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文章信息
- 李荣, 徐文怡, 李永才, 毕阳, 张苗, 蒋倩倩, 刘勇翔
- LI Rong, XU Wenyi, LI Yongcai, BI Yang, ZHANG Miao, JIANG Qianqian, LIU Yongxiang
- 梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控
- Cloning of hnr and characterization of its regulatory role in the infection structure differentiation of Alternaria alternata
- 微生物学通报, 2022, 49(7): 2550-2562
- Microbiology China, 2022, 49(7): 2550-2562
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.211047
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文章历史
- 收稿日期: 2021-11-09
- 接受日期: 2021-12-06
- 网络首发日期: 2022-01-25
早酥梨(Pyrus bretchneideri ‘Zaosu’)是中国西北地区主要种植的梨品种,具有果大核小、果皮翠绿、质地酥脆、汁多味甜等特点,备受消费者的青睐[1]。然而早酥梨采后贮藏期间品质劣变和腐烂比较严重,容易造成严重的经济损失,其中由互隔交链孢(Alternaria alternata)引起的黑斑病为主要的采后病害[2]。A. alternata是一种常见的潜伏侵染真菌,广泛地存在于土壤、各种植物和腐烂的植物残骸中,可以侵染多种水果和蔬菜而引起黑斑病。A. alternata菌丝和孢子细胞壁中均可以产生黑色素,黑色素赋予病原真菌对紫外线等外源胁迫的抗性[3-4],但其在病原中的调控机制尚需进一步揭示。
黑色素是一种普遍存在于生物体的酚类聚合物疏水色素,主要分为1, 8-间苯二酚(1, 8-dihydroxynaphthalene,DHN)和3, 4-二羟基苯丙氨酸(3, 4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)两种[5]。子囊菌亚门和半知菌真菌如链格孢菌、灰霉菌、稻瘟病菌、玉米小斑病菌、炭疽菌、玉米大斑病菌、罗伯茨绿僵菌和大丽轮枝菌等均能合成DHN黑色素[6]。植物病原真菌DHN黑色素底物为醋酸盐,首先由聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)聚合后形成四羟萘(1, 3, 6, 8-tetrahydroxynaphthalene,4HN),然后通过四羟基萘还原酶(1, 3, 6, 8- tetrahydroxynaphthalene reductase,4HNR)的脱氢反应生成小柱孢酮(scytalone),小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)继而脱水形成了三羟萘(1, 3, 8-trihydroxynaphthalene,3HN),再由三羟基萘还原酶(1, 3, 8-trihydroxynaphthalene reductase,3HNR)脱氢形成柱孢醌(vermelone,VER),小柱孢酮脱水酶再次脱水形成二羟萘(1, 8-dihydroxynaphthalene,1, 8-DHN),最后经过氧化反应聚合形成DHN黑色素[7-10]。已有研究发现,DHN黑色素可以有效清除羟自由基、活性氧自由基和DPPH,也可以使生物体免受辐射伤害[11]。同时,作为病原真菌产生的一种次级代谢产物,黑色素既可以增强病原菌抗逆能力,也与其致病性有关[12]。
hnr基因参与了DHN黑色素生物合成途径中两步重要的还原脱氢反应,有研究表明,HNR属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/ reductase,SDR)超家族,含有保守的辅酶结合位点与催化位点[13],三环唑通过抑制HNR的活性成为DHN黑色素合成的特异性抑制剂之一。研究发现,在稻瘟病菌和烟曲霉中3hnr可以参与两步脱氢反应,但主要参与第二步脱氢反应,4hnr只参与第一步脱氢反应;同时发现3hnr与4hnr均与致病力密切相关,还会降低附着胞的数量,从而影响穿透能力[8, 14-15]。在胡麻叶斑病菌中的研究发现,4hnr基因突变体可以影响黑色素的合成并提高其应对紫外胁迫的能力[16]。在灰葡萄孢中的研究发现,4hnr基因突变体不影响菌丝的生长,但在培养后期会使菌核及分生孢子的颜色变为浅褐色,同时该基因对致病力也无影响[17]。在番茄互隔交链孢中的研究发现,3hnr基因突变体会影响分生孢子的大小、形状及颜色,降低抵抗紫外胁迫的能力[18]。在瓜类炭疽病菌中的研究发现,3hnr基因突变体会影响致病力[19]。综上所述,HNR在真菌病原生长发育及致病性的调控方面具有多样性。
