微生物学通报  2022, Vol. 49 Issue (7): 2563−2574
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金针菇(Flammulina filiformis)，别名冬菇、朴蕈、绒毛柄金钱菌等，是一种著名食药用真菌[1-3]。金针菇中含有多种人体必需氨基酸和微量元素，其中赖氨酸和精氨酸尤为丰富，有利于儿童智力发育[4]，且经常食用可防治溃疡病[5]。金针菇以营养丰富、味美适口而广受大众的喜爱。其在全球各地均有分布，并在我国已实现工厂化栽培。据报道，中国目前是世界上最大的金针菇生产国，年产量为240万t[6]，且具有稳定的栽培生产模式与逐步扩大的工厂化栽培规模。子实体是食用菌的主要商品部位，也是真菌生殖生长的重要结构，其发育受到多种信号途径的调控。因此，金针菇子实体的发育具有很大研究价值。
有研究表明，真菌的子实体发育受交配型因子、转录因子、漆酶、蛋白激酶、疏水蛋白等因素的影响[7]。金针菇是典型的四极性异宗结合的食用菌，其中可亲和的交配型A位点和可亲和的交配型B位点编码的基因共同打开A和B交配型通路才能发育出正常子实体，完成其有性生殖[8]。交配型A位点和B位点都具有各自的信号转导通路。B交配型位点包含一个或多个亚位点，这些亚位点都含有一个信息素受体基因(PR)及侧翼的一个或多个信息素前体基因(Pp)。信息素可以激活另一可亲和菌株的相同亚位点编码的G蛋白偶联的信息素受体，继而激活B位点下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路[9]。
MAPK是一组能被不同的胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是金针菇信号通路的重要组成部分。细胞外信号传递到细胞内的目标是通过相互作用的蛋白质网络调节大量的细胞过程。在过去的十年里，许多实验室的累积努力已经阐明了这样一种信号机制，它涉及到几个膜信号分子的激活，随后是几个细胞质蛋白激酶的连续刺激，统称为丝裂原活化蛋白激酶信号级联。MAPK级联激活是多种信号通路的中心，是接收膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子，在许多细胞增殖相关信号通路中具有关键作用[10]。该级联多达6层，有助于传递信号的放大和特异性，最终激活细胞质和细胞核中的若干调节分子，从而启动细胞过程，如增殖、分化和发育[11]。MAPK链由3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成，通过依次磷酸化将上级信号传递至下游应答分子。MAPK信号通路包括：MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK。
目前，已经从酿酒酵母中鉴定出4种MAPK通路：信息素应答(pheromone response)、丝状生长、高渗压应答和细胞壁重建[12-14]。Paoletti等研究发现，同宗结合的子囊菌构巢曲霉在有性生殖过程中交配型基因和调控交配反应的MAPK级联途径关键酶基因的表达量都显著增加，并且调控交配反应的信号通路不受交配型基因的调控，而且MAPK基因突变会导致菌株不育[15]。陈天赐等发现，草菇B因子下游的MAPK信号途径中关键基因表达水平下降不利于草菇菌丝生长和出菇[16]。汪虹等研究发现，MAPK级联反应可能与调控生物体交配反应有关的基因表达构巢曲霉的形态分化以及其次生代谢物合成有关[17]。吕晓萌等发现，在金针菇菌柄发育过程中MAPK信号通路在转录组和蛋白组的kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)富集分析中均为差异通路[18]。吴雪兰发现在斑玉蕈菌丝发育过程中，MAPK信号通路中的CWI (cell wall integrity，CWI)信号通路与HOG (high-osmolarity glycerol pathway，HOG)信号通路具有分别参与调控斑玉蕈菌丝细胞壁的形成及适应环境变化的作用，共同调节斑玉蕈的生长发育过程[19]。解凡等发现MAPK通路在肺形侧耳低温胁迫响应中具有重要作用[20]。综上所述，MAPK信号通路在真菌多种生命活动中具有非常重要的作用。
食用菌子实体发育过程中，信息素信号通路也起到至关重要的作用。信息素(应答)信号通路中的同源基因在酵母和植物病原真菌中具有调控菌丝生长、菌落形态发育、无性繁殖和有性生殖、菌株致病性等功能[21-22]。有研究已经表明信息素启动的信号级联反应能够诱导双核菌丝的发育、子实体的形成和减数分裂过程中孢子的产生[23]。陈辉等对斑玉蕈菌丝由营养生长到生殖生长的整个过程中的信息素信号通路基因的差异表达进行分析，还监测了菌丝不同生长时间出菇对产量和品质的影响，从而对斑玉蕈中的信息素信号通路基因的功能进行系统分析[24]。然而在金针菇中，由信息素所启动的整条信息素信号通路基因的作用仍然研究较少。
在酵母中，cdc24基因突变后发现Cdc24对菌丝形态发生和生长是必不可少的[25]。同时，研究还表明Ste12是生长发育的关键调控因子，在营养缺乏的条件下，酵母细胞分化成能交配的细胞类型，并向丝状生长转变[21]。因此，MAPK反应途径下游的基因大都涉及细胞的增殖分化，以进一步实现有性生殖过程。然而MAPK信号通路中的信息素信号通路基因调控金针菇子实体形成和发育的机制仍然不清楚。
