2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 李荣, 徐文怡, 李永才, 毕阳, 张苗, 蒋倩倩, 刘勇翔
- LI Rong, XU Wenyi, LI Yongcai, BI Yang, ZHANG Miao, JIANG Qianqian, LIU Yongxiang
- 梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控
- Cloning of hnr and characterization of its regulatory role in the infection structure differentiation of Alternaria alternata
- 微生物学通报, 2022, 49(7): 2550-2562
- Microbiology China, 2022, 49(7): 2550-2562
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.211047
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文章历史
- 收稿日期: 2021-11-09
- 接受日期: 2021-12-06
- 网络首发日期: 2022-01-25
早酥梨(Pyrus bretchneideri ‘Zaosu’)是中国西北地区主要种植的梨品种，具有果大核小、果皮翠绿、质地酥脆、汁多味甜等特点，备受消费者的青睐[1]。然而早酥梨采后贮藏期间品质劣变和腐烂比较严重，容易造成严重的经济损失，其中由互隔交链孢(Alternaria alternata)引起的黑斑病为主要的采后病害[2]。A. alternata是一种常见的潜伏侵染真菌，广泛地存在于土壤、各种植物和腐烂的植物残骸中，可以侵染多种水果和蔬菜而引起黑斑病。A. alternata菌丝和孢子细胞壁中均可以产生黑色素，黑色素赋予病原真菌对紫外线等外源胁迫的抗性[3-4]，但其在病原中的调控机制尚需进一步揭示。
黑色素是一种普遍存在于生物体的酚类聚合物疏水色素，主要分为1, 8-间苯二酚(1, 8-dihydroxynaphthalene，DHN)和3, 4-二羟基苯丙氨酸(3, 4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)两种[5]。子囊菌亚门和半知菌真菌如链格孢菌、灰霉菌、稻瘟病菌、玉米小斑病菌、炭疽菌、玉米大斑病菌、罗伯茨绿僵菌和大丽轮枝菌等均能合成DHN黑色素[6]。植物病原真菌DHN黑色素底物为醋酸盐，首先由聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)聚合后形成四羟萘(1, 3, 6, 8-tetrahydroxynaphthalene，4HN)，然后通过四羟基萘还原酶(1, 3, 6, 8- tetrahydroxynaphthalene reductase，4HNR)的脱氢反应生成小柱孢酮(scytalone)，小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase，SCD)继而脱水形成了三羟萘(1, 3, 8-trihydroxynaphthalene，3HN)，再由三羟基萘还原酶(1, 3, 8-trihydroxynaphthalene reductase，3HNR)脱氢形成柱孢醌(vermelone，VER)，小柱孢酮脱水酶再次脱水形成二羟萘(1, 8-dihydroxynaphthalene，1, 8-DHN)，最后经过氧化反应聚合形成DHN黑色素[7-10]。已有研究发现，DHN黑色素可以有效清除羟自由基、活性氧自由基和DPPH，也可以使生物体免受辐射伤害[11]。同时，作为病原真菌产生的一种次级代谢产物，黑色素既可以增强病原菌抗逆能力，也与其致病性有关[12]。
hnr基因参与了DHN黑色素生物合成途径中两步重要的还原脱氢反应，有研究表明，HNR属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/ reductase，SDR)超家族，含有保守的辅酶结合位点与催化位点[13]，三环唑通过抑制HNR的活性成为DHN黑色素合成的特异性抑制剂之一。研究发现，在稻瘟病菌和烟曲霉中3hnr可以参与两步脱氢反应，但主要参与第二步脱氢反应，4hnr只参与第一步脱氢反应；同时发现3hnr与4hnr均与致病力密切相关，还会降低附着胞的数量，从而影响穿透能力[8, 14-15]。在胡麻叶斑病菌中的研究发现，4hnr基因突变体可以影响黑色素的合成并提高其应对紫外胁迫的能力[16]。在灰葡萄孢中的研究发现，4hnr基因突变体不影响菌丝的生长，但在培养后期会使菌核及分生孢子的颜色变为浅褐色，同时该基因对致病力也无影响[17]。在番茄互隔交链孢中的研究发现，3hnr基因突变体会影响分生孢子的大小、形状及颜色，降低抵抗紫外胁迫的能力[18]。在瓜类炭疽病菌中的研究发现，3hnr基因突变体会影响致病力[19]。综上所述，HNR在真菌病原生长发育及致病性的调控方面具有多样性。