植物病原真菌首先通过孢子黏附在寄主表面,感知并识别表皮物化信号后,通过信号级联反应将信号传递下去,从而激活侵染或致病相关基因的表达,进而启动侵染过程。细胞信号传导通路包括MAPK级联信号通路、cAMP-PKA信号途径、Ca2+信号传导和G蛋白耦联信号通路等。本实验室前期研究发现,梨果黑斑病菌A. alternata中MAPK信号级联途径[20]、cAMP-PKA[21]和Ca2+信号传导途径[22]均参与了A. alternata响应果实表皮信号物质,进而启动侵染结构分化的过程,同时在实验中还发现信号途径相关基因进行敲除后,A. alternata黑色素含量均产生了变化。为了阐明黑色素在A. alternata侵染结构形成过程中的调控作用,本研究对梨果黑斑病菌A. alternata hnr基因进行克隆和生物信息学分析,同时使用黑色素合成途径中HNR特异性抑制剂三环唑进行药理学实验,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行测定,以期为进一步揭示DHN黑色素对A. alternata侵染结构分化调控的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株A. alternata JT-03菌株分离于早酥梨的病斑部位,本实验室保存,于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28 ℃培养。
1.1.2 供试试剂克隆载体pClone007 Versatile Simple Vector Kit、DNA Marker和大肠杆菌DH5α感受态购于北京擎科生物科技有限公司;胶回收试剂盒及TRIzol试剂均购自北京天根生化科技有限公司;cDNA反转录试剂盒购于TaKaRa公司。
1.2 方法 1.2.1 获取Aa4hnr和Aa3hnr基因序列使用NCBI数据库查找得到A. alternata (ID登录号为SRC11rK2f)中Aa4hnr基因(基因登录号为29116424)与Aa3hnr基因(基因登录号为29117620)。
1.2.2 提取RNA及反转录cDNA样品总RNA的提取使用TRIzol试剂进行,经过反转录后获得cDNA,具体步骤参照试剂说明书。
1.2.3 克隆Aa4hnr和Aa3hnr基因编码区(coding sequence,CDS)根据已测序的A. alternata (taxon:5599,SRC11rK2f)基因组序列,使用软件DNAMAN 6.0分别设计4hnr和3hnr的扩增引物(表 1),使用A. alternata JT-03的cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL):2×Phanta Max Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,F/R引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR反应条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 kb/min,33个循环;72 ℃ 5 min。PCR反应结束后,通过凝胶检测后进行胶回收,将胶回收产物与pClone007 Versatile Simple Vector Kit载体连接后进行测序。
基因 Gene |
序列 Sequence (5′→3′) |
长度 Length (bp) |
Aa4hnr | F: ATGGTCATCAACGTGCCCA | 1 266 |
R: TTACTGCGACGAGCCACCAG | ||
Aa3hnr | F: ATGGCATCAATCGAGCAGAC | 1 356 |
R: TTACATGCAAGCAGCGCC |
使用NCBI数据库中BLAST在线分析工具,对氨基酸序列的同源性进行分析,并下载其他真菌中4hnr和3hnr编码蛋白的氨基酸序列,利用MEGA 7.0软件使用邻近法构建系统发育树,bootstrap值设定为1 000;通过在线分析工具gene structure display server (GSDS)分析基因的结构;利用ORF Finder预测DNA序列开放阅读框(open reading frame,ORF);采用SOPMA预测蛋白二级结构;通过conserved domain search软件分析Aa4hnr和Aa3hnr基因保守结构域,相关预测网址汇总见表 2。
Online software | Internet site | Use |
GSDS 2.0 | http://gsds.cbi.pku.edu.cn/chinese.php?input=se | 基因结构 Genestructure |
ORF Finder | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder | 开放阅读框 Open reading frame |
SOPMA | http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html | 蛋白二级结构 Protein secondary structure |
Conserved domain search | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ | 保守结构域 Conserved domain |
参照高春丽等[23]配制孢子悬浮液的方法并稍做修改,在无菌操作台中,将10 mL无菌水加入培养了5 d的A. alternata JT-03中,使用无菌涂布器轻轻刮取培养基表面,用四层无菌纱布过滤除去菌丝后收集至50 mL无菌离心管中。振荡均匀后,吸取20 μL孢子悬液滴加在血球计数板上,放置于光学显微镜下进行镜检计数,最终配制浓度为1×105 spores/mL。
1.2.6 三环唑处理对A. alternata菌落形态的影响菌落形态观察参照刁春英等[24]的方法并做修改。经过前期的浓度筛选工作,称取3 mg三环唑溶解于100 μL DMSO,经无菌0.22 μm有机膜过滤除菌后,加入100 mL已灭菌的PDA培养基,使得最终浓度为30 μg/mL。经过混合均匀后倒入直径为7 cm的培养皿。等培养基凝固后接种培养了6 d后的A. alternata JT-03孢子悬浮液2 μL,然后在28 ℃的条件下恒温培养,每天拍照记录菌落形态、测量菌落直径,添加等量的DMSO作为对照处理。每个处理3个平行,重复3次。