金针菇基因组测序结果已公布[26]，本研究基于金针菇转录组测序和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技术，对金针菇信息素信号通路中相关基因在子实体不同发育阶段的表达进行分析，为进一步解析信息素信号通路在金针菇生长发育过程中的生物学功能提供一定的数据基础。
1 材料与方法 1.1 供试菌株金针菇双核体菌株F19由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供。该菌株能够发育正常的黄色子实体[26]。
1.2 信息素信号通路基因注释单核体L11菌株是由F19菌株通过原生质体单核化方法而得到，L11基因组数据来自DDBJ/ EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，登录号为APIA00000000 (BioProject191865)。L11基因组注释数据由福建农林大学菌物研究中心提供。将注释到的信息素信号通路中的基因提交至NCBI的NR数据库在线BLAST比对。
1.3 总RNA提取及转录组测序F19出菇过程参照文献[26]的方法。在F19菌丝扭结形成原基后10 d和25 d，用消毒解剖刀取各时期样品，进行冷激处理并用锡箔纸进行封存，置于−80 ℃超低温冰箱进行保藏备用(图 1)。此后使用植物总RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit，OMEGA公司)提取样品总RNA，提取过程按照说明书操作。使用Agilent 2100对建库用总RNA进行浓度和完整性检测。
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| 图 1 金针菇子实体不同发育时期组织样品 Figure 1 Samples of different developmental stages of Flammulina filiformis. A：原基；B：伸长期菌柄；C：伸长期菌盖；D：成熟期菌柄；E：成熟期菌盖 A: Primordium; B: Elongation stipe; C: Elongation pileus; D: Maturation stipe; E: Maturation pileus. |
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委托上海欧易生物医学科技有限公司将检测合格的总RNA进行建库后，使用Illumina HiSeqTM 2500测序仪进行测序，产生2×125 bp的双末端数据。每个样品设置3个生物学重复。使用fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments (FPKM)方法计算MAPK信号通路中各基因的表达量[27]。
1.4 实时荧光定量PCR采用RT-qPCR的方法检测金针菇在不同生长发育时期信息素信号通路关键基因的表达量。RNA提取方法参照1.3，然后将金针菇各时期样品RNA根据HiScript® Ⅲ RT SuperMix for RT-qPCR (诺唯赞，南京)的说明书，反转录成cDNA，–20 ℃保存备用。
本研究所用的RT-qPCR内参基因是金针菇的β-actin基因(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)[28]，引物(表 1)由青岛睿博兴科生物技术有限公司合成。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂，RT-qPCR反应体系及程序按照定量荧光试剂盒的使用说明书进行(两步法)，退火温度设置为60 ℃，循环数设为40，每个反应进行3个平行试验。基因相对表达量依据2–ΔΔCt方法进行计算[29-30]。
| 基因名称 Gene No. |
引物序列 Primer sequence (5′→3′) |
| ACTB-F | GATCGTATGCAGAAGGAGTTGACAC |
| ACTB-R | CCACTCTCGTCGTACTCTTGCTTG |
| GAPDH-F | CCTCTGCTCACTTGAAGGGT |
| GAPDH-R | GCGTTGGAGATGACTTTGAA |
| cdc24-F | ATCGTCTTCGTCCGCTATCA |
| cdc24-R | TGAACTTCTGGGAACCATTTT |
| ste12-F | GTGGGTGGACCTGGGATGAC |
| ste12-R | ATGCTGCTGGTGGTGCTGAT |