植物病原真菌首先通过孢子黏附在寄主表面，感知并识别表皮物化信号后，通过信号级联反应将信号传递下去，从而激活侵染或致病相关基因的表达，进而启动侵染过程。细胞信号传导通路包括MAPK级联信号通路、cAMP-PKA信号途径、Ca2+信号传导和G蛋白耦联信号通路等。本实验室前期研究发现，梨果黑斑病菌A. alternata中MAPK信号级联途径[20]、cAMP-PKA[21]和Ca2+信号传导途径[22]均参与了A. alternata响应果实表皮信号物质，进而启动侵染结构分化的过程，同时在实验中还发现信号途径相关基因进行敲除后，A. alternata黑色素含量均产生了变化。为了阐明黑色素在A. alternata侵染结构形成过程中的调控作用，本研究对梨果黑斑病菌A. alternata hnr基因进行克隆和生物信息学分析，同时使用黑色素合成途径中HNR特异性抑制剂三环唑进行药理学实验，并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行测定，以期为进一步揭示DHN黑色素对A. alternata侵染结构分化调控的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株A. alternata JT-03菌株分离于早酥梨的病斑部位，本实验室保存，于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28 ℃培养。
1.1.2 供试试剂克隆载体pClone007 Versatile Simple Vector Kit、DNA Marker和大肠杆菌DH5α感受态购于北京擎科生物科技有限公司；胶回收试剂盒及TRIzol试剂均购自北京天根生化科技有限公司；cDNA反转录试剂盒购于TaKaRa公司。
1.2 方法 1.2.1 获取Aa4hnr和Aa3hnr基因序列使用NCBI数据库查找得到A. alternata (ID登录号为SRC11rK2f)中Aa4hnr基因(基因登录号为29116424)与Aa3hnr基因(基因登录号为29117620)。
1.2.2 提取RNA及反转录cDNA样品总RNA的提取使用TRIzol试剂进行，经过反转录后获得cDNA，具体步骤参照试剂说明书。
1.2.3 克隆Aa4hnr和Aa3hnr基因编码区(coding sequence，CDS)根据已测序的A. alternata (taxon：5599，SRC11rK2f)基因组序列，使用软件DNAMAN 6.0分别设计4hnr和3hnr的扩增引物(表 1)，使用A. alternata JT-03的cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)：2×Phanta Max Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，F/R引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/min，33个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后，通过凝胶检测后进行胶回收，将胶回收产物与pClone007 Versatile Simple Vector Kit载体连接后进行测序。
| 基因 Gene |
序列 Sequence (5′→3′) |
长度 Length (bp) |
| Aa4hnr | F: ATGGTCATCAACGTGCCCA | 1 266 |
| R: TTACTGCGACGAGCCACCAG | ||
| Aa3hnr | F: ATGGCATCAATCGAGCAGAC | 1 356 |
| R: TTACATGCAAGCAGCGCC |
使用NCBI数据库中BLAST在线分析工具，对氨基酸序列的同源性进行分析，并下载其他真菌中4hnr和3hnr编码蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 7.0软件使用邻近法构建系统发育树，bootstrap值设定为1 000；通过在线分析工具gene structure display server (GSDS)分析基因的结构；利用ORF Finder预测DNA序列开放阅读框(open reading frame，ORF)；采用SOPMA预测蛋白二级结构；通过conserved domain search软件分析Aa4hnr和Aa3hnr基因保守结构域，相关预测网址汇总见表 2。
| Online software | Internet site | Use |
| GSDS 2.0 | http://gsds.cbi.pku.edu.cn/chinese.php?input=se | 基因结构 Genestructure |
| ORF Finder | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder | 开放阅读框 Open reading frame |
| SOPMA | http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html | 蛋白二级结构 Protein secondary structure |
| Conserved domain search | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ | 保守结构域 Conserved domain |
参照高春丽等[23]配制孢子悬浮液的方法并稍做修改，在无菌操作台中，将10 mL无菌水加入培养了5 d的A. alternata JT-03中，使用无菌涂布器轻轻刮取培养基表面，用四层无菌纱布过滤除去菌丝后收集至50 mL无菌离心管中。振荡均匀后，吸取20 μL孢子悬液滴加在血球计数板上，放置于光学显微镜下进行镜检计数，最终配制浓度为1×105 spores/mL。
1.2.6 三环唑处理对A. alternata菌落形态的影响菌落形态观察参照刁春英等[24]的方法并做修改。经过前期的浓度筛选工作，称取3 mg三环唑溶解于100 μL DMSO，经无菌0.22 μm有机膜过滤除菌后，加入100 mL已灭菌的PDA培养基，使得最终浓度为30 μg/mL。经过混合均匀后倒入直径为7 cm的培养皿。等培养基凝固后接种培养了6 d后的A. alternata JT-03孢子悬浮液2 μL，然后在28 ℃的条件下恒温培养，每天拍照记录菌落形态、测量菌落直径，添加等量的DMSO作为对照处理。每个处理3个平行，重复3次。
