261-hsp60-EGFP)菌株的流式细胞仪结果 Figure 3 Flow cytometry results of Mycobacterium sp. LY-1 (pMV261-hsp60-EGFP) strain. A：空白对照(pMV261)；B：重组菌(pMV261-hsp60-EGFP) A: Blank control (pMV261); B: Recombinant (pMV261-hsp60-EGFP). |
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BPROM网站是细菌σ70启动子识别程序，准确率和特异性能够达到80%，最适合用于ORF开始的直接上游区域，用于改进细菌中的基因和操纵子预测。采用该网站对筛选得到的表达元件核心序列的−10区和−35区进行预测，结果显示筛选得到的23个内源性表达元件均存在细菌保守的−10区和−35区(表 2)。
| 基因ID Gene ID |
表达元件 Expression element |
功能 Function |
预测的−35区和−10区 Predicted −35 zone and −10 zone (5′→3′) |
评分 Score |
| G155_04810 | P04810 | F420-dependent oxidoreductase coenzyme | ggcggctttggctggctgtcacacatcgagtagaacaggttctaacaatcg | 0.93 |
| G155_10585 | P10585 | Putative protein | tggcaactggacaagatttctcagctcgctggaattccactacgaggcggcgcaatact | 0.83 |
| G155_10665 | P10665 | Putative protein | ctgttgtagcatcgacgcgtatcaatttctagaagcaattctagttttgt | 0.87 |
| G155_10760 | P10760 | Enoyl-CoA hydratase | ggacttgcggaatgcactaccgataggtatacagtatgtatgtctgagcg | 0.84 |
| G155_10825 | P10825 | Putative cytochrome P450 hydroxylase | cgatttctttactgtaatgtttacggtaatctacttcagagcgatcggtc | 0.86 |
| G155_10835 | P10835 | Aldehyde dehydrogenase | ggatgactgtaaacaattcaggctggtcggacaatcggcttcgacctgtg | 0.92 |
| G155_10900 | P10900 | Rifampicin monooxygenase | ggtcttgcggcaaggcccccggggtggtgcagaatcgcctcccgcagttc | 0.81 |
| G155_26060 | P26060 | Putative oxidoreductase/short-chain dehydrogenase | accgttgacaaaccggggcgcacgttccgtatagtttacccaaccggagc | 0.91 |
| G155_00068 | P00068 | Putative protein | ttgaaaattcgctactgattgcaatcgcaaactaatgaactttgaatcgcggccgaa | 0.94 |
| G155_04700 | P04700 | Long-chain fatty acid AMP ligase, Mycobacterium subgroup FadD28 | cgtggatgtgattcataaggctactcaaatatagtttgctggctg | 0.89 |
| G155_04825 | P04825 | Putative protein | acaggcttcgcataggcagtctaattagatagtctcgcaacatcggggat | 0.80 |
| G155_04895 | P04895 | Ferredoxin | gtctgactggtattcgtcaggtgtggtcgtattctgtggctgcgcgcacg | 0.91 |
| G155_10590 | P10590 | Leucovorin deformylase | gatttactcaccggtacatgcaattttggcaaattaggagtttcatcatt | 0.92 |
| G155_10970 | P10970 | Putative protein | aatgtttgcgtgaccgaccgggctgcgtctagcatcgccaacgtgccaaggcgacttgtagtagcaacccgcagcggggtctgatcagaccgaccc | 0.95 |
| G155_11010 | P11010 | The glutathione reductase-like protein NrdH required for the reduction of ribonucleotide reductase class Ib | ggcgttttgccgtaagcgccgctttccggcaaaattcctgccgccggctg | 0.97 |
| G155_25915 | P25915 | Protein EspJ, a component of the type VII secretion system ESX-1 | ttgtgacaggtgggtcacccggggtccggtaaactccgcagcagtg | 0.87 |
| G155_25925 | P25925 | Proline- and alanine-rich protein EspK, a component of the type VII secretion system ESX-1 | gccctcattaaggcgatcgcaatcaatcacacaataaacacctatcatga | 0.86 |
| G155_04690 | P04690 | Putative protein | ttcgttgccgaaacggcggggaagaacaacagaataacgccgatagcagcgggagccg | 0.85 |
| G155_26180 | P26180 | Putative acetyl-CoA acetyltransferase FadA5 | acggcttgaccgcagatcaaaggcagtgatacatccgcgcttgtcagagt | 0.82 |
| G155_09240 | P09240 | 3-sterone-∆1-dehydrogenase | cggcgggtgaccaccatcaccccattggccaagattgcggtgcagctcac | 0.81 |
| G155_26490 | P26490 | 3-ketone steroid-9-α-hydroxylase reductase subunit | cttgtaatgacgggctggaccagcgcaagtacgtttttgtaacatgttct | 0.86 |
| G155_07820 | P07820 | Rieske (2Fe-2S) domain protein | gtttggggcgtcaacgtcagtcgccgcgacatcttcggaggtggtcct | 0.83 |
| G155_06810 | P06810 | Hydroxysteroid dehydrogenase | gcggtttggtttggctgccggggaggttgtaccctctttaaggccccgca | 0.80 |