基于金针菇单核体菌株L11基因组数据对信息素信号通路进行注释分析(表 2)。通过NCBI注释了8个信息素信号通路相关基因，与其他真菌的同源基因都具有较高的一致性。其中gene8607与Coprinopsis cinerea GTP结合蛋白Cdc42一致性为82%；gene1088与Flammulina filiformis鸟嘌呤核苷酸交换因子Cdc24一致性高达99%；gene8083与Flammulina filiformis极性蛋白Bem1一致性高达99%；gene7282与Schizophyllum commune H4-8 ste20-like蛋白一致性为84%；gene9504与Volvariella volvacea STE11蛋白一致性为85%；gene4683与裂褶菌H4-8 ste7-like蛋白一致性高达92%；gene32与Aspergillus homomorphus激酶蛋白一致性为80%；gene186与Aureobasidium melanogenum同源结构域家族转录因子STE12 mRNA一致性为74%。由于MAPK通路的保守性，所以该通路相关基因在金针菇不同菌株中也极为相似，而金针菇不同菌株间一致性的极小差异(约1%)是由于不同菌株之间核苷酸序列上存在着自然界生物中广泛存在的SNP位点而产生的[31]。
| 基因ID gene ID |
GenBank登录号 GenBank accession No. |
描述 Description |
物种 Species |
E值 E-value |
一致性 Identity (%) |
| gene8607 | XM_001833721.2 | GTP binding protein Cdc42 | Coprinopsis cinerea | 9e−123 | 82 |
| gene1088 | MN661161.1 | Guanine-nucleotide exchange factor Cdc24 gene | Flammulina filiformis | 0 | 99 |
| gene8083 | MN661160.1 | Polarity protein Bem1 gene | Flammulina filiformis | 0 | 99 |
| gene7282 | XM_003032752.2 | H4-8 ste20-like protein | Schizophyllum commune | 2e−43 | 84 |
| gene9504 | KC748447.1 | STE11 protein gene | Volvariella volvacea | 8e−26 | 85 |
| gene4683 | XM_003034025.1 | H4-8 ste7-like protein | Schizophyllum commune | 1e−06 | 92 |
| gene32 | XM_025690173.1 | Pkinase-domain-containing protein | Aspergillus homomorphus | 3e−06 | 80 |
| gene186 | MN086872.1 | Homeodomain family transcription factor STE12 mRNA | Aureobasidium melanogenum | 2e−21 | 74 |
转录组测序每个样品数据过滤后得到clean bases为2.5 G。每个样品定位到参考基因组的总reads均达到88.35%以上(表 3)。测序质量较好，能够用于后期的数据分析。转录组数据已提交至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，登录号为PRJNA725643 (BioProject)。
| 样品 Sample |
总reads数 Total reads |
总定位reads数 Total mapped reads |
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| 原基 Primordium |
PR-1 | 13 180 000 | 11 730 394 (89.00%) |
| PR-2 | 14 060 270 | 12 474 939 (88.72%) | |
| PR-3 | 15 534 922 | 13 871 588 (89.29%) | |
| 伸长期菌柄 Elongation stipe |
ES-1 | 16 136 676 | 14 262 342 (88.38%) |
| ES-2 | 16 949 982 | 15 068 103 (88.90%) | |
| ES-3 | 18 445 804 | 16 297 184 (88.35%) | |
| 伸长期菌盖 Elongation pileus |
EP-1 | 16 559 622 | 14 848 028 (89.66%) |
| EP-2 | 16 848 370 | 15 114 392 (89.71%) | |
| EP-3 | 17 714 844 | 15 907 489 (89.80%) | |
| 熟期菌柄 Mature stipe |
MS-1 | 17 193 950 | 15 290 110 (88.93%) |
| MS-2 | 15 340 044 | 13 670 715 (89.12%) | |
| MS-3 | 15 959 110 | 14 233 650 (89.19%) | |
| 熟期菌盖 Mature pileus |