1.2.7 三环唑处理对黑色素含量的影响参照张苗[21]的方法进行黑色素的提取、纯化与测定。
1.2.8 三环唑处理对A. alternata侵染结构形成的影响将浓度为1×105 spores/mL的A. alternata孢子悬浮液(1 mL)以5 000 r/min离心5 min，弃上清液，向沉淀物中加入1 mL终浓度为30 μg/mL的三环唑溶液。吸取20 μL孢子悬液滴加到置于载玻片上方的疏水膜，并将其放置于铺有潮湿滤纸的玻璃培养皿，在28 ℃培养条件下分别于2、4、6、8 h使用染色液乳酸酚棉兰染色后，通过光学显微镜计数计算孢子萌发率及附着胞形成率。每个处理3个平行，每次计数100个分生孢子。
1.2.9 三环唑处理对A. alternata致病性的影响挑选大小均一、无机械伤的早酥梨，使用0.1%次氯酸钠水溶液浸泡2 min消毒，再次用清水进行冲洗，置于室温条件下晾干。用75%乙醇沿梨果实赤道部位擦拭后，使用接种钉(直径为3 mm，深3 mm)沿赤道部位均匀打3个孔，每孔内接20 μL浓度为30 μg/mL三环唑处理的A. alternate JT-03孢子悬浮液，室温放置2 h，装入干净的保鲜盒进行贮藏。接种后从第3天开始每间隔3 d测量果实表面的病斑直径，拍照记录果实病斑扩展情况。每个处理使用9个果实测定，重复3次。
1.2.10 Aa4hnr和Aa3hnr基因在A. alternata侵染结构分化中的表达分析将浓度为1×106 spores/mL的A. alternata孢子悬浮液振荡后滴加在疏水膜上，分别在28 ℃培养2、6、8 h后取样。提取样品RNA，具体操作步骤参照1.2.2进行。根据Aa4hnr和Aa3hnr基因序列，使用Premier 5设计实时荧光定量引物，见表 3。使用RT-qPCR技术分析Aa4hnr和Aa3hnr基因在侵染结构不同分化时期的表达量变化情况。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40个循环。反应体系(20 μL)：Master Mix 10 μL，引物F/R (10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。各基因转录水平分别用内参基因GAPDH调平，每个样品3个平行，结果均以2 h基因表达量为对照，数据采用2−ΔΔCT公式进行分析。
| 基因Gene | 序列Sequence (5′→3′) |
| Aa4hnr | F: CATTTGAAACGGGACTGC |
| R: TCCGAAGAAACGAACACC | |
| Aa3hnr | F: CGACATCTGCTGCTCAAACTC |
| R: CCTCTTGTACGCCGCCTTA |
实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，作图软件使用Origin 8.0；数据方差分析软件使用SPSS 20.0，差异分析使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和邓肯氏(Duncan’s)多重比较，在P=0.05水平上进行差异显著检测。
2 结果与分析 2.1 Aa4hnr和Aa3hnr基因的克隆从梨果黑斑病菌A. alternata中提取总RNA，进行反转录生成cDNA，使用引物对Aa4hnr-F/R、Aa3hnr-F/R进行目的基因的扩增，产物的凝胶电泳鉴定结果如图 1所示，对PCR扩增产物进行胶回收测序，比对后得到长度分别为807、804 bp的Aa4hnr、Aa3hnr基因的cDNA序列，它们分别编码268、267个氨基酸。
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| 图 1 Aa4hnr和Aa3hnr基因扩增电泳图 Figure 1 Amplification electrophoretogram of Aa4hnr and Aa3hnr genes. M: DL2000 DNA Marker. |
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将Aa4hnr和Aa3hnr基因通过软件DNAMAN翻译成氨基酸序列，利用NCBI数据库下载其他真菌的4hnr和3hnr基因序列，通过邻近法进行系统发育树的构建。由图 2可知，Aa4hnr与Ophiobolus disseminans的4hnr基因具有较高的一致性，位于同一个分支，亲缘关系较近，Aa3hnr与Alternaria arborescens的3hnr基因具有较高的相似性，位于同一个分支，亲缘关系较近，但是这2个基因不属于同一个还原酶基因类群。
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| 图 2 Aa3HNR和Aa4HNR与其他真菌HNR同源蛋白的系统发育分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of Aa3HNR and Aa4HNR and other fungal HNR homologous proteins. 括号中为不同真菌HNR蛋白登录号；距离标尺表示为单位长度置信值；分支节点上的数字为bootstrap自展值 The accession numbers of different fungal HNR protein are in parentheses; At the branch nodes are 1 000 bootstrap replicates represented as percentage values; The distance scale is expressed as the confidence value of unit length. |