1.2.7 三环唑处理对黑色素含量的影响参照张苗[21]的方法进行黑色素的提取、纯化与测定。
1.2.8 三环唑处理对A. alternata侵染结构形成的影响将浓度为1×105 spores/mL的A. alternata孢子悬浮液(1 mL)以5 000 r/min离心5 min,弃上清液,向沉淀物中加入1 mL终浓度为30 μg/mL的三环唑溶液。吸取20 μL孢子悬液滴加到置于载玻片上方的疏水膜,并将其放置于铺有潮湿滤纸的玻璃培养皿,在28 ℃培养条件下分别于2、4、6、8 h使用染色液乳酸酚棉兰染色后,通过光学显微镜计数计算孢子萌发率及附着胞形成率。每个处理3个平行,每次计数100个分生孢子。
1.2.9 三环唑处理对A. alternata致病性的影响挑选大小均一、无机械伤的早酥梨,使用0.1%次氯酸钠水溶液浸泡2 min消毒,再次用清水进行冲洗,置于室温条件下晾干。用75%乙醇沿梨果实赤道部位擦拭后,使用接种钉(直径为3 mm,深3 mm)沿赤道部位均匀打3个孔,每孔内接20 μL浓度为30 μg/mL三环唑处理的A. alternate JT-03孢子悬浮液,室温放置2 h,装入干净的保鲜盒进行贮藏。接种后从第3天开始每间隔3 d测量果实表面的病斑直径,拍照记录果实病斑扩展情况。每个处理使用9个果实测定,重复3次。
1.2.10 Aa4hnr和Aa3hnr基因在A. alternata侵染结构分化中的表达分析将浓度为1×106 spores/mL的A. alternata孢子悬浮液振荡后滴加在疏水膜上,分别在28 ℃培养2、6、8 h后取样。提取样品RNA,具体操作步骤参照1.2.2进行。根据Aa4hnr和Aa3hnr基因序列,使用Premier 5设计实时荧光定量引物,见表 3。使用RT-qPCR技术分析Aa4hnr和Aa3hnr基因在侵染结构不同分化时期的表达量变化情况。反应条件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s,40个循环。反应体系(20 μL):Master Mix 10 μL,引物F/R (10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 8 μL。各基因转录水平分别用内参基因GAPDH调平,每个样品3个平行,结果均以2 h基因表达量为对照,数据采用2−ΔΔCT公式进行分析。
基因Gene | 序列Sequence (5′→3′) |
Aa4hnr | F: CATTTGAAACGGGACTGC |
R: TCCGAAGAAACGAACACC | |
Aa3hnr | F: CGACATCTGCTGCTCAAACTC |
R: CCTCTTGTACGCCGCCTTA |
实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示,作图软件使用Origin 8.0;数据方差分析软件使用SPSS 20.0,差异分析使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和邓肯氏(Duncan’s)多重比较,在P=0.05水平上进行差异显著检测。
2 结果与分析 2.1 Aa4hnr和Aa3hnr基因的克隆从梨果黑斑病菌A. alternata中提取总RNA,进行反转录生成cDNA,使用引物对Aa4hnr-F/R、Aa3hnr-F/R进行目的基因的扩增,产物的凝胶电泳鉴定结果如图 1所示,对PCR扩增产物进行胶回收测序,比对后得到长度分别为807、804 bp的Aa4hnr、Aa3hnr基因的cDNA序列,它们分别编码268、267个氨基酸。
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图 1 Aa4hnr和Aa3hnr基因扩增电泳图 Figure 1 Amplification electrophoretogram of Aa4hnr and Aa3hnr genes. M: DL2000 DNA Marker. |
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将Aa4hnr和Aa3hnr基因通过软件DNAMAN翻译成氨基酸序列,利用NCBI数据库下载其他真菌的4hnr和3hnr基因序列,通过邻近法进行系统发育树的构建。由图 2可知,Aa4hnr与Ophiobolus disseminans的4hnr基因具有较高的一致性,位于同一个分支,亲缘关系较近,Aa3hnr与Alternaria arborescens的3hnr基因具有较高的相似性,位于同一个分支,亲缘关系较近,但是这2个基因不属于同一个还原酶基因类群。
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图 2 Aa3HNR和Aa4HNR与其他真菌HNR同源蛋白的系统发育分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of Aa3HNR and Aa4HNR and other fungal HNR homologous proteins. 括号中为不同真菌HNR蛋白登录号;距离标尺表示为单位长度置信值;分支节点上的数字为bootstrap自展值 The accession numbers of different fungal HNR protein are in parentheses; At the branch nodes are 1 000 bootstrap replicates represented as percentage values; The distance scale is expressed as the confidence value of unit length. |