MP-1 | 16 496 902 | 14 642 491 (88.76%) |
| MP-2 | 15 554 088 | 13 786 641 (88.64%) | |
| MP-3 | 14 682 558 | 13 033 496 (88.77%) | |
基于转录组数据分析金针菇信息素信号通路基因在子实体各个发育时期的表达模式(图 2)。cdc42 (gene8607)在伸长期菌柄中上调表达，在成熟期菌柄中下调表达；cdc24 (gene1088)在原基时期表达量最高，于伸长期菌柄下调表达，在成熟期菌柄上调表达；bem1 (gene8083)在原基时期表达高；ste20 (gene7282)在伸长期菌盖下调表达；ste11 (gene9504)在伸长期菌柄下调表达；ste7 (gene4683)在各个时期表达稳定，可作为金针菇内参基因候选；ste7 (gene32)在成熟期菌柄下调表达；ste12 (gene186)在伸长期菌盖上调表达。
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| 图 2 信息素信号通路基因在子实体各发育时期表达模式 Figure 2 Expression of the pheromone signal pathway genes in different developmental stages of fruiting body. A：cdc42基因各发育时期FPKM；B：cdc24基因各发育时期FPKM；C：bem1基因各发育时期FPKM；D：ste20基因各发育时期FPKM；E：ste11基因各发育时期FPKM；F：ste7 (gene4683)基因各发育时期FPKM；G：ste7 (gene32)基因各发育时期FPKM；H：ste12基因各发育时期FPKM。PR：原基；ES：伸长期菌柄；EP：伸长期菌盖；MS：成熟期菌柄；MP：成熟期菌盖。数据为平均值±标准误，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) A: FPKM of cdc42 genes in development stage; B: FPKM of cdc24 genes in development stage; C: FPKM of ste20 genes in development stage; D: FPKM of bem1 genes in development stage; E: FPKM of ste11 genes in development stage; F: FPKM of ste7 (gene4683) genes in development stage; G: FPKM of ste7 (gene32) genes in development stage; H: FPKM of ste12 genes in development stage. Data are mean±SE, different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
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其中，基因cdc24和ste12在不同发育时期表达差异显著，表明这2个基因可能参与子实体发育过程的调控。进一步使用RT-qPCR技术对这2个基因的表达模式进行了验证。
2.3 实时荧光定量PCR结合信息素信号通路中的基因在金针菇子实体不同发育时期的表达模式，进一步用RT-qPCR验证。结果显示，RT-qPCR与转录组数据表达一致(图 3)，2个基因(cdc24和ste12)分别在原基时期和伸长期菌盖表达量达到了最高峰，并且在不同发育时期表达量也有所差异。因此，推断该基因可能在金针菇的子实体形成中起到重要作用。
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| 图 3 信息素信号通路基因各发育时期FPKM与RT-qPCR Figure 3 FPKM and RT-qPCR of the pheromone signal pathway genes in developmental stage. A：cdc24基因各发育时期FPKM和RT-qPCR；B：ste12基因各发育时期FPKM和RT-qPCR。PR：原基；ES：伸长期菌柄；EP：伸长期菌盖；MS：成熟期菌柄；MP：成熟期菌盖。数据为平均值±标准误，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) A: FPKM and RT-qPCR of cdc24 genes in development stage; B: FPKM and RT-qPCR of ste12 genes in development stage. PR: Primordium; ES: Elongation stipe; EP: Elongation pileus; MS: Maturation stipe; MP: Maturation pileus. Data are mean±SE, different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