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使用在线软件GSDS 2.0分析测序结果可知，Aa4hnr基因全序列长度为1 266 bp，CDS长度为1 266 bp，编码268个氨基酸，不含有内含子。使用ORF Finder软件分析Aa4hnr基因开放阅读框，发现共有9个ORF。Aa3hnr基因全序列长度为1 356 bp，CDS长度为1 256 bp，编码了267个氨基酸，含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子，有17个开放阅读框。
2.2.3 Aa4hnr和Aa3hnr基因编码产物的二级结构分析采用在线软件SOPMA对Aa4hnr (图 3A)和Aa3hnr (图 3B)基因编码产物的二级结构进行预测，编码产物由蓝、红、绿和紫代表的元件组成。Aa4hnr基因编码产物含有40.3% α螺旋(alpha helix)、32.84%无规则卷曲(random coil)、18.66%延伸链(extended strand)和8.21% β转角(beta turn)。Aa3hnr基因编码产物含有41.95% α螺旋、31.09%无规则卷曲、18.35%延伸链和8.61% β转角。Aa4hnr和Aa3hnr编码产物主要的二级结构元件均为α螺旋与无规则卷曲。
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| 图 3 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)编码蛋白的二级结构分析 Figure 3 Secondary structure analysis of Aa4hnr A) and Aa3hnr (B) gene coding protein. 蓝色：α螺旋；紫色：无规则卷曲；绿色：β转角；红色：延伸链 Blue: Alpha helix; Purple: Random coil; Green: Beta turn; Red: Extended strand. |
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通过conserved domain search软件分析可知，Aa4hnr (图 4A)和Aa3hnr (图 4B)所编码的蛋白均含有NAD(P)结合域，这个结构域保守性很强，存在于如糖酵解和许多其他氧化还原酶的代谢途径中。此外，2个还原酶均属于SDR家族。
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| 图 4 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)基因保守结构域 Figure 4 Conserved domain of Aa4hnr (A) and Aa3hnr (B) genes. |
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由图 5A可知，30 μg/mL三环唑处理后A. alternata菌落的颜色产生了明显的变化，从墨绿色变为红褐色，同时黑色素的合成也显著被抑制(图 5B)，处理组黑色素的含量仅为对照组的66.5%，且三环唑处理对A. alternata菌丝扩展具有抑制作用(图 5C)。
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| 图 5 三环唑处理对A. alternata菌落形态(A)、黑色素含量(B)和菌丝生长(C)的影响 Figure 5 The effect of tricyclazole treatment on morphology (A), melanin content (B) and mycelium growth (C) of A. alternata. *: P < 0.05. The same below. |
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由图 6可知，虽然随着培养时间的延长A. alternata的孢子萌发，附着胞形成率均呈现上升趋势，但三环唑处理明显抑制了A. alternata分生孢子在疏水表面的萌发率(图 6A)与附着胞的形成率(图 6B)。在培养2 h时，处理组的孢子萌发率仅为对照组的57.5%；而在培养4 h时，处理组的附着胞形成率仅为对照组的34.3%。
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| 图 6 三环唑处理对A. alternata在疏水表面上孢子萌发率(A)和附着胞形成率(B)的影响 Figure 6 The effect of tricyclazole treatment on spore germination (A) and appressorium formation (B) of A. alternata on hydrophilic surface. |
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三环唑处理显著抑制了损伤接种A. alternata的早酥梨黑斑病的扩展(图 7)。虽然随着贮藏时间的延长果实病斑直径逐渐增加，但三环唑处理的病斑直径显著小于对照组(P < 0.05)，在第6天时，处理组的病斑直径仅为对照组的73.5% (图 7B)。
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| 图 7 三环唑处理对果实的病害扩展(A)和病斑直径(B)的影响 Figure 7 The effect of tricyclazole treatment on lesion morphology (A) and lesion diameter (B) of the fruit. |