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使用在线软件GSDS 2.0分析测序结果可知,Aa4hnr基因全序列长度为1 266 bp,CDS长度为1 266 bp,编码268个氨基酸,不含有内含子。使用ORF Finder软件分析Aa4hnr基因开放阅读框,发现共有9个ORF。Aa3hnr基因全序列长度为1 356 bp,CDS长度为1 256 bp,编码了267个氨基酸,含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子,有17个开放阅读框。
2.2.3 Aa4hnr和Aa3hnr基因编码产物的二级结构分析采用在线软件SOPMA对Aa4hnr (图 3A)和Aa3hnr (图 3B)基因编码产物的二级结构进行预测,编码产物由蓝、红、绿和紫代表的元件组成。Aa4hnr基因编码产物含有40.3% α螺旋(alpha helix)、32.84%无规则卷曲(random coil)、18.66%延伸链(extended strand)和8.21% β转角(beta turn)。Aa3hnr基因编码产物含有41.95% α螺旋、31.09%无规则卷曲、18.35%延伸链和8.61% β转角。Aa4hnr和Aa3hnr编码产物主要的二级结构元件均为α螺旋与无规则卷曲。
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图 3 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)编码蛋白的二级结构分析 Figure 3 Secondary structure analysis of Aa4hnr A) and Aa3hnr (B) gene coding protein. 蓝色:α螺旋;紫色:无规则卷曲;绿色:β转角;红色:延伸链 Blue: Alpha helix; Purple: Random coil; Green: Beta turn; Red: Extended strand. |
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通过conserved domain search软件分析可知,Aa4hnr (图 4A)和Aa3hnr (图 4B)所编码的蛋白均含有NAD(P)结合域,这个结构域保守性很强,存在于如糖酵解和许多其他氧化还原酶的代谢途径中。此外,2个还原酶均属于SDR家族。
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图 4 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)基因保守结构域 Figure 4 Conserved domain of Aa4hnr (A) and Aa3hnr (B) genes. |
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由图 5A可知,30 μg/mL三环唑处理后A. alternata菌落的颜色产生了明显的变化,从墨绿色变为红褐色,同时黑色素的合成也显著被抑制(图 5B),处理组黑色素的含量仅为对照组的66.5%,且三环唑处理对A. alternata菌丝扩展具有抑制作用(图 5C)。
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图 5 三环唑处理对A. alternata菌落形态(A)、黑色素含量(B)和菌丝生长(C)的影响 Figure 5 The effect of tricyclazole treatment on morphology (A), melanin content (B) and mycelium growth (C) of A. alternata. *: P < 0.05. The same below. |
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由图 6可知,虽然随着培养时间的延长A. alternata的孢子萌发,附着胞形成率均呈现上升趋势,但三环唑处理明显抑制了A. alternata分生孢子在疏水表面的萌发率(图 6A)与附着胞的形成率(图 6B)。在培养2 h时,处理组的孢子萌发率仅为对照组的57.5%;而在培养4 h时,处理组的附着胞形成率仅为对照组的34.3%。
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图 6 三环唑处理对A. alternata在疏水表面上孢子萌发率(A)和附着胞形成率(B)的影响 Figure 6 The effect of tricyclazole treatment on spore germination (A) and appressorium formation (B) of A. alternata on hydrophilic surface. |
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三环唑处理显著抑制了损伤接种A. alternata的早酥梨黑斑病的扩展(图 7)。虽然随着贮藏时间的延长果实病斑直径逐渐增加,但三环唑处理的病斑直径显著小于对照组(P < 0.05),在第6天时,处理组的病斑直径仅为对照组的73.5% (图 7B)。
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图 7 三环唑处理对果实的病害扩展(A)和病斑直径(B)的影响 Figure 7 The effect of tricyclazole treatment on lesion morphology (A) and lesion diameter (B) of the fruit. |