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绝大多数食用菌以子实体作为主要食用部分，因此关于食用菌子实体发育机制的研究具有重要科学意义。金针菇作为我国工厂化栽培较为成熟的食用菌，具有稳定的栽培参数和标准化的培养模式。此外，金针菇具有清晰的遗传背景和完善的基因组数据，遗传操作技术也已经成功在金针菇上运用。因此，金针菇比较适宜作为食用菌生长发育机制研究的模式材料。近年来，科研工作者运用分子生物学技术已经解析了很多与金针菇子实体发育相关的基因功能。Tao等研究表明，金针菇疏水蛋白编码基因Hyd9过表达后，会产生更多的气生菌丝，并且原基数量明显增多[32]。HMG-box转录因子PDD1促进金针菇子实体的发育并显著提高其产量[33]，然而同为HMG-box家族的转录因子FvHmg1抑制了金针菇子实体发育[34]。一个WD40编码基因Fvcpc2正调控金针菇的子实体发育，提高了其产量[35]。金针菇Fvclp1基因能够抑制菌丝的生长速度，但能促进子实体发育的过程[36]。这些重要基因功能的解析为金针菇生长发育过程研究提供了很多参考，但仍需进一步阐明金针菇对环境应答和子实体发育的信号调控网络。MAPK级联激活是多种信号通路的中心，参与到细胞的分裂、分化、凋亡等多种生命过程[37-38]。这一途径广泛存在于各种真核生物(酵母、植物、哺乳动物)中，起到承上启下及整合、放大和传递信号的作用[39]。金针菇由单核菌丝质配为可结实的双核菌丝受到交配位点A和B的控制[40-41]。交配型位点B下游的信息素信号通路属于MAPK信号通路的一部分。信息素信号通路中的相关基因已经被证实能够参与调节酵母和丝状真菌的交配、生长发育和形态建成等生命活动[42-45]。本研究通过分析金针菇信息素信号通路各时期的转录组数据，筛选到了cdc24和ste12为显著差异表达的基因。
Cdc24与Ste12在真菌形态建成中至关重要。Si等研究发现Cdc24是建立菌丝极性所必需的并定位于菌丝尖端，还发现Rga1h在分生孢子梗发育过程中抑制分枝是必要的[46]。Song等在莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)中克隆了Mrcdc24基因，通过沉默突变体菌株发现突变体菌丝生长表型发生显著变化，分生孢子产量、微菌核产量和毒力均降低[47]。ste12基因最早是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中被发现的，是MAPK通路下游一个关键的调控因子[22]，其功能主要是调控酵母细胞的交配反应、假菌丝发育及侵入生长[48-49]。Madhani等已经证实ste12基因也存在于丝状真菌，以及人类和植物的一些病原菌中[50]。庄淼等通过双分子荧光互补技术证实蛋白质Fus3和Ste12在无性繁殖菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)体内发生互作，暗示它们通过互作可能参与除了有性生殖之外的其他细胞功能，并为米曲霉蛋白互作功能研究提供了一种新的检测技术和方法[51]。刘文魁综合试验结果认为，果生刺盘孢转录因子CfSte12参与分生孢子萌发、附着胞形成及其对寄主的穿透和定殖等致病过程，并且参与调控子囊壳、子囊及子囊孢子产生等有性器官的发育[52]。张运峰等的研究表明，ste12基因不仅调控玉米大斑病菌的分生孢子发育和致病力形成，而且参与玉米大斑病菌的渗透胁迫调控[53]。通过转录组数据对MAPK信号通路中的信息素信号通路基因进行分析发现，在信息素信号通路中，基因cdc24和ste12表达差异显著且与金针菇发育时期的变化存在明显相关性。陈辉等对斑玉蕈生长发育过程中信息素信号通路基因的研究表明，大多数基因在原基时期表达量最高，在子实体成熟期这些基因表达量下降，其中cdc24基因在原基形成前不断上调表达，至原基时期表达量达到高峰，随后在子实体时期表达量下调，ste12基因表达量变化与cdc24基因表达基本一致[24]。在本研究中，cdc24基因在金针菇原基时期表达量也达最高峰，而在子实体形成后的伸长期、成熟期菌柄菌盖中表达量降低，而ste12基因在伸长期菌柄中达到最高。结合他人研究结果与我们的转录组测序和实时荧光定量PCR，我们得出，从金针菇菌丝扭结形成原基到子实体发育过程中，ste12与cdc24基因表达量在原基时期表达较高并且在不同发育时期表达量也有所差异。因此，ste12与cdc24基因可能在金针菇的子实体形成过程中起到重要作用。下一步将使用遗传操作技术，构建这2个基因的过表达和敲低表达金针菇突变体菌株，明确它们的生物学功能。从而为深入探究金针菇和其他食用菌的子实体的生长发育机制提供一定的参考数据。
致谢: 感谢福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供了金针菇双核体菌株F19；感谢山东省农业微生物重点实验室和山东农业大学菌物实训实践基地为本研究提供了试验条件。| [1] |
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表1(Table 1)