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为了解hnr基因在A. alternata侵染结构不同分化阶段的表达情况，提取A. alternata总RNA，通过RT-qPCR分析在疏水诱导A. alternata侵染结构分化过程中的基因表达情况，结果表明，Aa4hnr和Aa3hnr在A. alternata侵染结构分化的不同阶段表达存在差异。Aa4hnr基因在A. alternata侵染结构分化的各个时期表达量均发生下调(图 8A)，Aa3hnr基因的表达量在附着胞形成阶段(6 h)下调，而在侵染菌丝形成阶段(8 h)显著上调表达(图 8B)。
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| 图 8 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)在疏水诱导A. alternata侵染结构分化中的表达水平 Figure 8 Relative expression analysis of Aa4hnr (A) and Aa3hnr (B) in A. alternata under hydrophilic surface. 不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05). |
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本研究从梨果黑斑病菌中克隆得到了羟基萘还原酶基因Aa4hnr和Aa3hnr，序列分析表明它们都属于SDR家族，两者有共同的保守结构域，但通过DNAMAN软件对编码产物的氨基酸序列进行对比发现，A. alternata中这2个基因的氨基酸序列相似性仅为45.9%，同样地，在稻瘟病菌[8]、玉米大斑病菌[25]和里氏木霉[26]中这2个基因编码的蛋白质序列的相似性也分别仅为46%、45.9%和44%，表明4HNR和3HNR这2个酶分别属于不同的还原酶类群。郭欣欣[27]在玉米大斑病菌证实了St4HNR和St3HNR分别属于不同的还原酶类群，可见其蛋白序列及结构差异可能是导致其功能差异的原因。
羟基萘还原酶专一性抑制剂三环唑处理显著抑制了A. alternata黑色素的合成(图 5B)，同样有研究发现，三环唑处理对深色有隔内生真菌(dark septate endophytic species)[28]、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)[29]、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)[30]和桑椹菌核病菌(Scleromitrula shiraiana)[13]的黑色素生物合成均有抑制作用，进一步证实了羟基萘还原酶是DHN黑色素合成途径中的关键作用酶。同时本研究还发现，三环唑处理显著抑制了疏水性诱导的A. alternata孢子萌发和附着胞形成(图 6)，在球毛壳菌(Chaetomium globosum)[31]研究中发现，使用三环唑处理后降低了产孢量与孢子的萌发率。何玉莲等[32]还发现，三环唑处理玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)后，附着胞的膨压和穿透率下降，导致致病菌致病力下降。另外，Kong等[33]研究发现，使用3 mg/L三环唑处理刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)后其孢子萌发受到了抑制。遗传学实验还表明，在玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中，St4hnr与St3hnr缺失会降低附着胞的穿透率，从而影响病原菌的穿透能力[27]；在新月弯孢霉(Curvularia lunata)中3hnr基因缺失会导致其致病性降低[34]。然而在核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)中3hnr基因缺失会导致菌丝生长缓慢、生物量减少、菌丝发育受损及对紫外线的抗性降低等现象，但对病原菌的致病性无影响[35]。上述实验表明，hnr可通过调节真菌病原物黑色素的合成而调节其侵染和致病过程，但对在不同病原物中的调控作用存在差异。本实验发现，在疏水诱导A. alternata侵染结构分化过程中，Aa4hnr与Aa3hnr的表达存在显著差异，我们初步分析，一方面因其催化的反应不同，3hnr参与黑色素合成的两步脱氢反应，4hnr只参与第一步脱氢反应；另外，在玉米大斑病菌中发现，3hnr与4hnr在功能上有互相补充的作用，发现4hnr基因缺失后3hnr基因表达量与野生型相近，表明3hnr起主要的作用[25]，这与我们的研究结果基本一致，但是关于HNR调控侵染结构分化的分子机制及Aa4hnr和Aa3hnr在外界刺激后的时空表达特性，尚需进一步从分子水平揭示。
4 结论从梨果黑斑病菌中克隆得到了2个羟基萘还原酶基因Aa4hnr和Aa3hnr，其基因全长分别为1 266 bp和1 356 bp，编码的氨基酸分别为268个和267个；其编码的蛋白均含有NAD(P)结合域，属于SDR家族。羟基萘还原酶专一性抑制剂三环唑处理抑制了A. alternata的生长发育、黑色素合成及侵染结构的形成；同时还发现Aa4hnr和Aa3hnr参与了疏水界面诱导下A. alternata侵染结构的分化过程，但其分子调控机制尚需进一步揭示。
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