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为了解hnr基因在A. alternata侵染结构不同分化阶段的表达情况,提取A. alternata总RNA,通过RT-qPCR分析在疏水诱导A. alternata侵染结构分化过程中的基因表达情况,结果表明,Aa4hnr和Aa3hnr在A. alternata侵染结构分化的不同阶段表达存在差异。Aa4hnr基因在A. alternata侵染结构分化的各个时期表达量均发生下调(图 8A),Aa3hnr基因的表达量在附着胞形成阶段(6 h)下调,而在侵染菌丝形成阶段(8 h)显著上调表达(图 8B)。
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图 8 Aa4hnr (A)和Aa3hnr (B)在疏水诱导A. alternata侵染结构分化中的表达水平 Figure 8 Relative expression analysis of Aa4hnr (A) and Aa3hnr (B) in A. alternata under hydrophilic surface. 不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05). |
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本研究从梨果黑斑病菌中克隆得到了羟基萘还原酶基因Aa4hnr和Aa3hnr,序列分析表明它们都属于SDR家族,两者有共同的保守结构域,但通过DNAMAN软件对编码产物的氨基酸序列进行对比发现,A. alternata中这2个基因的氨基酸序列相似性仅为45.9%,同样地,在稻瘟病菌[8]、玉米大斑病菌[25]和里氏木霉[26]中这2个基因编码的蛋白质序列的相似性也分别仅为46%、45.9%和44%,表明4HNR和3HNR这2个酶分别属于不同的还原酶类群。郭欣欣[27]在玉米大斑病菌证实了St4HNR和St3HNR分别属于不同的还原酶类群,可见其蛋白序列及结构差异可能是导致其功能差异的原因。
羟基萘还原酶专一性抑制剂三环唑处理显著抑制了A. alternata黑色素的合成(图 5B),同样有研究发现,三环唑处理对深色有隔内生真菌(dark septate endophytic species)[28]、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)[29]、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)[30]和桑椹菌核病菌(Scleromitrula shiraiana)[13]的黑色素生物合成均有抑制作用,进一步证实了羟基萘还原酶是DHN黑色素合成途径中的关键作用酶。同时本研究还发现,三环唑处理显著抑制了疏水性诱导的A. alternata孢子萌发和附着胞形成(图 6),在球毛壳菌(Chaetomium globosum)[31]研究中发现,使用三环唑处理后降低了产孢量与孢子的萌发率。何玉莲等[32]还发现,三环唑处理玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)后,附着胞的膨压和穿透率下降,导致致病菌致病力下降。另外,Kong等[33]研究发现,使用3 mg/L三环唑处理刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)后其孢子萌发受到了抑制。遗传学实验还表明,在玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中,St4hnr与St3hnr缺失会降低附着胞的穿透率,从而影响病原菌的穿透能力[27];在新月弯孢霉(Curvularia lunata)中3hnr基因缺失会导致其致病性降低[34]。然而在核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)中3hnr基因缺失会导致菌丝生长缓慢、生物量减少、菌丝发育受损及对紫外线的抗性降低等现象,但对病原菌的致病性无影响[35]。上述实验表明,hnr可通过调节真菌病原物黑色素的合成而调节其侵染和致病过程,但对在不同病原物中的调控作用存在差异。本实验发现,在疏水诱导A. alternata侵染结构分化过程中,Aa4hnr与Aa3hnr的表达存在显著差异,我们初步分析,一方面因其催化的反应不同,3hnr参与黑色素合成的两步脱氢反应,4hnr只参与第一步脱氢反应;另外,在玉米大斑病菌中发现,3hnr与4hnr在功能上有互相补充的作用,发现4hnr基因缺失后3hnr基因表达量与野生型相近,表明3hnr起主要的作用[25],这与我们的研究结果基本一致,但是关于HNR调控侵染结构分化的分子机制及Aa4hnr和Aa3hnr在外界刺激后的时空表达特性,尚需进一步从分子水平揭示。
4 结论从梨果黑斑病菌中克隆得到了2个羟基萘还原酶基因Aa4hnr和Aa3hnr,其基因全长分别为1 266 bp和1 356 bp,编码的氨基酸分别为268个和267个;其编码的蛋白均含有NAD(P)结合域,属于SDR家族。羟基萘还原酶专一性抑制剂三环唑处理抑制了A. alternata的生长发育、黑色素合成及侵染结构的形成;同时还发现Aa4hnr和Aa3hnr参与了疏水界面诱导下A. alternata侵染结构的分化过程,但其分子调控机制尚需进一步揭示。
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