以重组质粒pMV261-hsp60-EGFP为模板，分别用不同的表达元件替换原有重组质粒中的hsp60表达元件，构建不同内源性表达元件启动绿色荧光蛋白表达的重组质粒。如图 4所示，23个内源性表达元件重组质粒均构建成功。
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| 图 4 内源性表达元件重组质粒构建 Figure 4 Construction of recombinant plasmid of endogenous expression element. A：文献中3个高转录水平上调区域所预测得到的18个表达元件；B：5个关键基因前所预测得到的表达元件 A: 18 expression elements predicted from 3 up-regulated regions of high transcription level in the literature; B: The predicted expression elements of five key genes. |
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按照方法1.2.3对分枝杆菌内源性表达元件的强度进行表征，结果如图 5所示。筛选出的23个表达元件中存在4个高强度表达元件(P10760、P06810、P25915和P04690)，15个中强度表达元件(P11010、P04825、P10585、P10825、P10835、P10970、P10900、P00068、P10590、P25925、P26490、P10665、P04810、P26060和P04895)和4个弱表达元件(P04700、P09240、P26180和P07820)。表达元件的表达效果范围为1−16倍，其中有2个表达元件P10760、P06810的效果高于已报道的hsp60强表达元件。
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| 图 5 分枝杆菌LY-1中各内源性表达元件表达EGFP的荧光强度 Figure 5 Fluorescence intensity of EGFP expressed by endogenous expression elements in Mycobacterium sp. LY-1. |
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按照方法1.2.5构建不同强度的表达元件用于表达Cas9蛋白的重组质粒，并将构建好的重组质粒分别电转入分枝杆菌LY-1中，平板上培养4−5 d，观察其菌落数；并分别挑取单菌落接入分枝杆菌LY-1的种子培养基中培养4 d，检测各重组菌的生长情况。如图 6显示，在强表达元件(P10760、P06810和P25915)的调控下，平板上几乎无菌落长出，而且菌体生长受到严重的抑制，证实了Cas9蛋白的高表达对菌株有较大的毒性。在中等表达元件(P10970、P00068和P26490)的调控下，菌落数与生长状况有明显的提升；而使用弱表达元件(P09240、P26180和P07820)表达Cas9蛋白时，菌落数和菌株生长曲线的最高点几乎接近对照，表明弱表达元件表达Cas9蛋白显著降低了Cas9蛋白对菌株的毒害作用。综上所述，分枝杆菌LY-1中筛选得到的中等或弱强度内源性表达元件均能够有效降低Cas9蛋白对菌株的毒性，为分枝杆菌LY-1中构建CRISPR/Cas9基因编辑方法提供了良好的开端。
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| 图 6 分枝杆菌LY-1中不同内源性表达元件表达Cas9蛋白对菌株的影响 Figure 6 Effects of different endogenous expression elements expressing Cas9 protein on the strain in Mycobacterium sp. LY-1. A：不同内源性表达元件表达Cas9蛋白的重组菌菌落数；B：不同内源性表达元件表达Cas9蛋白的重组菌生长曲线。pMV261：含空载体的重组菌；P10760：内源性表达元件P10760表达Cas9蛋白的重组菌；其余同理 A: The colony count of recombinant bacteria expressing Cas9 protein with different endogenous expression elements; B: The growth curve of recombinant bacteria expressing Cas9 protein with different endogenous expression elements; pMV261: Recombinant bacteria with empty vector; P10760: Recombinant bacteria expressing Cas9 protein with endogenous expression element P10760, the rest are the same. |
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分枝杆菌作为生产甾体药物中间体的优势菌株，亟待开发便捷、高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统在分枝杆菌中的构建主要面临的挑战有：(1) Cas9蛋白对分枝杆菌有较大的毒性；(2) 分枝杆菌内源性同源重组能力较低。解决Cas9蛋白的毒性问题是分枝杆菌能否成功构建该系统的前提。研究者通常采用诱导型表达元件表达Cas9蛋白[22-23]，通过调整诱导剂的浓度来控制蛋白的表达量，降低其对菌株的毒性。由于诱导剂对一些菌株有毒性且存在渗漏表达的情况[24]，所以诱导型表达元件不具有广泛的通用性。因此，在分枝杆菌中筛选不同强度的内源性表达元件，不仅为调控Cas9蛋白的表达提供一系列表达元件，也为分枝杆菌代谢途径的改造工程提供了工具，具有非常重要的意义。
启动子与RNA转录起始有关，−35区是RNA聚合酶因子的识别位点，−10区是RNA聚合酶与DNA的结合位点，基因的高转录水平主要归因于较强的启动子[25-26]。RBS与蛋白翻译有关，存在于目标基因上游5−10 bp处。蛋白的表达不仅需要启动子对蛋白基因进行转录，还需要包含RBS序列以便于核糖体RNA的识别和结合。因此，本研究对基因组高转录水平区域进行筛选并将表达元件序列延伸至目标基因ATG前，使之包含天然的RBS。对得到的表达元件进行启动子特征序列分析，结果显示皆包含−35区和−10区2个保守区，这表明此种筛选方法可以准确地得到潜在的细菌内源性表达元件区域。
蛋白表达元件强度的调控是控制蛋白表达的一种重要手段[27]，为了调控分枝杆菌中Cas9蛋白的表达，需筛选一系列不同强度的表达元件。本研究筛选出23个不同强度的内源性表达元件，并采用强、中、弱3种不同的表达元件启动Cas9蛋白的表达，结果表明降低表达元件的强度，Cas9蛋白对菌株的毒害作用明显减弱，为CRISPR/Cas9系统在分枝杆菌中的构建提供可能。同时，分枝杆菌代谢途径中关键酶的表达元件也可以利用筛选得到的内源性表达元件进行替换，提高甾体药物中间体的产量或降低副产物的含量。因此，本研究为分枝杆菌蛋白表达提供了丰富的表达元件选择，为之后基因编辑方法的构建及代谢通路的改造奠定了基础。
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